(7)病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷與防治課件

病毒感染的診斷

病毒感染的實(shí)驗(yàn)室檢查包括病毒分離與鑒定、病毒核酸與抗原的直接檢出以及特異性抗體的檢測(cè)。臨床醫(yī)師根據(jù)流行病學(xué)資料，疾病的癥狀與體征綜合判斷可能為何種病毒感染，留取適宜的標(biāo)本送檢。一、檢材的采集與送檢病毒性疾病通常采集血液、鼻咽分泌液、痰、糞便、腦脊液、皰疹內(nèi)容物等。供送檢的標(biāo)本的要求：盡早采取、部位適宜、冷藏速送（二）部位適宜由感染部位采取，如呼吸道感染采取鼻咽洗漱液或咯痰；腸道感染采取糞便；腦內(nèi)感染采取腦脊液；皮膚感染采取病灶組織；有病毒血癥時(shí)采取血液。（三）冷藏速送病毒離活體后在室溫下很易死亡，故采得檢材應(yīng)盡快送檢。若距離實(shí)驗(yàn)室較遠(yuǎn)，應(yīng)將檢材放入裝有冰塊或干冰的容器內(nèi)送檢。污染檢材，如鼻咽分泌液、糞便等應(yīng)加入青霉素、鏈霉素或慶大毒素等，以免雜菌污染細(xì)胞或雞胚，而影響病毒分離。二、病毒的分離與鑒定（一）病毒的分離

病毒分離的一般程序是：檢驗(yàn)標(biāo)本→殺滅雜菌(青、鏈霉素)→接種易感的動(dòng)物→出現(xiàn)病狀

→鑒定病毒種型(血清學(xué)方法)雞胚→病變或死亡細(xì)胞培養(yǎng)→細(xì)胞病變無(wú)菌標(biāo)本(腦脊液、血液、血漿、血清)可直接接種細(xì)胞、動(dòng)物、雞胚；無(wú)菌組織塊經(jīng)培養(yǎng)液洗液洗滌后制成10～20%懸液離心后，取上清接種；咽洗液、糞便、尿、感染組織或昆蟲(chóng)等污染標(biāo)本在接種前先用抗生素處理，殺死雜菌。原代細(xì)胞培養(yǎng)(Primarycellculture)二倍體細(xì)胞培養(yǎng)(Diploidcellcultune)傳代細(xì)胞培養(yǎng)(Continouscellculture)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（Lymphocyteculture）二倍體細(xì)胞培養(yǎng)(Diploidcellcultune)

原代細(xì)胞只能傳2-3代細(xì)胞就退化，在多數(shù)細(xì)胞退化時(shí)，少數(shù)細(xì)胞能繼續(xù)傳下來(lái)，且保持染色體數(shù)為二倍體，稱(chēng)為二倍體細(xì)胞。二倍體細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，并可傳50代保持二倍體特征，通常是胚胎組織的成纖維細(xì)胞。傳代細(xì)胞培養(yǎng)(Continouscellculture)

通常是由癌細(xì)胞或二倍體細(xì)胞突變而來(lái)染色體數(shù)為非整倍體，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，可無(wú)限傳代，在液氮中能長(zhǎng)期保存。目前廣泛用于病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷工作，根據(jù)病毒對(duì)細(xì)胞的親嗜性，選擇敏感的細(xì)胞系使用。淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（Lymphocyteculture）

正常成熟的淋巴細(xì)胞不經(jīng)特殊處理不能在體外傳代培養(yǎng)。然而EBV感染的B淋巴細(xì)胞卻能在體外持續(xù)傳代，這是病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的例證，也是分離出EBV的標(biāo)志。T淋巴細(xì)胞在加入T細(xì)胞生長(zhǎng)因子（IL-2）后可在體外培養(yǎng)，為研究人類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒（HIV、HTLV）提供了條件，HIV在T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖形成多核巨細(xì)胞。2．動(dòng)物試驗(yàn)

這是最原始的病毒分離培養(yǎng)方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接種途徑根據(jù)各病毒對(duì)組織的親嗜性而定，可接種鼻內(nèi)、皮內(nèi)、腦內(nèi)、皮下、腹腔或靜脈，例如嗜神經(jīng)病毒（腦炎病毒）接種鼠腦內(nèi)，柯薩奇病毒接種乳鼠（一周齡）腹腔或腦內(nèi)。接種后逐日觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病情況，如有死亡，則取病變組織剪碎，研磨均勻，制成懸液，繼續(xù)傳代，并作鑒定。3．雞胚培養(yǎng)

