病原性球菌的檢驗

1、病原性球菌的檢驗一、葡萄球菌屬 Staphylococcus廣泛存在于自然界，多數(shù)是不致病的腐物寄生菌。 致病性葡萄球菌可引起化膿性炎癥、敗血癥、食物中毒等。分類與分型1）金黃色葡萄球菌(S. aureus)：多數(shù)致病。（2）表皮葡萄球菌(S. epidermidis)：偶可致病。（3）腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)：不致病。（4）致病性菌株能產(chǎn)生黃色或檸檬色素。（5）多數(shù)金黃色葡萄球菌可被相應(yīng)噬菌體裂解，表皮葡萄球菌不敏感。金黃色葡萄球菌的致病性用噬菌體可將金葡萄菌分為4群23個型。腸毒素型食物中毒由和群金葡萄菌引起，群菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性的速度比和群緩慢很多。造成醫(yī)院感染

2、嚴(yán)重流行的是群中的52、52A、80和81型菌株。引起皰疹性和剝脫性皮炎的菌株經(jīng)常是群71型。 金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)作為人和動物的常見病原菌，其主要存在于人和動物的鼻腔、咽喉、頭發(fā)上，50%以上健康人的皮膚上都有金黃色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的機(jī)會很多。金黃色葡萄球菌及其檢驗 革蘭氏陽性球狀，排列呈葡萄串狀。無芽胞、鞭毛，大多數(shù)無莢膜，個別形成莢膜。致病性葡萄球菌（金黃色葡萄球菌）菌體較小、約0.51um., 普通0.41.2um。培養(yǎng)及生化特性1.在普通培養(yǎng)基上生長良好（需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37、pH7.4 ，對營養(yǎng)要求不高，加少量葡萄糖或血液生長更旺盛。 ），在麥康凱瓊

3、脂平板不生長。2. 血平板上生長更佳，致病菌株溶血 3. 產(chǎn)生金黃色色素 4. 高度耐鹽: 可在7.515%NaCl肉湯中生長。 5. 分解葡、乳、麥、蔗糖， 產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，觸酶陽性，致病菌株能分解甘露醇。6. 金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生的毒素和酶 （致病因素P149）1）溶血毒素 2）殺白細(xì)胞素3）血漿凝固酶：區(qū)分葡萄球菌是否具有致病性的重要標(biāo)志。 4）脫氧核糖核酸酶： 5）腸毒素 6）溶纖維蛋白酶 7）透明質(zhì)酸酶抗原性1. 多糖抗原：具有群特異性，存在于細(xì)胞壁，借此可分群。A群多糖抗原化學(xué)組成為磷壁酸中的N-乙酰葡糖胺核糖醇?xì)埢ń瘘S色葡萄球菌）。B群多糖抗原化學(xué)組成是磷壁酸中的N-乙酰葡糖胺甘油

4、殘基。2. 蛋白質(zhì)抗原：細(xì)胞壁的一種表面蛋白，人源菌株含SPA（Staphylococcus protein A)，能與多種哺乳動物IgG Fc片段非特異性結(jié)合。Ag-Ab(IgG)-SPA 有利于多種微生物抗原檢出。3. 莢膜抗原：幾乎所有金黃色葡萄球菌菌株的表面均有莢膜多糖抗原的存在。僅個別表皮葡萄球菌有此抗原，抗吞噬作用。磷壁酸：以磷酸多元醇分子的重復(fù)結(jié)構(gòu)單位為主鏈（骨架）的陰離子多聚物。磷壁酸按磷酸多元醇分子的不同分為5種類型，其中以磷酸甘油和磷酸核糖醇兩大類最常見。抵抗力抵抗力較強(qiáng)，能在干燥膿汁或血液中存活數(shù)月，80 30min可殺死，煮沸迅速死亡，對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性。臨床上用1

5、%-3%的龍膽紫溶液治療，以防止葡萄球菌引起的化膿癥。 致病性和毒力因子1. 致病性：可引起兩類疾病侵襲性疾?。褐饕鸹撔匝装Y。通過各種途徑侵入機(jī)體，導(dǎo)致皮膚或器官的多種感染，甚至敗血癥。 中毒性疾病：由葡萄球菌產(chǎn)生的外毒素引起。人源多為毒素，動物源則為毒素。2.毒力因子: 包括毒素和酶(1)毒素(Alphatoxin) 損傷細(xì)胞膜的毒素，對多種哺乳動物紅細(xì)胞有溶血作用，對白細(xì)胞、血小板、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等均有損傷作用(2)腸毒素(enterotoxin) 按抗原性不同，分為A、B、C1、C2、C3、D和E 7個血清型，均可引起急性胃腸炎，即嘔吐為主要癥狀的食物中毒。腸毒

