微生物檢驗(yàn)在兒科臨床的應(yīng)用

1穿過細(xì)菌外膜、肽聚糖或細(xì)胞膜，到達(dá)作用部位，并與作用靶位接合2經(jīng)受住細(xì)菌產(chǎn)生的各種滅活酶的攻擊3與參與細(xì)菌基本功能的結(jié)構(gòu)相互作用，并充分地抑制該功能抗菌藥物抑制細(xì)菌生長，必須具備的條件：

第一頁，共四十三頁。細(xì)菌耐藥性的概念致病微生物對(duì)于抗菌藥物作用的耐受性或?qū)剐愿拍钍强咕幬?、?xì)菌本身及環(huán)境共同作用的結(jié)果第二頁，共四十三頁。1：按遺傳物質(zhì)分類固有耐藥獲得性耐藥2：按耐藥現(xiàn)象分類交叉耐藥多重耐藥細(xì)菌耐藥性的分類：第三頁，共四十三頁。細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制

分子遺傳機(jī)制生化機(jī)制

第四頁，共四十三頁。

細(xì)菌耐藥的遺傳性變異是基因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。結(jié)構(gòu)改變主要通過基因突變和基因的轉(zhuǎn)移與重組。分子遺傳機(jī)制：第五頁，共四十三頁。一、細(xì)菌的抗菌藥物作用靶位的改變二、細(xì)菌產(chǎn)生滅活酶（水解酶或修飾酶）三、藥物累計(jì)不足生化機(jī)制：第六頁，共四十三頁。細(xì)菌產(chǎn)生誘導(dǎo)酶對(duì)抗生素的作用靶位進(jìn)行化學(xué)修飾基因突變?cè)斐砂形蛔儺愂箍咕幬锊灰谆虿荒芘c靶位結(jié)合一、抗菌藥物作用靶位的改變產(chǎn)生耐藥細(xì)菌的生理功能正常第七頁，共四十三頁。青霉素結(jié)合蛋白的改變核糖體靶位酶親和力的下降:導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類、磺胺類、紅霉素類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥。Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶或DNA解旋酶的改變:導(dǎo)致金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腸桿菌科細(xì)菌和假單胞菌等對(duì)氟喹諾酮類抗生素耐藥。二氫葉酸代謝酶的改變：細(xì)菌改變二氫葉酸合成酶構(gòu)型，可使該酶與磺胺類抗菌藥物的親和力大為降低，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)磺胺藥耐藥。腸球菌對(duì)萬古霉素的耐藥機(jī)制：主要是其作用靶位，細(xì)胞壁五肽末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸突變?yōu)镈-丙氨酰-D乳酸或D-丙氨酸而導(dǎo)致耐藥。第八頁，共四十三頁。PBP：是β－內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶位蛋白具有轉(zhuǎn)肽酶或羧肽酶活性位于細(xì)胞膜上，參與細(xì)胞壁合成

在正常情況下：β－內(nèi)酰胺類抗生素與PBP結(jié)合，可干擾細(xì)菌肽聚糖的正常合成。在異常情況下：當(dāng)某些細(xì)菌獲得外源性DNA時(shí)，編碼產(chǎn)生新的低親和力的PBP或PBP本身發(fā)生修飾改變，對(duì)抗菌藥物親和力降低，從而導(dǎo)致該細(xì)菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥。

如：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌:（MRSA）

產(chǎn)生一種新的低分子量的PBP2a，當(dāng)有β－內(nèi)酰胺類抗生素存在時(shí)，細(xì)菌表面5種正常的PBP被抑制，不能發(fā)揮正常生理功能，而PBP2a不被抑制，可作為轉(zhuǎn)肽酶完成細(xì)胞壁的合成，使MRSA對(duì)所有β－內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥。

例如：青霉素結(jié)合蛋白（PBP)的改變第九頁，共四十三頁。

β－內(nèi)酰胺酶

氨基糖苷類鈍化酶

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶

紅霉素酯化酶二、細(xì)菌產(chǎn)生的滅活酶（水解酶或修飾酶）第十頁，共四十三頁。β－內(nèi)酰胺酶:

