天然藥物提取工藝課件-色譜分離技術(shù)-2

第五節(jié)色譜分離技術(shù)色譜法（chromatography）利用混合物中各個組分的化學(xué)、物理性質(zhì)的差異，基于被分離物質(zhì)分子在兩相（一為固定相，一為流動相）中分配系數(shù)的微小差別進(jìn)行分離。1固定相流動相色譜柱被分離組分2

吸附層析：以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間的吸附力不同達(dá)到分離目的；

分配層析：是根據(jù)在一個由兩相同時存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的；

凝膠過濾層析：以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離的一種層析方法；

離子交換層析：以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進(jìn)行分離的一種層析方法；

親和層析：根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力，將某種配體連接在載體上作為固定相，而對能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進(jìn)行分離的一種層析分離。c.根據(jù)分離原理的不同分類：3四、離子交換層析（ionexchangechromatography，IEC）

是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。41.基本原理離子交換層析:

是利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異來實現(xiàn)分離。依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的。5固定相？？固定相為離子交換劑；離子交換劑：它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)，共價結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。其分子結(jié)構(gòu)中存在許多可以電離的活性中心。待分離組分中的離子會與這些活性中心發(fā)生離子交換，從而在流動相與固定相之間形成分配。6固定相的固有離子與待分離組分中的離子之間相互爭奪固定相中的離子交換中心，并隨著流動相的運動而運動，最終實現(xiàn)分離。

7離子交換劑分為三個部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)、平衡離子。電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價結(jié)合，形成一個帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。離子交換劑8平衡離子是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子，能與溶液中其他的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。

平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陽離子交換劑；

平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑能與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑；離子交換劑9R——離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì)X+——陽離子交換劑與高分子聚合物共價結(jié)合的電荷基團(tuán)；X-——陰離子交換劑與高分子聚合物共價結(jié)合的電荷基團(tuán)；Y+——陽離子交換劑的平衡離子；Y-——陰離子交換劑的平衡離子；A+——溶液中的離子基團(tuán)；A-——溶液中的離子基團(tuán)10返回11各種離子與離子交換劑上的電荷基團(tuán)的結(jié)合是由靜電力產(chǎn)生的，是一個可逆的過程。離子交換層析是利用各種離子本身與離子交換劑結(jié)合力的差異，并通過改變離子強(qiáng)度、pH等條件改變各種離子與離子交換劑的結(jié)合力而達(dá)到分離的目的。12電荷基團(tuán)對不同的離子有不同的結(jié)合力:

離子價數(shù)越高，結(jié)合力越大；價數(shù)相同時，原子序數(shù)越高，結(jié)合力越大。如：Li+<Na+<K+<Rb+<Cs+；Na+<Ca2+<Al3+<Ti4+13（1）離子交換劑的種類及性質(zhì)

含有解離性離子交換基團(tuán)的高分子物質(zhì)，由兩部分構(gòu)成：一部分是大分子聚合物基質(zhì)主體結(jié)構(gòu)；另一部分是具有電荷活性的功能基團(tuán)。2、離子交換劑的選擇

14離子交換劑離子交換分離離子交換分離法是利用帶有活性交換基團(tuán)的離子交換劑與溶液中的離子發(fā)生交換反應(yīng)而使離子分離的方法離子交換劑（樹脂）帶有活性基團(tuán)的多孔網(wǎng)狀高分子聚合物骨架活性基團(tuán)酚醛樹脂聚乙烯樹脂交聯(lián)劑酸性基團(tuán)堿性基團(tuán)—SO3H—COOH—N+R3—NR2Ionexchangeresins特殊基團(tuán)15聚苯乙烯磺酸型陽離子交換樹脂聚合磺化交聯(lián)劑交聯(lián)作用活性基團(tuán)R-SO3H+M+=R-SO3M+H+16離子交換樹脂的分類依據(jù)活性基團(tuán)分類陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂螯合樹脂兩性交換樹脂強(qiáng)酸型弱酸型交換基為酸性，H+與陽離子交換—SO3H—COOH—OHpH>2pH>6使用pH范圍pH>10交換基為堿性，陰離子發(fā)生交換強(qiáng)堿型弱堿型—N+(CH3)3Cl-—N+H3OH-—N+H2ROH-—N+HR2OH-

pH<12

pH<4含有特殊螯合基團(tuán)的樹脂含有氧化還原功能基團(tuán)17交換反應(yīng)陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂R-SO3H+M+R-SO3M+H+RN+(CH3)3Cl-+X-RN+(CH3)3X-+Cl-R-NH2+H2OR-N+H3OH-