6、素形成條件：存放溫度：在37內(nèi)，溫度越高，產(chǎn)毒時間越短；存放地點：通風(fēng)不良氧分壓低易形成腸毒素；食物種類：含蛋白質(zhì)豐富，水分多，同時含一定量淀粉的食物，腸毒素易生成。(3)凝固酶能使含有抗凝劑的人或兔血漿發(fā)生凝集的酶類物質(zhì)。致病性菌株多數(shù)為凝固酶陽性。 游離凝固酶(free coagulase): 使液態(tài)纖維蛋白原變成固態(tài)纖維蛋白。 結(jié)合凝固酶(bound coagulase): 使纖維蛋白原與菌體交聯(lián)而致細(xì)菌凝聚。作用：有助于致病菌株抵抗吞噬細(xì)胞和殺菌物質(zhì)。(4)耐熱DNA酶:100，15min不失去活性，由致病性菌株產(chǎn)生。（5）其它致病因子：溶纖維蛋白酶、纖維蛋白溶酶、透明質(zhì)酸酶，殺白細(xì)胞

7、素、磷酸酶、卵磷脂酶和脂酶等，利于細(xì)菌擴(kuò)散。微生物學(xué)診斷標(biāo)本的采集： 化膿性病灶采取膿汁、滲出液； 敗血癥采取血液；腦膜炎采取腦脊液；食物中毒則分別采集剩余的食物、嘔吐物和糞便。直接涂片檢查： 注意濃汁、乳汁、液體培養(yǎng)的染色片中常見雙球或短鏈排列的球菌，易誤認(rèn)為是鏈球菌。分離培養(yǎng) ： 普通平板培養(yǎng)、血液瓊脂平板、高鹽培養(yǎng)基。鑒定：純培養(yǎng)物菌落金黃色，周圍呈溶血現(xiàn)象。 1 致病性葡萄球菌的鑒定： （1）產(chǎn)生凝固酶和耐熱DNA酶（2）產(chǎn)生金黃色色素，有溶血性 （3）發(fā)酵甘露醇 2 葡萄球菌腸毒素的檢查： 細(xì)菌分離鑒定的同時，接種至肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)后取濾液注射至6-8周齡的幼貓。ELISA法檢測微量

8、腸毒素，PCR或DNA雜交檢測產(chǎn)毒素菌株金黃色葡萄球菌的檢驗方法：增菌培養(yǎng)法、直接計算法1、增菌培養(yǎng)法的檢驗步驟（程序） 檢樣稀釋7.5%NaCl 肉湯增菌培養(yǎng) 血平板、B-P分離鏡檢、 血漿凝固酶試驗報告結(jié)果 2、檢驗操作要點 1）增菌：7.5%NaCl肉湯，3724h，呈均勻渾濁生長。2）平板分離：血平板,37 2448h菌落成金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有透明溶血圈（型） B-P平板： 主要成分及作用：氯化鋰、甘氨酸：抑制非致病性葡萄球菌的生長；丙酮酸鈉:：促進(jìn)葡萄球菌生長亞碲酸鉀： 抑制G-桿菌生長，可被金黃色葡萄球菌還原為碲鹽呈黑色卵黃:：含蛋白質(zhì)、卵磷、脂肪。在B

9、-P平板上的菌落特征: 為圓形，光滑凸起、濕潤、2-3mm，呈灰色至黑色，邊緣色淡周圍為渾濁帶，在其外層有一透明帶。 3）鏡檢與血漿凝固酶試驗從B-P平板上挑取金黃色葡萄球菌的菌落進(jìn)行鏡檢如發(fā)現(xiàn)葡萄球菌,再做血漿凝固酶試驗做血漿凝固酶試驗4）結(jié)果報告方式：（1）初步報告：根據(jù)血平板培養(yǎng)計數(shù)和鏡檢，如發(fā)現(xiàn)有G+葡萄串狀球菌存在，且有溶血性，則初步報告為：“有金黃色葡萄球菌存在，1g樣品約含多少。” （2）結(jié)果報告：根據(jù)培養(yǎng)特性、鏡檢、生化試驗、動物試驗結(jié)果，可報告為：“是否是致病性葡萄球菌” .二、鏈球菌屬 Streptococcus鏈球菌(Streptococcus)是化膿性球菌的另一類常見的

