植物多糖分離純化方案

關(guān)于植物多糖分離純化方案第1頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本植物多糖植物多糖，又稱植物多聚糖，是植物細(xì)胞代謝產(chǎn)生的聚合度超過10個(gè)的聚糖。是由許多相同或不同的單糖以α一或β一糖苷鍵所組成的化合物，普遍存在于自然界植物體中，包括淀粉、纖維素、多聚糖、果膠等。由于植物多糖的來源廣泛，不同種的植物多糖的分子構(gòu)成及分子量各不相同。有些植物多糖如淀粉、纖維素、果膠，早已成為人們?nèi)粘Ｉ钪械闹匾M成部分。第2頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五多糖的物化性質(zhì)

分子結(jié)構(gòu)：多糖在溶液狀態(tài)下有著高級(jí)結(jié)構(gòu)，代表活性狀態(tài)。不同植物提取的多糖，一級(jí)結(jié)構(gòu)上有很太差異，采用酸解、色譜、質(zhì)譜、紅外光譜、核磁共振等手段，可以確定單糖的組成及取代基團(tuán)。

B.

溶解性：難溶于冷水，在熱水或堿液中可溶。不溶于丙酮、乙醇、正丁酵、乙醚、醋酸乙酯等有機(jī)溶劑

C.

熱穩(wěn)定性：熱不穩(wěn)定，當(dāng)溫度大于4O℃

時(shí)，分解加快。

D.

酸堿穩(wěn)定性：pH小于5時(shí)開始降解，小于3時(shí)有20％

降解；大于7時(shí)氧化加快。

E.

化學(xué)性質(zhì)：與硫酸蒽酮、硫酸苯酚反應(yīng)陽性，常用于定量分析；可與部分有機(jī)、無機(jī)離子絡(luò)合，如與十六烷基三溴化銨(CTAB)、氫氧化鋇等結(jié)合沉淀第3頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五色譜層析色譜分析法、層析法，是一種分離和分析方法，現(xiàn)代生物企業(yè)生產(chǎn)過程中的核心技術(shù)之一。在分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用。色譜法利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動(dòng)相對(duì)固定相中的混合物進(jìn)行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會(huì)以不同的速度沿固定相移動(dòng)，最終達(dá)到分離的效果。第4頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本粗多糖提取將所用的植物制品粉碎、過篩、烘干加20倍體積蒸餾水，60~80℃水浴回流提取4~6h離心(5000×g，10min)【取兩滴上清液，稀釋后加入4ml

0．1％蒽酮．硫酸溶液，沸水浴7min，呈現(xiàn)綠色，說明其中含有糖。再取上清液滴于濾紙上噴0．25％茚三酮試液，加熱后立即呈紫紅色，說明其中含有蛋白質(zhì)，需要除蛋白。】取上清，70°C減壓濃縮加3倍體積95％乙醇沉淀，至醇含量在80％以上，不斷攪拌離心收集沉淀，將沉淀置于布氏漏斗中，分別用無水甲醇、丙醇和乙醚洗滌，以除去水分和雜質(zhì)冷凍干燥，得粗多糖第5頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本植物多糖的提取多糖不同的植物中，有著不同的含量和貯存位置，因此針對(duì)不同的植物有著不同的分離方法。第6頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五生物酶提取法酸堿提法點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本部分沉淀法溶劑提取法甲醇分級(jí)沉淀法季銨鹽沉淀法水提法金屬鹽沉淀法第7頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五水提法水對(duì)植物組織的穿透力強(qiáng)，提取效率高，在生產(chǎn)上使用安全、經(jīng)濟(jì)。用水作溶劑來提取多糖時(shí)，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取采用熱水浸提法，該法所得多糖提取液可直接或離心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)，沉淀提純多糖；但由于不同性質(zhì)或不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖沉淀所需乙醇濃度不同，它也可以用于樣品中不同多糖組分的分級(jí)分離；還可按多糖不同性質(zhì)在粗分階段利用混合溶劑提取法對(duì)植物中不同的多糖進(jìn)行分離；其中，以乙醇沉淀最為普遍。但以根莖為主的植物體,細(xì)胞壁多糖含量高,熱水直接提取率不高。此時(shí)為破壞細(xì)胞壁,增加多糖的溶出，有兩種處理方法:一為酶解,二為弱堿溶解。第8頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五水提法加水比對(duì)多糖提取的影響第9頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五酸堿提法有些多糖適合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有優(yōu)勢(shì)，目前報(bào)道的并不多。而且即使有優(yōu)勢(shì)，在操作上還應(yīng)嚴(yán)格控制酸度，因?yàn)樗嵝詶l件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂。