用受精孵化的活雞胚培養(yǎng)病毒比用動(dòng)物更加經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便。根據(jù)病毒的特性可分別接種在雞胚絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黃囊、腦內(nèi)或靜脈內(nèi)，如有病毒增殖，則雞胚發(fā)生異常變化或羊水、尿囊液出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分離培養(yǎng)；但很多病毒在雞胚中不生長(zhǎng)。（二）分離病毒的鑒定1．病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指征2．病毒感染性的定量測(cè)定3．病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察4．血清學(xué)鑒定（1）細(xì)胞病變作用(Cytopathogeniceffect,CPE)

病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖引起細(xì)胞退形性病變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、死亡和脫落。某些病毒產(chǎn)生特征性CPE，普通光學(xué)倒置顯微鏡下可觀察上述細(xì)胞病變，結(jié)合臨床表現(xiàn)可做出預(yù)測(cè)性診斷。（2）紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象（Hemadsorptionphenomenon）

流感病毒和某些副粘病毒感染細(xì)胞后24-48小時(shí)，以細(xì)胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動(dòng)物及人的紅細(xì)胞，發(fā)生紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。若加入相應(yīng)的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的發(fā)生，稱(chēng)為紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)。這一現(xiàn)象不僅可作為這類(lèi)病毒增殖的指征，還可作為初步鑒定。2．病毒感染性的定量測(cè)定（1）空斑形成單位(Plaque-formingunit,PFU)測(cè)定（2）50%致死量（LD50）或50%組織細(xì)胞感染量（TCID50）的測(cè)定（1）空斑形成單位(Plaque-formingunit,PFU)測(cè)定這是一種測(cè)定病毒感染性比較準(zhǔn)確的方法。將適當(dāng)濃度的病毒懸液接種到生長(zhǎng)單層細(xì)胞的玻璃平皿或扁瓶中，當(dāng)病毒吸附于細(xì)胞上后，再在其上復(fù)蓋一層溶化的半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂層，待凝固后，孵育培養(yǎng)。（2）50%致死量（LD50）或50%組織細(xì)胞感染量（TCID50）的測(cè)定本法可估計(jì)所含病毒的感染量。方法是測(cè)定病毒感染雞胚，易感動(dòng)物或組織培養(yǎng)后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸液作10倍連續(xù)稀釋?zhuān)臃N于上述雞胚，易感動(dòng)物或組織培養(yǎng)中，經(jīng)一定時(shí)間后，觀察細(xì)胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動(dòng)物發(fā)病而死亡等，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出50%感染量或50%組織細(xì)胞感染量，可獲得比較準(zhǔn)確的病毒感染性滴度。3．病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察

病毒懸液經(jīng)高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負(fù)染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒，根據(jù)大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學(xué)技術(shù)分析病毒核酸組成、基因組織構(gòu)、序列同源性比較加以鑒定。4．血清學(xué)鑒定