水合作用RN+H3OH-+X-RN+H3X-+OH-螯合交換樹脂R-L+M(R-L)nM18強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂弱酸型陽離子交換樹脂19強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂弱堿型陰離子交換樹脂20離子交換樹脂的性能參數(shù)交聯(lián)度交換容量表征骨架性能的參數(shù)表征活性基團(tuán)的性能參數(shù)是指交聯(lián)劑在反應(yīng)物中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)交聯(lián)度大，樹脂孔隙，交換反應(yīng)速度，選擇性。小慢高交聯(lián)度小，樹脂孔隙，交換反應(yīng)速度，選擇性。大快低氨基酸的分離，交聯(lián)度8%，多肽的分離2~4%每克干樹脂所能交換的物質(zhì)的量（mmol)。決定于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中活性基團(tuán)的數(shù)目。交換容量由實驗測得請設(shè)計一個測定強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂容量的方法。21等級陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂

低交聯(lián)度3%~6%2%~3%中等交聯(lián)度7%~12%4%~5%高交聯(lián)度13%~20%8%~10%離子交換樹脂的等級22交換容量的測定（滴定法）稱取某OH-型陰離子交換樹脂2.00g，置于錐型瓶中，加入0.200mol/LHCl100mL浸泡一晝夜。用移液管吸取25.00mL,以甲基紅為指示劑，用0.100mol/LNaOH溶液滴定，消耗20.00mL。計算離子交換樹脂的交換容量。23離子交換結(jié)合力離子交換樹脂與電解質(zhì)溶液接觸時發(fā)生離子交換反應(yīng)R-A++B+R-B++A+

K——選擇性系數(shù)，也叫分離因素可以推導(dǎo)得衡量樹脂對離子的結(jié)合力的大小的參數(shù)結(jié)合力水合離子的半徑離子的電荷K半徑小K電荷數(shù)離子交換分離的基礎(chǔ)結(jié)合力的差異24

強(qiáng)酸型陽離子交換劑（含有磺酸基-SO3H等）對各種正離子的結(jié)合力次序為：Fe3+>Al3+>Zn2+>Cu2+>Ni2+>Co2+>Fe2+>Ba2+>Cr2+>Ca2+>Mg2+>Cs+>Rb+>K+>Na+>H+>Li+

強(qiáng)堿性陰離子交換劑（含季胺-N+(CH3)3等）對各種負(fù)離子的結(jié)合力次序為：檸檬酸根>SO42->Cr2O4->I->NO3->CrO4->Br->SCN->Cl->HCOO->OH->F->CH3COO-25弱堿性陰離子交換劑對氫氧根離子(OH-)有較高的結(jié)合力，易于轉(zhuǎn)變?yōu)榱u型。陽離子只能被陽離子交換劑吸附，陰離子只能被陰離子交換劑吸附；結(jié)合力大的易于吸附，難于洗脫，結(jié)合力小的難于吸附，容易洗脫；26強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂分離示例Cl-,K+,Na+,Ag+

的分離K：親和力

H+<Na+<K+<Ag+H2O游離狀態(tài)交換反應(yīng)27H+<Na+<K+<Ag+CtNa+K+Ag+前一狀態(tài)洗脫淋洗曲線28（2）離子交換劑的處理和保存使用前（一般需要處理）干粉狀的離子交換劑首先要進(jìn)行膨化，將干粉在水中充分溶脹，增大顆粒的空隙，活性電荷基團(tuán)充分暴露；后用水懸浮去除雜質(zhì)和細(xì)小顆粒，再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗至中性，再用另一種試劑處理，最后用水洗至中性。29（2）離子交換劑的處理和保存使用前（一般需要處理）一般陽離子樹脂最后用堿處理（NaOH/NaCl）一般陰離子樹脂最后用酸處理（HCl）酸堿濃度一般<0.5mol/L，浸泡時間一般30min。30（2）離子交換劑的處理和保存使用后再生：同離子交換劑使用前的處理相似，用酸堿處理再生。離子交換樹脂的保存：應(yīng)首先洗凈蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，并加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎?，一般加?.02%的NaN3，4℃保存。31（3）離子交換劑的選擇選擇離子交換劑時應(yīng)考慮下列因素：(1)樣品離子帶何種電荷（交換劑電荷基團(tuán)）(2)離子的濃度；(3)被分離物質(zhì)相對分子量的大?。ń粨Q劑基質(zhì)）(4)離子與交換劑的結(jié)合力大??；(5)離子交換劑及欲分離物質(zhì)的物理化學(xué)特性等。323、離子交換色譜的操作