細(xì)菌產(chǎn)生的以β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物為水解產(chǎn)物的多種不同類型的降解酶，可使β－內(nèi)酰胺鍵斷裂造成β－內(nèi)酰胺類藥物失去活性。目前已知的β－內(nèi)酰胺酶有200多種。β－內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物:包括青霉素與頭孢菌素類等,為臨床最常用的抗菌藥物之一。這類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中均有β－內(nèi)酰胺環(huán),可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成,此環(huán)與他們的抗菌作用密切相關(guān),當(dāng)環(huán)被打開,則抗菌活性消失。第十一頁，共四十三頁。β－內(nèi)酰胺酶的分類功能分類(Bush)結(jié)構(gòu)分類(Ambler)作用底物酶抑制劑EDTA名稱（代表酶）1C頭孢菌素--頭孢菌素酶(G－桿菌的AmpC酶)2aA青霉素+-青霉素酶(G＋球菌的青霉素酶)2bA青霉素；一、二代頭孢菌素+-廣譜酶(TEM-1,TEM-2,SHV-1)2beA青霉素；一、二、三代頭孢菌素；單環(huán)類+-超廣譜酶(TEM-3至TEM-26;SHV-3至SHV-5)2brA青霉素+/--耐酶抑制劑酶(TEM-30至TEM-36)2cA青霉素；羧芐西林+-羧芐西林酶(PSE-1,PSE-3,PSE-4)2dD青霉素；苯唑西林+/--苯唑西林酶(OXA-1至OXA-27,PSE-4)2eA頭孢菌素+-普通變形桿菌的可誘導(dǎo)的頭孢菌素酶2fA青霉素；頭孢菌素；碳青霉烯類+-非金屬碳青霉烯酶(陰溝桿菌的NMC-A,粘質(zhì)沙雷菌的Sme-1)3A絕大多數(shù)β－內(nèi)酰胺類，包括碳青霉烯類-+金屬酶(銅綠假單胞菌的IMP-1,VIM-1)4B青霉素--洋蔥伯克霍爾德菌的青霉素酶第十二頁，共四十三頁。超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（ESBLs）主要由大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的廣譜酶TEM-1、TEM-2和SHV-1突變形成。使細(xì)菌的耐藥譜從青霉素和一、二代頭孢菌素?cái)U(kuò)大到青霉素和一、二、三代頭孢菌素及單環(huán)類，但對(duì)頭霉素、碳青酶烯類及酶抑制劑敏感。AmpC酶為染色體介導(dǎo)的頭孢菌素酶，幾乎所有腸桿菌科細(xì)菌和銅綠假單胞菌都產(chǎn)生此酶。當(dāng)此酶大量表達(dá)時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)除第四代頭孢菌素、碳青酶烯類之外的所有β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。且對(duì)β－內(nèi)酰胺酶抑制劑及EDTA均不敏感。金屬β－內(nèi)酰胺酶是一群能水解碳青酶烯類抗生素的酶，能被金屬螯合劑螯合，不被酶抑制劑抑制。到目前為止至少發(fā)現(xiàn)了28種。第十三頁，共四十三頁。藥物吸收減少由于細(xì)胞壁的有效屏障或細(xì)胞膜通透性的改變，阻止藥物吸收，使抗生素?zé)o法進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用主動(dòng)外排泵作用在某些細(xì)菌外膜上存在特殊的能量依賴性的藥物泵系統(tǒng)，能將進(jìn)入菌體內(nèi)的藥物不斷泵出，使菌體內(nèi)的藥物濃度不足以發(fā)揮抗菌作用而導(dǎo)致耐藥三、藥物累計(jì)不足第十四頁，共四十三頁。細(xì)菌名稱抗菌藥物主要耐藥機(jī)制葡萄球菌青霉素產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶耐酶青霉素青霉素結(jié)合蛋白改變氟喹諾酮類DNA解旋酶、藥物外排泵紅霉素核糖體保護(hù)蛋白的產(chǎn)生肺炎鏈球菌β－內(nèi)酰胺類青霉素結(jié)合蛋白改變紅霉素核糖體保護(hù)蛋白的產(chǎn)生腸球菌β－內(nèi)酰胺類青霉素結(jié)合蛋白改變氨基糖苷類鈍化酶糖肽類結(jié)合蛋白改變流感嗜血桿菌淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌青霉素產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶腸桿菌科細(xì)菌β－內(nèi)酰胺類產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶氨基糖苷類鈍化酶氟喹諾酮類DNA解旋酶、藥物外排泵銅綠假單胞菌β－內(nèi)酰胺類β－內(nèi)酰胺酶、外膜通透性改變氨基糖苷類鈍化酶氟喹諾酮類DNA解旋酶、藥物外排泵、外膜通透性改變磺胺類雙氫葉酸合成酶改變臨床常見細(xì)菌對(duì)常見抗菌藥物的主要耐藥機(jī)制第十五頁，共四十三頁。供臨床選擇治療藥物療效差，考慮更換抗菌藥了解病原菌耐藥性的變遷評(píng)價(jià)新藥抗菌譜及抗菌活性抗菌譜有助于某些菌種鑒定藥敏試驗(yàn)的目的第十六頁，共四十三頁。細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)

