高壓液相色譜HPLC培訓教程4

1、高壓液相色譜HPLC培訓教程(四) IIIHPLC系統(tǒng) HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫控制器等，現代HPLC儀還有微機控制系統(tǒng)，進行自動化儀器控制和數據處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。 最早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進行梯度洗脫，柱填料從單一品種發(fā)展至幾百種類型，檢測器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確

2、證物質結構的質譜檢測器。數據處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是最簡單的積分儀、計算機、工作站及網絡處理系統(tǒng)。 目前常見的HPLC儀生產廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。一、輸液泵1泵的構造和性能 輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質量和分析結果的可靠性。輸液泵應具備如下性能：流量穩(wěn)定，其RSD應0.5%，這對定性定量的準確性至關重要；流量范圍寬，分析型應在0.110 ml/min范圍內連續(xù)可調，制備型應能達到100 ml/min；輸出壓力高，一般應能達到1503

3、00kg/cm2；液缸容積??；密封性能好，耐腐蝕。 泵的種類很多，按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結構又可分為螺旋注射泵、柱塞往復泵和隔膜往復泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應用最多的是柱塞往復泵。 柱塞往復泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機轉速能方便地調節(jié)流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達400kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖性較大，現多采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現性較好（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.20.3%），但出故障的機

4、會較多（因多一單向閥），價格也較貴。2泵的使用和維護注意事項 為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須按照下列注意事項進行操作： 防止任何固體微粒進入泵體，因為塵?；蚱渌魏坞s質微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2m或0.45m）等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應經常清洗或更換。 流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的

5、靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。 泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產生漏液。 輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產生漏液。 流動相應該先脫氣，以免在泵內產生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。如果輸液泵產生故障，須查明原因，采取相應措施排除故障： 沒有流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內有大量氣體，這時可打開泄壓閥

6、，使泵在較大流量（如5ml/min）下運轉，將氣泡排盡，也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。 壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內超聲清洗。有時可能是砂濾棒內有氣泡，或被鹽的微細晶?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯?，這時，可卸下砂濾棒浸入流動相內超聲除氣泡，或將砂濾棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內迅速除去微生物，或將鹽溶解，再立即清洗。 壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應逐段進行。3梯度洗脫 HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gra

7、dient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內流動相組成保持恒定，適合于組分數目較少，性質差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分數目多、性質差異較大的復雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現性。 梯度洗脫有兩種實現方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內梯度）。 兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。 在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且

8、組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視： 要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。 梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質峰，因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產生氣泡。 混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱

9、壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。 每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始狀態(tài)。需讓1030倍柱容積的初始流動相流經色譜柱，使固定相與初始流動相達到完全平衡。二、進樣器 早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱入口處?，F在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。1隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積

10、幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產生記憶效應，使進樣重復性只能達到12%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。2停流進樣?？杀苊庠诟邏合逻M樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現鬼峰；另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。3閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型最常見），其關鍵部件由圓形密封墊（轉子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣（約下降510

11、%左右），但耐高壓（3540MPa），進樣量準確，重復性好（0.5%），操作方便。 六通閥的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。用部分裝液法進樣時，進樣量應不大于定量環(huán)體積的50%（最多75），并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產生由進樣引起的峰展寬。用完全裝液法進樣時，進樣量應不小于定量環(huán)體積的510倍（最少3倍），這樣才能完全置換定量環(huán)內的流動相，消除管壁效應，確保進樣的準確度及重復性。 六通閥使用和維護注意事項：樣品溶液進樣前必須用0.45m濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻

12、，使泵內壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結束后應沖洗進樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。4自動進樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。三、色譜柱 色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10m等，柱效理論值可達516萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數的柱效；對于

13、同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質對則可采用高達2萬的柱子，因此一般1030cm左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。 柱效受柱內外因素影響，為使色譜柱達到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結構（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術。即使最好的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。1柱的構造 色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺

14、絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應，不銹鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不銹鋼柱內壁涂敷氟塑料以提高內壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不銹鋼或鈦合金，孔徑0.220m(510m)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。 色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：常規(guī)分析柱（常量柱），內徑25mm（常用4.6mm，國內有4mm和5mm），柱長1030cm；窄徑柱（narrow bore，又稱細管徑柱、半微柱semi

15、-microcolumn），內徑12mm，柱長1020cm；毛細管柱（又稱微柱microcolumn），內徑0.20.5mm；半制備柱，內徑5mm；實驗室制備柱，內徑2040mm，柱長1030cm；生產制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。2柱的發(fā)展方向 因強調分析速度而發(fā)展出短柱，柱長310cm，填料粒徑23m。為提高分析靈敏度，與質譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細管徑柱的優(yōu)點是：節(jié)省流動相；靈敏度增加；樣品量少；能使用長柱達到高分離度；容易控制柱溫；易于實現LC-MS聯(lián)用

16、。 但由于柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能：輸液泵能精密輸出1100l/min的低流量，進樣閥能準確、重復地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學檢測器和質譜儀在這方面具有突出優(yōu)點。3柱的填充和性能評價 色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。在正常條件下，填料粒度20m時，干法填充制備柱較為合適；顆粒20m時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；徑向加壓法，Waters專利；軸向加壓法，主要用于裝

17、填大直徑柱；干法。柱填充的技術性很強，大多數實驗室使用已填充好的商品柱。 必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結構是否合理。 無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復性在5%或10%以內。進行柱效比較時，還要注意柱外效應是否有變化。 一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數，如柱長、內徑

18、、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。4柱的使用和維護注意事項 色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節(jié)流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩（如前所述）。 應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅

19、速降低柱效。 選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠飽和，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。 避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。 經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要5075ml。 下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參

20、考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質，在甲醇（乙腈）沖洗時重復注射100200l四氫呋喃數次有助于除去強疏水性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質污染。 陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的