裝柱

離子交換劑轉(zhuǎn)型（用適當(dāng)?shù)脑噭┨幚?，離子交換劑所帶的可交換離子轉(zhuǎn)變?yōu)槲覀兯枰碾x子，如陽離子交換劑用NaOH處理，可轉(zhuǎn)為Na+型，用HCl處理，則轉(zhuǎn)為H+型；陰離子交換劑用NaOH處理轉(zhuǎn)為OH-型，用HCl處理轉(zhuǎn)為Cl-型等）；333、離子交換色譜的操作

溶劑或緩沖液平衡上樣一般為柱床體積的1%-5%為宜；洗脫和收集洗脫液中應(yīng)含有與交換劑的結(jié)合力較大的離子，以便把吸附在交換劑上的樣品離子交換下來，樣品中含有多種離子時，與交換劑親和力小的首先被洗脫出來；樣品濃縮、脫鹽處理。34主要用于分離可離子化的成分，如生物堿、氨基酸有機(jī)酸和糖，核苷酸等。分離純化小分子物質(zhì)

應(yīng)用于無機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物質(zhì)的分離純化；②分離純化大分子物質(zhì)

蛋白質(zhì)等生物大分子分離純化。

4、離子交換層析的應(yīng)用35水的凈化H+OH-陽離子交換陰離子交換R-SO3H+M+R-SO3M+H+RN+H3OH-+X-RN+H3X-+OH-H++OH-H2O除去水中的雜質(zhì)離子去離子水36五、凝膠層析

(gelfiltrationchromatography)

它的優(yōu)點是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑。對高分子物質(zhì)有很好的分離效果。37此法又稱為分子篩層析。凝膠過濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Sephadex-葡聚糖凝膠G10-G200Sepharose-瓊脂糖凝膠2B,4B,6BSephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝膠

S100,S200,S300,S400五、凝膠層析38概念：凝膠層析又稱分子篩層析、排阻層析，當(dāng)生物大分子隨流動相通過裝有作為固定相的凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。391.

原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有三維多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。40凝膠顆粒是一類具有三維空間多孔性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，不帶電荷，可起濾過或“篩”的作用。41分子大小不同混合物上柱；洗脫開始，小分子擴(kuò)散進(jìn)人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；大小分子分開：大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進(jìn)行中。42(1)分子篩效應(yīng)各分子在凝膠色譜柱內(nèi)同時進(jìn)行著兩種不同的運動：垂直向下的移動無定向的擴(kuò)散運動。

43(1)分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)：大分子物質(zhì)由于直徑較大，不進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，只能分布在顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快；小分子物質(zhì)，即可在顆粒間隙中擴(kuò)散，也進(jìn)入凝膠顆粒的微孔內(nèi)，在洗脫時下移的速度落后于大分子物質(zhì)。4445柱床體積就是指凝膠柱所能容納的總體積，Vt表示。外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動相的體積，Vo表示。內(nèi)水體積是指凝膠顆粒中孔穴的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內(nèi)水體積，Vi表示?；|(zhì)體積是指凝膠顆粒實際骨架體積，Vg表示。（2）凝膠層析柱的重要參數(shù)46洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積，Ve表示。我們設(shè)柱床體積為Vt，外水體積為Vo，內(nèi)水體積為Vi，基質(zhì)體積為Vg，則有：

Vt＝Vo＋Vi＋Vg

由于Vg相對很小，可以忽略不計，則有：

Vt＝Vo＋Vi

（2）凝膠層析柱的重要參數(shù)47凝膠層析柱各種體積示意圖（陰影部分）外水體積（V0）內(nèi)水體積（Vi）基質(zhì)體積（Vg）柱床體積（Vt）482.凝膠的種類和性質(zhì)兩類：以水為洗脫劑的用于生物大分子分離純化的凝膠；如天然瓊脂糖凝膠等。以有機(jī)溶劑為洗脫劑的凝膠，用于分離小分子、有機(jī)多聚物；如交聯(lián)聚苯乙烯等。492.凝膠的種類和性質(zhì)（1）交聯(lián)葡聚糖凝膠交聯(lián)葡聚糖SephadexG，商品名為SephadexG，不同型號的用G表示，G后面的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍如：G-25為每1g凝膠膨脹時吸水2.5g。50