以臨床細(xì)菌標(biāo)本的藥敏試驗(yàn)為基礎(chǔ)，分析所在醫(yī)院或地區(qū)常見病原菌耐藥性的變遷。第十七頁，共四十三頁。

2008年我院細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)藥名頭孢唑啉頭孢他啶頭孢噻肟青霉素頭孢曲松名次11234藥名G－腸桿菌（24株）耐藥率％名次頭孢呋辛95.8（23）1頭孢曲松95.8（23）1頭孢他啶62.5（15）2氨芐西林/舒巴坦62.5（15）2哌拉西林/他唑巴坦25.0（6）3環(huán)丙沙星25.0（6）3頭孢吡肟16.7（4）4丁胺卡那12.5（3）5頭孢哌/舒巴坦4.2（1）6亞安培南4.2（1）6藥名G＋球菌（13株）耐藥率％名次青霉素G76.9（10）1紅霉素76.9（10）1苯唑西林61.5（8）2環(huán)丙沙星46.2（6）3慶大霉素38.5（5）4洛美沙星38.5（5）4萬古霉素15.4（2）52008年7-9月G-桿菌耐藥率2008年抗生素使用排名2008年1-6月G+球菌耐藥率藥名G－腸桿（22株）耐藥率％名次頭孢唑啉90.1（20）1哌拉西林86.4（19）2阿莫西林/棒酸77.3（17）3氨芐西林63.6（14）4慶大霉素54.5（12）5亞胺培南45.4（10）6環(huán)丙沙星36.4（8）72008年1-6月G-桿菌耐藥率第十八頁，共四十三頁。2008年10-12月細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)藥名G－腸桿菌（19株）耐藥率％名次頭孢呋辛78.9（15）1頭孢曲松73.7（14）1頭孢他啶57.9（11）2氨芐西林/舒巴坦36.8（7）2頭孢吡肟21.1（4）3哌拉西林/他唑巴坦15.8（3）3環(huán)丙沙星15.8（3）4頭孢哌酮/舒巴坦10.5（2）5丁胺卡那5.3（1）6亞安培南5.3（1）6培養(yǎng)出的細(xì)菌數(shù)量（株）來源科室肺炎克雷伯菌9新生兒科8株；產(chǎn)一科1株大腸埃希菌6新生兒科6株銅綠假單胞菌1新生兒科1株陰溝桿菌2新生兒科2株克呂沃爾菌1新生兒科1株金黃色葡萄球菌2產(chǎn)一科2株表皮葡萄球菌2新生兒1株；產(chǎn)一科1株注：

超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（ESBLs）檢測(cè)19株G－腸桿菌，14株陽性，陽性率為73.7％。培養(yǎng)出的細(xì)菌種類第十九頁，共四十三頁。特殊細(xì)菌的耐藥菌株檢測(cè)試驗(yàn)?zāi)图籽跷髁制咸亚蚓鷻z測(cè)1超廣譜β－內(nèi)酰胺酶檢測(cè)2AmpC酶的檢測(cè)3耐萬古霉素腸球菌檢測(cè)4第二十頁，共四十三頁。1.耐甲氧西林葡萄球菌檢測(cè)(MRSA)由染色體mecA基因介導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)苯唑青霉素等β－內(nèi)酰胺類抗生素親和力很低的青霉素結(jié)合蛋白（PBP2a）。包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌（MRCNS）。苯唑西林紙片法：MRSA≤13mm，MRCNS≤18mmMRSA陽性結(jié)果應(yīng)注意：該菌對(duì)所有青霉素類、頭孢菌素類、碳青酶烯類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和含酶抑制劑的復(fù)合劑為耐藥，不論檢驗(yàn)報(bào)告的結(jié)果是否敏感。第二十一頁，共四十三頁。2.超廣譜β－內(nèi)酰胺酶檢測(cè)（ESBLs）ESBLs可與β－內(nèi)酰胺環(huán)的羧基共價(jià)結(jié)合，使其酰胺鍵水解。主要由大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的廣譜酶TEM-1、TEM-2和SHV-1突變形成。使細(xì)菌的耐藥譜從青霉素和一、二代頭孢菌素?cái)U(kuò)大到青霉素和一、二、三代頭孢菌素及單環(huán)類，但對(duì)頭霉素、碳青酶烯類及酶抑制劑敏感。采用雙紙片擴(kuò)散法，即頭孢他啶與頭孢他啶/棒酸，頭孢噻肟與頭孢噻肟/棒酸組合，任何一組藥物的抑菌直徑之差≥5mm時(shí)判斷ESBLs陽性。