有些多糖在堿液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀堿多位為0．1mol／L氫氧化鈉、氫氧化鉀，為防止多糖降解，常通以氮?dú)饣蚣尤肱饸浠c或硼氫化鉀。同樣，堿提優(yōu)勢(shì)也是因多糖類的不同而異。與酸提類似，堿提中堿的濃度也應(yīng)得到有效控制，因?yàn)橛行┒嗵窃趬A性較強(qiáng)時(shí)會(huì)水解。另外，稀酸、稀堿提取液應(yīng)迅速中和或迅速透析，濃縮與醇析而獲得多糖沉淀。第10頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五生物酶提取法酶技術(shù)是近年來廣泛應(yīng)用到有效成份提取中的一項(xiàng)生物技術(shù)，在多糖的提取過程中，使用酶可降低提取條件，在比較溫和的條件中分解植物組織，加速多糖的釋放或提取。此外，使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等的產(chǎn)物，常用的酶有蛋白酶，纖維素酶，果膠酶等。第11頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五金屬鹽沉淀法提取液中加入中性醋酸鉛可沉淀去除大部分酸性、酚性的雜質(zhì)（如有機(jī)酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、樹脂酸、黃酮、蒽醌、鞣質(zhì)等），包括酸性多糖。而用堿式醋酸鉛對(duì)多糖的沉淀就更為完全。除去雜質(zhì)后的母液用H2S脫鹽后，單糖、低聚糖和水溶性較大的中性苷類仍保留在濾液中。鉛鹽沉淀法除去雜質(zhì)比較完全，母液脫鉛后可用于單糖和低聚糖的定量，也可用銅鹽沉淀法提取多糖。第12頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五季銨鹽沉淀法季銨類氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉淀，常用于分離酸性多糖。季銨氫氧化物與中性多糖不生成沉淀，但當(dāng)調(diào)高PH，使某些OH基解離，或加硼酸緩沖液增高糖的酸度，中性糖也能被沉淀。利用季銨氫氧化物在酸性、中性、微堿性、堿性中分級(jí)沉淀可以分離多糖。第13頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五甲醇分級(jí)沉淀法常用的分級(jí)沉淀法是在混合多糖的濃水溶液中（常在PH=7時(shí)），逐步加入乙醇，收集不同醇濃度下析出的沉淀。一般各次沉淀需經(jīng)反復(fù)溶解后，再醇析，直到測(cè)得的物理常數(shù)恒定，最常用的是旋光度測(cè)定和電泳檢查。用分級(jí)沉淀法得到的多糖，常雜有較多的蛋白質(zhì)，必須予以去除。一般選擇那些使蛋白質(zhì)沉淀而使多糖不沉淀的試劑來處理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必須處理時(shí)間短，溫度低，避免多糖降解。第14頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五層析分離純化溶于最小體積水中，用Sevage法，5：1氯仿、正丁醇溶液以3OOOr／min離心20min脫蛋白考馬斯亮藍(lán)G-250法，重復(fù)五次，直至紫外分析無280mm、260mm雜蛋白和核酸吸收峰為止檢測(cè)至無蛋白質(zhì)被測(cè)出對(duì)流水透析3d，真空冷凍干燥溶于一定量蒸餾水中，離心(8000Xg，5min)，取上清在陰離子交換纖維素DE．52柱(4．0cmx25cm)上層析。先以多于一個(gè)柱體積的蒸餾水洗脫，再用0～4mol/LNaCI(250mL／250mL)線性梯度洗脫，流速為24mL/h收集l管，葸酮一硫酸法檢測(cè)，得到一水洗脫組分。收集該組分，蒸餾水透析，冷凍干燥重復(fù)加蒸餾水離心層析，再洗脫透析，冷凍干燥得較純粗品第15頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五在多糖提取物中，常會(huì)有無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)、色素及小分子物質(zhì)等雜質(zhì)，必須分別除去．一般是先脫除非多糖組分，再對(duì)多糖組分進(jìn)行分級(jí)．A.

