克隆文庫(kù)與系統(tǒng)發(fā)育分析

克隆文庫(kù)構(gòu)建

與

系統(tǒng)發(fā)育分析劉晶靜2010-5-21常用分子生物學(xué)技術(shù)核酸雜交技術(shù)

Southernblot雜交

Northernblot雜交

FISHCARD-FISH分子克隆技術(shù)

PCR-DGGE-分子克隆技術(shù)構(gòu)建克隆文庫(kù)T-RFLP…….16SrDNA

克隆文庫(kù)構(gòu)建16SrDNA

克隆文庫(kù)是微生物分子生態(tài)學(xué)中用來(lái)調(diào)查環(huán)境中原核微生物組成的常用方法之一(MicrobiolRev,1995)突破了用傳統(tǒng)的微生物分離純化的方法調(diào)查環(huán)境中微生物多樣性時(shí)很多微生物無(wú)法得到純培養(yǎng)的限制廣泛運(yùn)用于土壤、海洋、湖泊、腸道等多種生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性的調(diào)查(FEMSMicrobiolEcol,2004)核糖體RNA是蛋白質(zhì)合成必需的，所以它們廣泛存在于所有的原核生物中，并且結(jié)構(gòu)和功能都是保守的；16SrDNA的序列中包括可變區(qū)和高變區(qū)，因此既可以利用保守區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)引物，又可以利用高變區(qū)來(lái)進(jìn)行序列間的比對(duì)；它們的序列變化比較緩慢而且在原核生物中不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，因此16SrDNA

之間序列的差異可以反映不同生物之間的進(jìn)化關(guān)系(AnnuRevMicrobiol,1986)。通過(guò)研究基因組中的“biomarker”來(lái)研究環(huán)境中微生物的多樣性的GenBank

http:///

RDPⅡRibosomalDatabaseProjectⅡhttp:///html/1.PCR擴(kuò)增引物選擇消除artifact

chimeria（嵌合體）共擴(kuò)增造成的嵌合體

heteroduplex（異源雙鏈）序列相近的模板之間退火機(jī)率減小PCR的偏好性擴(kuò)增為減少PCR的循環(huán)數(shù)和模板濃度，提高延伸時(shí)間以及選擇適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶有利于減少artifact。(ApplEnvironMicrobiol,2001)減少PCR循環(huán)數(shù)有利于減少PCR偏好性擴(kuò)增。(FEMSMicrobiolRev,1997)DNA純化試劑盒/膠回收試劑盒Agrose凝膠電泳驗(yàn)證2.PCR產(chǎn)物純化粘性末端之間的PCR產(chǎn)物連接。載體具有的氨芐青霉素抗性，所使用的宿主菌DH5α

沒(méi)有該抗性基因，因此只有帶有該質(zhì)粒的克隆才能在含有氨芐青霉素的平板上生成。pGEM-TEasyVector的圖譜3.T載體連接感受態(tài)細(xì)胞中加入連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化；抗生素抗性篩選（轉(zhuǎn)化菌液均勻地涂布于含

Amp、X-gal、IPTG的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑選白色菌落進(jìn)行鑒定。）4.重組DNA的轉(zhuǎn)化與篩選載體還帶有l(wèi)acZ

基因的調(diào)控序列和部分結(jié)構(gòu)基因序列，該載體自連以后可以與宿主DH5α基因組上的另一部分lacZ

基因序列產(chǎn)生α互補(bǔ)，在IPTG的誘導(dǎo)下產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶并將X-Gal切割成顯藍(lán)色的產(chǎn)物。而pGEM-TEasyVector上帶有插入片段時(shí)會(huì)使lacZ

基因失活，當(dāng)涂布在有IPTG和X-Gal的平板上生長(zhǎng)時(shí)，就會(huì)表現(xiàn)為白色克隆過(guò)PCR的方法檢查插入片度的大小是否正確載體上插入有16SrDNA

序列的陽(yáng)性克隆載體引物5.PCR驗(yàn)證為了減少測(cè)序的數(shù)量，可以先分別用兩種不同的核酸內(nèi)切酶分別對(duì)文庫(kù)進(jìn)行分型AmplifiedRibosomalDNARestrictionAnalysisRestrictionFragmentLengthPolymorphism6.ARDRA/RFLP分型測(cè)序反應(yīng)按序列相似性大于97%（97%-100%都可以）的標(biāo)準(zhǔn)，把所有的測(cè)序結(jié)果分成若干個(gè)OTU（operationaltaxonomicunit）。然后用每個(gè)OTU的代表序列在GenBank

和RDPⅡ數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，就可以找到這些OTU相應(yīng)微生物的系統(tǒng)發(fā)育地位，這樣就可以知道環(huán)境中微生物的組成情況7.克隆測(cè)序16SrDNA

克隆文庫(kù)的庫(kù)容（librarysize）RarefactioncurveCoverageCSpeciesrichnessShannonIndexSimpsonIndex8.克隆文庫(kù)分析序列處理軟件：SequnecherBLAST比對(duì)ClustalXBioEdit

建樹(shù)軟件：MEGA/PAUP/PHYLIP9.系統(tǒng)發(fā)育分析系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究的是進(jìn)化關(guān)系；系統(tǒng)發(fā)育分析就是要推斷或者評(píng)估這些進(jìn)化關(guān)系。序列比對(duì)是構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析的前提和必要條件，目的是建立起所檢測(cè)序列與其他序列的同源關(guān)系,提取系統(tǒng)發(fā)育分析數(shù)據(jù)集系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)是表達(dá)分類群之間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的一種樹(shù)狀圖,它可以推測(cè)生物類群系統(tǒng)發(fā)育的分支樣式,給出分支層次或拓?fù)鋱D形,并能估算類群之間遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近。在生物進(jìn)化研究中,通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),可以推斷個(gè)體之間以及群體間的親緣關(guān)系,以及研究對(duì)象在系統(tǒng)樹(shù)中所處的進(jìn)化地位等。比對(duì)建立取代模型建立進(jìn)化樹(shù)進(jìn)化樹(shù)評(píng)估先進(jìn)行序列比對(duì)；再利用比對(duì)的結(jié)構(gòu)用合適的算法求出遺傳距離；最后再根據(jù)遺傳距離構(gòu)建發(fā)育樹(shù)通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析所推斷出來(lái)的進(jìn)化關(guān)系一般用分枝圖表（進(jìn)化樹(shù)）來(lái)描述，這個(gè)進(jìn)化樹(shù)就描述了同一譜系的進(jìn)化關(guān)系。距離法（Neighborjoining,NJ）

數(shù)據(jù)組中所有序列兩兩對(duì)比的結(jié)果在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建中應(yīng)用最為廣泛,它基于最小進(jìn)化原理,可以較快的構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù),同時(shí)也比較適合于分析較大的數(shù)據(jù)集,并可以很快地進(jìn)行自展檢驗(yàn)。最大簡(jiǎn)約法（maximumparsimony,MP）

多重比對(duì)的結(jié)果當(dāng)序列分歧度較低時(shí),無(wú)需模型,源于形態(tài)性狀的研究最大似然（maximumlikelihood，ML）

多重比對(duì)的結(jié)果建樹(shù)的主要方法Jukes-Cantor

模型假定任一位點(diǎn)的核苷酸替代頻率都是相同的

Kimura

雙參數(shù)模型考慮了轉(zhuǎn)換和顛換速率的不同Equal-