第二十二頁，共四十三頁。3.AmpC酶的檢測(cè)AmpC酶為染色體介導(dǎo)的頭孢菌素酶，優(yōu)先作用底物是頭孢菌素。幾乎所有腸桿菌科細(xì)菌和銅綠假單胞菌都產(chǎn)生此酶。當(dāng)此酶大量表達(dá)時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)除第四代頭孢菌素、碳青酶烯類之外的所有β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。且對(duì)β－內(nèi)酰胺酶抑制劑及EDTA均不敏感。5種紙片初篩試驗(yàn)：頭孢他啶、頭孢他啶/棒酸、頭孢西丁、亞胺培南和頭孢吡肟，前三種耐藥，后兩種敏感。第二十三頁，共四十三頁。4.耐萬古霉素腸球菌檢測(cè)（VRE）：耐萬古霉素腸球菌（VRE）可分為VanA、VanB、VanC三種類型。由于MRSA增加，萬古霉素使用大幅上升，導(dǎo)致臨床VRE感染病人增加；VRE治療比較困難，沒有特定規(guī)律；可供選擇的有四環(huán)素、氯霉素、喹諾酮類，泌尿系可考慮呋喃妥因或磺胺類。第二十四頁，共四十三頁。微生物檢驗(yàn)在兒科臨床的應(yīng)用

溝通理解合作第二十五頁，共四十三頁。血培養(yǎng)標(biāo)本的采集和運(yùn)送1.血培養(yǎng)的數(shù)量研究結(jié)果一套血培養(yǎng)的陽性率為65％二套血培養(yǎng)的陽性率為80％三套血培養(yǎng)的陽性率為96％CLSI建議方針對(duì)于每位需要血培養(yǎng)的患者需采取2至3套。對(duì)于成年患者的血培養(yǎng)，只采單一的血培養(yǎng)是不允許的。因?yàn)閱我谎囵B(yǎng)的結(jié)果的臨床意義很難解釋。采血培養(yǎng)后的2至5天內(nèi)，不需要重復(fù)采血培養(yǎng)，因?yàn)橹委熀蟮?至5天內(nèi)血液中的感染細(xì)菌不會(huì)馬上消失。第二十六頁，共四十三頁。2.血培養(yǎng)的采血量和時(shí)間對(duì)于成年患者，每套血培養(yǎng)瓶推薦的采血量為１0至２0ml對(duì)于嬰幼兒患者，采血量不超過患者總血量的1％（≤1kg采血2ml;1.1-2kg采血2ml；采血4ml;，采血10ml）采血盡量在寒戰(zhàn)或發(fā)熱后及未使用抗生素之前完成。在評(píng)估可疑新生兒敗血癥時(shí)，除發(fā)熱或低燒外，很少培養(yǎng)出細(xì)菌的，應(yīng)該補(bǔ)充尿液和腦脊液培養(yǎng)。第二十七頁，共四十三頁。3.標(biāo)本的運(yùn)送血培養(yǎng)瓶在采血接種后必須馬上送檢血培養(yǎng)瓶在采血接種后在室溫中不得超過數(shù)小時(shí)血培養(yǎng)瓶不得在采血接種后放入冰箱或冷凍第二十八頁，共四十三頁。4.培養(yǎng)時(shí)間與陽性率

BACTEC9240需氧瓶中5天的培養(yǎng)結(jié)果?孵育5天后共檢出1133株有臨床意義的菌株–907株(80.0%)在24小時(shí)內(nèi)檢出–162株(14.3%)在24-48小時(shí)檢出–18株在96小時(shí)以后檢出?在第5天檢出的細(xì)菌S.aureus4E.faecalis1Klebsiellaspp.5Serratiaspp.1Brucellaspp.2Candidaspp.3C.neoformans1第二十九頁，共四十三頁。痰標(biāo)本的采集和運(yùn)送小兒取痰方法用壓舌板向后壓舌，用棉拭子伸入咽部，小兒經(jīng)壓舌刺激咳嗽時(shí)，可噴出肺部或氣管分泌物粘在拭子上，取后立即送檢。第三十頁，共四十三頁。痰標(biāo)本的檢驗(yàn)與臨床痰中可分離到的三大類呼吸道感染的病原菌結(jié)核桿菌、白喉棒狀桿菌、百日咳桿菌——公認(rèn)的病原菌肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡它布拉漢菌——逐漸被認(rèn)識(shí)的CAP病原菌腸桿菌科細(xì)菌、非發(fā)酵菌、葡萄球菌等——條件致病菌第三十一頁，共四十三頁。痰中檢出結(jié)核桿菌,白喉棒狀桿菌,百日咳桿菌屬于確診報(bào)告痰中培養(yǎng)出肺炎鏈球菌,流感嗜血桿菌,卡他布拉漢氏菌基本上可以確診為社區(qū)獲得性肺炎的病原菌.除此以外的其他革蘭陰性桿菌,革蘭陽性球菌,真菌屬參考報(bào)告.參考的價(jià)值約30%.第三十二頁，共四十三頁。