①

葡聚糖凝膠SephadexG交聯(lián)葡聚糖結(jié)構(gòu)51※

SephadexLH-20能溶于水及親脂溶劑，分離不容水的物質(zhì)。為SephadexG-25經(jīng)羥丙基化處理后得到的產(chǎn)物（具醚鍵形式）-OH→-OCH2CH2CH2OH②羥丙基葡聚糖凝膠SephadexLH-2052※

SephadexLH-20分子中-OH數(shù)量無改變，但碳原子所占比例卻相對增加了；※

不僅可以在水中應(yīng)用，也可在極性有機(jī)溶劑或它們與水組成的混合溶劑中膨潤使用。②羥丙基葡聚糖凝膠SephadexLH-20-OH→-OCH2CH2CH2OH53SephadexLH-20保留了SephadexG-25原有的分子篩特性；在由極性與非極性溶劑組成的混合溶劑中常常起到反相分配色譜的作用；SephadexLH-20可以反復(fù)再生使用。應(yīng)用范圍①SephadexG主要用于分離糖、蛋白、苷。②SephadexLH-20多用于分離苷和苷元。

542.凝膠的種類和性質(zhì)（3）瓊脂糖凝膠（4）聚丙烯酰胺凝膠，（5）聚苯乙烯凝膠553、實驗技術(shù)（1）層析柱分離度取決于柱高，一般不超過1m。（2）凝膠的選擇（3）凝膠的制備商品凝膠是干燥的顆粒，使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。（4）樣品溶液的處理樣品溶液如有沉淀應(yīng)過濾或離心，樣品層盡可能窄，洗脫的峰形較好。56（5）防止微生物的污染常用的抑菌劑有：疊氮烷，可樂酮，苯基汞代鹽等（6）重復(fù)使用與保存

保存方法有三種：a.在液相中保存，加入防腐劑（0.02%NaN3），4℃保存；b.用完后，水洗，然后用60－70％酒精液沖洗，凝膠體積縮小，在半收縮狀態(tài)下保存；c.長期不用者，最好以干燥狀態(tài)保存，即水洗后，用含乙醇的水洗，梯度，最后用95％乙醇洗，全部去水，再用乙烯除去乙醇，抽濾干，于60℃－80℃干燥后保存。57裝柱前準(zhǔn)備:

先用自來水洗凈,再用蒸餾水洗凈，之后往層析柱加入2-3ml蒸餾水,以確保凝膠底部沒有氣泡；裝柱：垂直裝柱，待凝膠裝至柱高的10-15cm即可（裝柱的時候注意要不斷混勻凝膠）。注意防止氣泡與分層,

否則重新裝柱?？捎貌０魯嚢枋贡砻嫫秸?；實驗操作58平衡：反復(fù)加蒸餾水,平衡10分鐘。使蒸餾水維持在3-4cm高度；加樣：待蒸餾水流至柱平面時（不可使柱平面干掉），馬上靠近柱平面小心滴加4滴樣品（注意盡量不要使床面攪動），待樣品浸入到凝膠中后馬上加入3－4滴蒸餾水(動作輕柔)，反復(fù)兩次，然后加大量蒸餾水洗脫；收集樣品。實驗操作59六、親和層析AffinityChromatography60Affinitychromatography