10、細(xì)菌，廣泛存在于自然界和人及動物糞便和健康人鼻咽部，引起各種化膿性炎癥、猩紅熱、丹毒、敗血癥、腦膜炎、產(chǎn)褥熱以及鏈球菌變態(tài)反應(yīng)性疾病等。 （一）生物學(xué)性狀 1、形態(tài)與染色 革蘭氏陽性；球形或卵圓形，直徑0.61.0m。鏈狀排列，短者4-8個細(xì)菌，長者有2030個細(xì)菌。菌鏈的長短與菌種及生長環(huán)境有關(guān): （1）致病菌株較長，非致病菌株較短； （2）固體培養(yǎng)基多為短鏈，液體培養(yǎng)基常為長鏈； （3）病料多呈長鏈，但敗血癥豬體分離的多為成雙或短鏈。A、B、C、D群中，多數(shù)菌株在血液或血清培養(yǎng)基上的幼齡培養(yǎng)菌或病料中的菌體常見莢膜。除D群一些菌株外，無芽胞, 無鞭毛。2、培養(yǎng)特性 需氧或兼性厭氧，有些為厭

11、氧菌。營養(yǎng)要求較高。普通培養(yǎng)基中需加有血液、血清、葡萄糖等才能生長。最適溫度37，最適pH7.4-7.6，血瓊脂平板上形成細(xì)小露滴狀、灰白色、圓而微凸、表面光滑、邊緣整齊的菌落； 不同菌株有不同溶血現(xiàn)象：馬腺疫鏈球菌明顯溶血、化膿鏈球菌和獸疫鏈球菌強(qiáng)溶血、無乳鏈球菌弱或溶血、乳房炎鏈球菌或溶血、停乳鏈球菌和肺炎鏈球菌溶血。 血清肉湯培養(yǎng)后，有粘稠或絮狀沉淀，上液清朗。3、生化反應(yīng)發(fā)酵簡單的糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。對乳糖、甘露醇、水楊苷等的分解因菌株而異。一般不分解菊糖，不被膽鹽或1%去氧膽酸鈉所溶解。這兩種特性可用來鑒別甲型溶血性鏈球菌和肺炎球菌。能使牛奶產(chǎn)酸而不凝固，不液化明膠。乙型（ -）溶血鏈

12、球菌對桿菌肽敏感。4、抗原結(jié)構(gòu) 主要有三種：（1）核蛋白抗原：或稱P抗原，無特異性，各種鏈球菌均同，與葡萄球菌有交叉。 （2）多糖抗原：或稱C抗原、系統(tǒng)族特異性抗原，是細(xì)菌壁的組成成份。（3）蛋白質(zhì)抗原：或稱表面抗原，包括抗M、R、T、S等四種不同性質(zhì)的抗原組份，具有型特異性。是鏈球菌細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)抗原，位于C抗原外層，同族鏈球菌可根據(jù)表面抗原不同進(jìn)行分型，如A族鏈球菌可據(jù)此分為60多型。 蘭氏分群法：蘭氏（Lancefield)用溫?zé)岬南←}酸浸出C抗原，與特異性血清作沉淀反應(yīng)，將鏈球菌分為20個血清群（A-V，缺I和J）。同群鏈球菌間，因表面蛋白質(zhì)抗原不同，又分不同型。5、致病性鏈球菌可產(chǎn)生

13、的毒素和酶（致病因素）1）溶血素 2）致熱外毒素 3）透明質(zhì)酸酶4）鏈激酶 5）鏈道酶 6）殺白細(xì)胞素（二）分類1、根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)分 根據(jù)鏈球菌細(xì)胞壁中多糖抗原的不同，將鏈球菌分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V （即A-H，K-V）等20個血清群，該分類方法稱為Lancefield分類法。 2、根據(jù)溶血現(xiàn)象分類 甲（）型溶血性鏈球菌 菌落周圍有不透明溶血環(huán)。多為條件性致病菌。 乙（）型溶血性鏈球菌 菌落周圍形成完全透明的無色的溶血環(huán)，致病力強(qiáng)。 丙（）型鏈球菌不產(chǎn)生溶血素，菌落周圍無溶血環(huán)，也稱為不溶血性鏈球菌。無致病性，常存在于乳類和糞便中，偶爾

14、引起感染。 （三）抵抗力60、30min可殺死大部分鏈球菌，對一般消毒劑敏感，在干燥塵埃中可存活數(shù)日，對青霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素等均敏感，耐藥性低。 （四）致病性與毒力因子致病因子：可產(chǎn)生多種酶和外毒素。 （1）M蛋白：是鏈球菌細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)，具有抗吞噬作用。純化的M蛋白能使纖維蛋白原沉淀，凝集血小板，白細(xì)胞，溶解多形核細(xì)胞，并抑制毛細(xì)血管中細(xì)胞的移動。M蛋白有抗原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生型特異性抗體，并與過敏反應(yīng)有關(guān)。 （2）脂磷壁酸（LTA）：與細(xì)菌粘附于宿主細(xì)胞表面有關(guān)，多數(shù)LAT位于細(xì)胞膜和肽聚糖之間，通過肽聚糖孔伸展至細(xì)菌細(xì)胞表面，人類口腔粘膜和皮膚上皮細(xì)胞、血細(xì)胞等細(xì)胞膜上均有L