目前，痰中分離出的細(xì)菌種類大致排位是：綠膿桿菌，不動(dòng)桿菌，肺炎克雷伯菌，陰溝腸桿菌，變形桿菌，大腸桿菌，某些少見的腸桿菌科細(xì)菌及非發(fā)酵菌，葡萄球菌，念珠菌，糞腸球菌,肺炎鏈球菌,流感嗜血桿菌….

幾乎全部是條件致病菌第三十三頁，共四十三頁。條件致病菌的幾種身份病原菌：患者由這類菌引起感染，用細(xì)菌報(bào)告提示的抗生素治療，療效明顯定植菌：①用細(xì)菌報(bào)告提示的抗生素治療，該菌消失，感染癥狀依然存在②或是由于該菌泛耐藥，臨床憑經(jīng)驗(yàn)聯(lián)合用藥，感染癥狀好轉(zhuǎn)，但該菌依然存在上述兩種現(xiàn)象說明，細(xì)菌報(bào)告中的病原菌與感染毫無關(guān)系污染菌：留取標(biāo)本過程中，污染了非感染部位的細(xì)菌第三十四頁，共四十三頁。某種情況：患者的感染已基本治愈，做痰檢的目的是希望得到一張陰性報(bào)告做為停止治療,出院的憑證。培養(yǎng)：生長大量陰性桿菌，較常見的是綠膿桿菌和不動(dòng)桿菌

患者已接受了較長時(shí)間的抗生素治療，在清除了病原菌的同時(shí)，上呼吸道的正常菌同時(shí)被殺傷，定植抗力削弱，醫(yī)院中常見的綠膿桿菌，不動(dòng)桿菌由于耐藥性極強(qiáng)，有機(jī)會(huì)在上呼吸道大量生長。這類細(xì)菌致病力較弱，與宿主形成和平共處的狀態(tài)，這是典型的定植現(xiàn)象。清除這些不應(yīng)在呼吸道大量生長的定植菌最佳的手段是停用抗生素，讓呼吸道正常菌群重新生長，拮抗定植菌。第三十五頁，共四十三頁。糞便標(biāo)本的采集和運(yùn)送自然排便法：自然排便后，挑取有膿血、黏液部位的糞便2－3克，液狀糞便取絮狀物盛于無菌的容器內(nèi)送檢。直腸拭子方法：如不易獲得糞便時(shí)或排便困難的患者及幼兒，可采取直腸拭子方法采集，取出后插入滅菌試管內(nèi)送檢。

以肥皂，水和70﹪的酒精，將肛門周圍洗凈，然后用一根浸過無菌生理鹽水的棉拭子，插入肛門約５mm處，輕輕旋轉(zhuǎn)，使之與直腸黏膜表面接觸，然后取出置于無菌試管中立刻送至微生物室．第三十六頁，共四十三頁。糞便標(biāo)本的檢驗(yàn)和臨床糞便檢驗(yàn)主要是患者出現(xiàn)腹瀉癥狀，而引起腹瀉的原因主要有：1.細(xì)菌感染2.食物中毒3.菌群失調(diào)患者吃了不清潔的食物，出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等癥狀前來就醫(yī)醫(yī)生根據(jù)患者主述，大便常規(guī)檢驗(yàn),診斷為菌痢或腸炎治療：靜脈補(bǔ)液加抗生素這種有效的治療方法至今還在延用第三十七頁，共四十三頁。但下述情況，此方法無效：住院長期使用抗生素的患者，出現(xiàn)腹瀉癥狀（每日次數(shù)增多，大便呈糊狀），腹部不適，食欲欠佳。其本質(zhì)原因是治療其他感染性疾病所使用的抗生素在發(fā)揮治療作用的同時(shí)傷及腸道正常菌群，數(shù)量上占優(yōu)的原籍菌被殺滅或抑制，而某些耐藥的少數(shù)菌乘機(jī)大量繁殖，引起腸道生態(tài)失調(diào)。第三十八頁，共四十三頁。腸道生理菌群的主要種類及分布緊貼腸黏膜：以雙岐桿菌、乳酸桿菌為主中間層：類桿菌、真桿菌、消化球菌和消化