用已知的診斷血清來(lái)鑒定。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可鑒定病毒科屬；中和試驗(yàn)或血凝搗蛋制試驗(yàn)可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀，檢材來(lái)源及流行季節(jié)等加以綜合分析，并應(yīng)注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆，須用病人急性期與恢復(fù)期雙份血清作血清學(xué)試驗(yàn)，血清抗體滴度有≥4倍以上增高，才有意義。1．核酸雜交（Nucleicacidhybridization）臨床病毒學(xué)中快速診斷方法通常是檢測(cè)標(biāo)本中的病毒抗原，然而核酸分子雜交具有高度敏感性和特異性，斑點(diǎn)雜交(Dothybridization)廣泛用于檢測(cè)呼吸道標(biāo)本，尿標(biāo)本中的病毒核酸。標(biāo)本滴加到硝酸纖維素膜上，病毒DNA結(jié)合到膜上，在原位進(jìn)行堿變性處理后，有放射標(biāo)記的已知病毒DNA片段雜并，兩條單股核酸按堿基到補(bǔ)原則結(jié)合成雙股，經(jīng)放射自顯影，陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)斑點(diǎn)狀雜交信號(hào)。含輪狀病毒的糞便標(biāo)本經(jīng)熱變性處理，點(diǎn)到膜上，使用輪狀病毒體外轉(zhuǎn)錄的放射標(biāo)記探針做斑點(diǎn)雜交，敏感性高于ELISA（酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定enzymelinkedimmunosorbentassay）。腸道病毒也可用互補(bǔ)的DNA探針做斑點(diǎn)雜交。目前核酸分子雜交不但用來(lái)檢測(cè)急性病人標(biāo)本中的病毒DNA，也用于檢測(cè)不易分離培養(yǎng)的慢性感染、潛伏感染、整合感染病人標(biāo)本中的病毒DNA。2．多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction,PCR)一種體外基因擴(kuò)增法。將擴(kuò)增的基因經(jīng)瓊脂糖電泳，可見(jiàn)到溴化乙錠染色的核酸條帶，擴(kuò)增片段的大小取決于兩引物的間距。此法較核酸雜交敏感、快速，已用于肝炎、AIDS、皰疹病毒感染診斷，尤其適用于不易分離培養(yǎng)及含量極少的病毒標(biāo)本，有較大應(yīng)用前景。（二）直接檢測(cè)病毒抗原1．免疫熒光（IF）技術(shù)如前所述IF可用于細(xì)胞培養(yǎng)病毒的鑒定，也適用檢測(cè)臨床標(biāo)本中病毒抗原，具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)。直接免疫熒光技術(shù)是用熒光素直接標(biāo)記特異性抗體，檢測(cè)病毒抗原；間接免疫熒光技術(shù)是先用特異性抗體與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的抗體與特異性抗體結(jié)合，從而間接識(shí)別抗原。2．免疫酶法（IEA）原理與應(yīng)用范圍同免疫熒光技術(shù)，IEA是用酶（通常是過(guò)氧化物酶）取代熒光素標(biāo)記抗體，酶催化底物形成有色產(chǎn)物，在普通光學(xué)顯微鏡下清晰可見(jiàn)，不需熒光顯微鏡，便于推廣使用。3．放射免疫測(cè)定法（RIA）有競(jìng)爭(zhēng)RIA和因相RIA二種方法。競(jìng)急RIA是同位素標(biāo)記的已知抗原與標(biāo)本中未標(biāo)記的待檢抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合特異性抗體的試驗(yàn)，將形成的復(fù)合物分離出來(lái)，用放射免疫檢測(cè)儀測(cè)定放射活性，同時(shí)與系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，確定出待檢抗原的濃度。因相RIA是用特異性抗體包被因相以捕獲標(biāo)本中的抗原，然后加入放射性標(biāo)記的特異性抗體與抗原結(jié)合，測(cè)定放射活性，得知抗原的量。RIA是最敏感的方法，已用于測(cè)定糞便中甲肝病毒、輪狀病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。4．酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）先將特異性抗體包被（吸附）到塑料微培板孔中以捕捉標(biāo)本中相應(yīng)抗原，然后加入酶標(biāo)特異性抗體，相應(yīng)抗原被夾在抗體之間，當(dāng)加入酶的底物后顯色，顯色程度直接反映了標(biāo)本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA，又不接觸放射性物質(zhì)，已被多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用。此外，對(duì)難以分離培養(yǎng)，形態(tài)特殊且病毒數(shù)量較多的標(biāo)本，可用電鏡或免疫電鏡法直接觀察，是一種快速診斷與鑒定病毒的方法，如輪狀病毒、乙肝病毒。四、特異性抗體的檢測(cè)特異性抗體的檢測(cè)病毒感染后通常誘發(fā)針對(duì)病毒一種或多種抗原免疫應(yīng)答，特異性抗體效價(jià)升高或lgM抗體出現(xiàn)有輔助臨床診斷的價(jià)值。（一）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF）（二）中和試驗(yàn)（NT）（三）血凝抑制試驗(yàn)（Hemagglutinationinhibitiontest,HIT）（四）lgM捕捉（一）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF）