又叫功能層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有的特異的親和力，從而達(dá)到分離目的的一類特殊層析技術(shù)。親和層析611.基本原理利用生物大分子與其特異性配基之間的特異結(jié)合能力的特性（專一的親和力），先將配基交聯(lián)到層析介質(zhì)上，制成親和層析介質(zhì)。621.基本原理將含有該生物大分子的待分離樣品上樣后，該生物大分子將被特異性吸附在親和層析介質(zhì)上，而樣品中其他物質(zhì)全部流過而被去除；在改變洗脫條件時，就可把特異性吸附的生物大分子洗脫下來，而達(dá)到分離純化。63一種親和層析介質(zhì)只能用于一種或有限的一類生物大分子的分離純化。生物專一吸附(bioselectiveadsorption)64+CCC配基蛋白質(zhì)1.配基固相化2.親和吸附固體載體3.解吸附6566酶—底物（包括酶的競爭性抑制劑和輔酶因子）特異性抗原—抗體激素—受體DNA—互補的DNA或RNA凝集素和糖蛋白A.具有專一性親和力的生物分子對：67基質(zhì)Matrix(載體)：親和層析中與配基共價結(jié)合，使其固相化的物質(zhì)，連接后的配體對互補分子的親和力不會改變。配基Ligand：發(fā)生親和反應(yīng)的功能部分，也是載體和被親和分子之間的橋梁。CB.固相化(Immobilise)配基固相化固相載體68配基的結(jié)構(gòu)配體本省必須具有兩個基團(tuán)一個能與載體共價結(jié)合一個能與被親和分子結(jié)合69配基可以是小分子物質(zhì)：一些輔酶、輔基大分子物質(zhì)：酶、抗體純化酶的配基：底物、酶活性中心、抑制劑、輔酶、輔基等；純化抗原抗體的配基：互為配基純化核酸的配基：DNA和RNA，蛋白質(zhì)和mRNA70載體的選擇應(yīng)具備的特性：1.有豐富的可供活化的化學(xué)基團(tuán)，并在溫和條件下能與配基共價結(jié)合。2.惰性的，非專一性吸附無或足夠小。3.多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。4.良好的機(jī)械性能，具有好的液體流動性。5.有較好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。C固相載體71可供選擇的載體瓊脂糖商品名：Sepharose型號：2B，4B，6B型號含義：瓊脂糖濃度為2%，4%，6%特點：親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定，網(wǎng)孔大，非專一性吸附小，只能以濕態(tài)保存，經(jīng)不起有機(jī)溶劑處理。72聚丙烯酰胺凝膠商品名：Bio-Gelp型號：P-100至-300型號含義：排阻限度，X1000相當(dāng)于允許進(jìn)入凝膠內(nèi)部蛋白質(zhì)的最大分子量特點：干膠，理化性質(zhì)穩(wěn)定,抗微生物侵襲能力較大，適用于配基和親和物之間親和力比較弱的系統(tǒng)，應(yīng)避免在pH2-11以外的溶液中長期使用.73葡聚糖凝膠商品名:Sephadex型號:G-100，150，200型號含義:每克干凝膠吸水量X10特點:理化性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱耐堿不耐酸，網(wǎng)孔小74配基的固相化方法：固相化技術(shù)：將配基以共價鍵連接于不溶于水的固相基質(zhì)上制成固相化吸附劑方法有：載體結(jié)合法物理吸附法交聯(lián)法包埋法C

配基固相化752.親和層析分離的基本操作尋找能被分離分子識別和可逆結(jié)合的專一性物質(zhì)——配基把配基共價結(jié)合到層析介質(zhì)（載體）上，即把配基固定化把載體-配基復(fù)合物灌裝在層析柱內(nèi)做成親和柱上樣親和——洗滌雜質(zhì)——洗脫收集親和分子（配體）——親和柱再生76洗脫

1.洗脫后可能出現(xiàn)的洗脫圖譜酶與雜質(zhì)一起流出

酶與雜質(zhì)沒有完全分離

酶與雜質(zhì)完全分開77782.洗脫方法

非特異性洗脫:改變緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)或溫度使物質(zhì)構(gòu)象改變，濃縮、洗脫后立即中和稀釋或透析，使蛋白質(zhì)迅速恢復(fù)到天然結(jié)構(gòu)

特異性洗脫：再次利用生物學(xué)特異性只洗脫和配基專一作用的酶，不洗脫由于非專一吸附上去的雜蛋白79親和層析拄可在一次層析后用大量洗脫劑連續(xù)洗滌，然后再用平衡緩沖液平衡，經(jīng)處理后的層析柱能再次使用。再生80Figure1.

Loadingaffinitycolumn.81Figure2.Proteinssievethroughmatrixofaffinitybeads.82Figure3.

Proteinsinteractwithaffinityligandwithsomebindinglooselyandotherstightly.83Figure4.

Washoffproteinsthatdonotbind.84Figure5.