15、AT的結(jié)合位點。 （3）透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidaes）：能分解細(xì)胞間質(zhì)的透明質(zhì)酸，使病菌易于在組織中擴(kuò)散。又稱為擴(kuò)散因子。 （4）鏈激酶(Streptokinase，SK)：又稱鏈球菌溶纖維蛋白酶(Streptococcal fibrinolysin)，是一種激酶，能激活血液中的血漿蛋白酶原，成為血漿蛋白酶，可溶解血塊或阻止血漿凝固，有利于細(xì)菌在組織中的擴(kuò)散。耐熱，100 50min加熱仍保持活性。鏈激酶抗體能中和該酶的活性。 （5）鏈道酶（Streptodonase）：又名脫氧核糖核酸酶(Streptococcal deoxyribonuclease)。主要由A、C、G群鏈球菌產(chǎn)生

16、。此酶能分解粘稠膿液中具有高度粘性的DNA，使膿汁稀薄易于擴(kuò)散。產(chǎn)生的相應(yīng)抗體有中和該酶的活性。用鏈道酶制劑進(jìn)行皮膚試驗可作為測定機(jī)體細(xì)胞免疫的一種方法。 （6）鏈球菌溶血素（Streptolysin）：溶解紅細(xì)胞，殺死白細(xì)胞及毒害心臟，主要有“O”和“S”兩種。 鏈球菌溶血素O（Streptolysin O，SLO）：為含-SH基的蛋白質(zhì)，對氧敏感，遇氧時一SH基即被氧化為-SS-基，暫時失去溶血能力。溶血素O能破壞白細(xì)胞和血小板。對動物心臟有急性毒害作用。 溶血素“S”（Streptolysin S，SLS）：是一種小分子的糖肽，無抗原性。對氧穩(wěn)定，對熱和酸敏感。血平板所見透明溶血由“S”

17、引起，能破壞白細(xì)胞和血小板，給動物靜注可迅速致死。注射小鼠腹腔，引起腎小管壞死。 (7)致熱外毒素（Pyrogenic extoxin）：曾稱紅疹毒素(Erythrotoxin)或猩紅熱毒素(Scarletfever toxin)是人類猩紅熱的主要致病物質(zhì)，為外毒素，使病人產(chǎn)生紅疹。 該毒素是蛋白質(zhì)，對熱穩(wěn)定，具有抗原性，產(chǎn)生的抗毒素能中和該毒素的活性?？煞譃锳、B、C三種不同抗原性的毒素，無交叉保護(hù)作用。(五) 流行病學(xué)（1）化膿性炎癥：由皮膚傷口侵入，引起皮膚及皮下組織化膿性炎，如癤癰、蜂窩組織炎、丹毒、乳房炎等。沿淋巴管擴(kuò)張，引起淋巴管炎，淋巴腺炎，敗血癥等，經(jīng)呼吸道侵入，常有急性扁桃腺

18、炎、咽峽炎，并蔓延周圍引起膿腫、中耳炎、乳突炎、氣管炎、肺炎等。（2）敗血癥：豬鏈球菌病的病原至少有三種：馬鏈球菌獸疫亞種、豬鏈球菌2型、豬鏈球菌1型。（3）猩紅熱：由產(chǎn)生致熱外毒素的A族鏈球菌所致的急性呼吸道傳染病，臨床特征為發(fā)熱、咽峽炎、全身彌漫性皮疹和疹退后的明顯脫屑。（4）變態(tài)反應(yīng) 風(fēng)濕熱：由A族鏈球菌的多種型別引起，臨床表現(xiàn)以關(guān)節(jié)炎、以肌炎為主。 急性腎小球腎炎：見于人類，大多數(shù)由A族12型鏈球菌引起。臨床表現(xiàn)為蛋白尿、浮腫和高血壓。 （5）其他疾病 :B族鏈球菌又稱無乳鏈球菌(Streptococus agalactiae)當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時，可引起皮膚感染、心內(nèi)膜炎、產(chǎn)后感染、新生兒敗血癥和新生兒腦膜炎。所致疾病小結(jié)（六）微生物學(xué)診斷標(biāo)本的采集：采集適當(dāng)?shù)臉?biāo)本滲出液、膿汁、乳腺炎 乳液、腦脊髓液、尿液和感染組織。 檢驗方法1、直接檢查：可直接涂片，革蘭氏染色鏡檢。2、分離培養(yǎng)：接種血平板，觀察菌落形態(tài)和溶血情況。3、細(xì)菌鑒定：菌落形態(tài)、溶血特性、細(xì)菌形態(tài)、生化特性。如定群、定型，則要作血清學(xué)試驗。4、血清學(xué)試驗 （1）可使用特異性血清，對所分離的鏈球菌進(jìn)行血清