CF分二個(gè)階段：1.抗原與抗體（一個(gè)為已知，一個(gè)為待檢）混合，加入定量補(bǔ)體，若抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，則補(bǔ)體被消耗；2.在上述混合物中加入溶血素致敏的綿羊紅細(xì)胞，若補(bǔ)本已與抗原抗體復(fù)合物完全結(jié)合，沒(méi)有剩補(bǔ)體存在，那么綿羊紅細(xì)胞不會(huì)溶血，結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明待檢標(biāo)本中有特異性存在，出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)血清標(biāo)本最高稀釋度為抗體的效價(jià)。反之為陰性結(jié)果。由于補(bǔ)體結(jié)合抗體產(chǎn)生早，消失快，適于診斷病毒近期感染。（二）中和試驗(yàn)（NT）在活體或活細(xì)胞內(nèi)測(cè)定病毒被特異性抗體中和、而失去致病力的試驗(yàn)。試驗(yàn)時(shí)：①須先測(cè)出病毒的半數(shù)致死量（LD50）或半數(shù)感染量（ID50）；②隨即取活病毒與被試血清按不同比例混合，放置1～2小時(shí)讓其充分中和；③將病毒與血清混合液注入各組動(dòng)物、雞胚或組織細(xì)胞培養(yǎng)管內(nèi)培養(yǎng)；④根據(jù)動(dòng)物、雞胚死亡數(shù)或細(xì)胞病變的管數(shù)，計(jì)算出百分比（%），然后再計(jì)算這些試驗(yàn)對(duì)象中的半數(shù)免于死亡或免于致病所需要的最少量血清（或最大量的病毒），就是該血清的中和抗體效價(jià)（稱(chēng)為50%終點(diǎn)的中和效價(jià)）。診斷病毒性疾病時(shí)，須取病人雙份血清同時(shí)做對(duì)比試驗(yàn)，病后血清的中和抗體效價(jià)也必須超過(guò)病初血清4倍以上，才能確診。用此法鑒定病毒時(shí)，須將病毒分別與免疫血清及血清正常血清（對(duì)照）混合做對(duì)比試驗(yàn)，免疫血清比正常血清多中和50～100倍劑量的病毒，才能斷定是該病毒。病毒中和抗體的特異性高，持續(xù)時(shí)間久，以往受顯性或隱性感染后，血中可長(zhǎng)期存在中和抗體，所以適用于流行病學(xué)調(diào)查或人群免疫水平研究，但因試驗(yàn)方法繁雜，耗用動(dòng)物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)較多，故一般不作常規(guī)使用。（三）血凝抑制試驗(yàn)（Hemagglutinationinhibitiontest,HIT）某些病毒（流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、腦炎病毒等）能凝集紅細(xì)胞，而抗體與這些病毒結(jié)合后卻能阻止它們的凝集，若雙份血清有≥4倍以上滴度增高，也可用于診斷這類(lèi)病毒感染。本法簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、特異性高，常用于流行病學(xué)調(diào)查等。（四）lgM捕捉特異性lgM出現(xiàn)于病毒感染的早期或病毒感染的活動(dòng)期，因此可從急性期病人單份血清中檢出特異性lgM，這是病毒感染實(shí)驗(yàn)室早期診斷的可靠方法?，F(xiàn)已廣泛用于病毒病的早期診斷。在先天性感染中，lgM檢測(cè)有特殊意義，因lgM不能通過(guò)胎盤(pán)，新生兒血清中發(fā)現(xiàn)抗病毒lgM提示為宮內(nèi)感染。病毒感染的防治原則一、免疫預(yù)防1．減毒活病毒疫苗（Liveattenuatedvirusvaccines）

2．滅活病毒疫苗(Killedvirusvaccines)3．亞單位疫苗(Subunitvaccines)4．基因工程疫苗1．減毒活病毒疫苗（Liveattenuatedvirusvaccines）選用抗原性與野毒株一致而穩(wěn)定無(wú)毒或顯著減毒的活病毒突變株做為疫苗?？珊Y選自然減毒株，或在多種宿主中連續(xù)傳代培養(yǎng)誘導(dǎo)出減毒株。接種活病毒疫苗近似自然感染，在宿主中可繁殖，僅接種一次便可較長(zhǎng)時(shí)間刺激抗體產(chǎn)生及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并可產(chǎn)生局部抗體。活疫苗的不利之處在于：①在接種者體內(nèi)增殖中有恢復(fù)毒力的潛在危險(xiǎn)性；②野毒株感染可干擾疫苗株的免疫效果；③老年人、免疫缺陷者不宜接種；④保存期、有效期有限。2．滅活病毒疫苗(Killedvirusvaccines)將純化的病毒用甲醛處理滅活其感染性，而不損傷病毒結(jié)構(gòu)蛋白，做為一種疫苗。滅活病毒疫苗是完整的病毒，可誘生循環(huán)抗體，獲得一定程度的免疫力。應(yīng)注意的是：①制備中確保無(wú)殘留的活病毒；②加強(qiáng)免疫或后續(xù)病毒感染時(shí)可能出現(xiàn)對(duì)外源性蛋白質(zhì)的超敏反應(yīng)；③對(duì)呼吸道、消化道感染的病毒病預(yù)防效果不佳，不能產(chǎn)生足夠的局部免疫力；④細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答較差。3．亞單位疫苗(Subunitvaccines)用化學(xué)試劑裂解病毒，提取囊膜或衣殼的蛋白質(zhì)亞單位，除去核酸而制成亞單位疫苗。目前用基因克隆到原核或真核表達(dá)載體中，并在原核或真核細(xì)胞中得到表達(dá)，經(jīng)純化制備出亞單位疫苗。4.基因工程疫苗二、藥物治療（一）化學(xué)療劑

病毒性疾病目前尚缺少特效治療藥物，原因是病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖，凡能殺死病毒的藥物，同時(shí)多對(duì)宿主細(xì)胞也有損害。隨著分子病毒學(xué)研究的進(jìn)展，目前能對(duì)藥物抑制作用的確切靶位作出鑒定。理論上，病毒復(fù)制的任何環(huán)節(jié)均是抗病毒治療的作用靶位?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些藥物有治療價(jià)值，允許使用的有無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷，金剛胺、碘苷、三氟尿苷、腺苷、病毒唑、疊氮胸苷等，使用范圍有一定局限性，且或多或少有細(xì)胞毒性作用。1．核苷類(lèi)似物無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷（Acycloguanosine,Acyclovir）為脫氧鳥(niǎo)苷的類(lèi)似物，該藥被病毒編碼的胸苷激酶（TK）磷酸化，借助病毒DNA多聚酶，摻入病毒DNA中，阻斷DNA鏈的延伸。對(duì)編碼TK的單純皰疹，水痘帶狀皰疹病毒感染有治療作用，而對(duì)不編碼TK的巨細(xì)胞病毒、EB病毒不敏感。磷酸化的無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷對(duì)宿主細(xì)胞DNA多聚酶親和力較低，較少影響宿主細(xì)胞。已用于治療原發(fā)性皰疹性角膜炎，但對(duì)復(fù)發(fā)性皰疹損傷治療效不佳；全身用藥可預(yù)防潛伏感染的復(fù)燃，對(duì)處于免疫抑制狀態(tài)病人的活動(dòng)性皰疹感染也有治療作用。此外，與無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷類(lèi)似的甲基鳥(niǎo)嘌呤衍生物丙氧鳥(niǎo)苷(Ganciclovir,dihydroxypropoxymethylguanine,DHPG)，體外實(shí)驗(yàn)表明對(duì)巨細(xì)胞病毒有明顯抑制作用，在巨細(xì)胞病毒嚴(yán)重感染的病人取得了較好的效果，機(jī)理不詳。疊氮胸苷(Azidodeoxythymidine,AZT)為合成胸腺嘧啶核苷的類(lèi)似物，阻斷前病毒DNA合成，從而抑HIV的復(fù)制。HIV逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)該藥的敏感性較細(xì)胞DNA多聚酶高100倍，對(duì)AIDS病人有治療作用，但該藥有較多毒付作用，包括骨髓抑制，停藥后可恢復(fù)。阿糖腺苷(Adeninearabinoside,ara-A)為腺嘌呤的衍生物，作用機(jī)理不詳，可能是抑制病毒多聚酶，阻斷病毒DNA合成對(duì)細(xì)胞的毒性較阿糖胞苷小。用于單純皰疹性角膜炎的局部治療，靜脈給藥對(duì)單純皰疹和水痘帶狀皰疹感染療效明顯，皰疹性腦炎如能早期診斷早期使用ara-A