除蛋白

蛋白的分離方法較多，如Sevag法、三氯乙酸沉淀法、ZnS04沉淀法、酶法等。Sevag法為實(shí)驗(yàn)常用法，諺法以正丁醇與氯仿按4：l混合，再行革取。蛋白酶除蛋白是目前認(rèn)為較好方法，將蛋白水解，再透析除去。B.

脫色

植物多糖提取物中含有酚類化合物而使其顏色較深，可用吸附劑(纖維素、硅藻土、活性炭等)、離子交換柱(DEAE一纖維素)、氧化劑(H2O2)等脫除?；钚蕴勘缺砻娣e大，吸附能力強(qiáng)，在進(jìn)行當(dāng)歸多糖的提取時(shí)只向多糖液中加入了0．1％左右的活性炭，煮沸后濾過即完成了脫色操作。此法成本低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)。C.

除小分子雜質(zhì)

小分子雜質(zhì)如低聚寡糖的殘留往往影響多糖的生物活性，需要進(jìn)一步脫除，提高純度。傳統(tǒng)的方法是透析法，該法操作簡(jiǎn)單、技術(shù)成熟，但周期長，往往需要2一3天，常溫下操作有可能造成多糖的霉變，必要時(shí)需加入少量防腐劑或需在低溫條件下進(jìn)行。隨著膜分離技術(shù)的發(fā)展，纖維濾器透析法已經(jīng)發(fā)展起來了，它利用不同孔徑的膜使大小不同的分子分級(jí)，這種方式可縮短生產(chǎn)周期，而且條件溫和，無疑是多糖脫除雜質(zhì)的一條新途徑。多糖提取物的分離純化第16頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五D.

多糖的分級(jí)純化

采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分級(jí)的方法可達(dá)到純化的目的．可按溶解性不同進(jìn)行分級(jí)、按分子大小和形狀分級(jí)(如分級(jí)沉淀、超濾、分子篩、層析等)，也可按分子所帶基團(tuán)的性質(zhì)分級(jí)．

a)

按溶解性不同分離

a.1分步沉淀法

分步沉淀法是根據(jù)不同多糖在不同濃度低級(jí)醇、酮中具有不同溶解度的性質(zhì)，從小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮進(jìn)行分步沉淀．

a.2鹽析法

鹽析法是根據(jù)不同多糖在不同鹽濃度中溶解度不同而將其分離的一種方法。常用的鹽析劑有氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等，其中以硫酸銨最佳。

多糖提取物的分離純化第17頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五b)

柱層析法

b.1凝膠柱層析法凝膠柱層析法常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑，從而使不同大小的多糖分子得到分離純化，但不適宜粘多糖的分離。b.2纖維素陰離子交換劑柱層析法

纖維素陰離子交換劑柱層析法常用的交換劑為DEAE一纖維素和ECTEOLA一纖維素，分類硼砂型和堿型兩種，洗脫劑可用不同濃度堿溶液、硼砂溶液、鹽溶液，其優(yōu)點(diǎn)可吸附雜質(zhì)、純化多糖，并適用于分離各種酸性、中性多糖和粘多糖。如百合多糖、北沙參多糖、太子參多糖等。

b.3活性炭柱層析法

活性炭吸附量大、效率高，是分離水溶性物質(zhì)的常用吸附劑。柱層析時(shí)活性炭中常拌入等量的硅藻土作稀釋劑，以增加溶液的流速。糖溶液上柱后先用水洗脫無機(jī)鹽、單糖等再依次增加乙醇濃度進(jìn)行洗脫。多糖提取物的分離純化第18頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五色譜法鑒定凝膠色譜法鑒定純度

多糖取2mg溶于水，上SephadexG一200(15mmX80cm)凝膠柱層析，以蒸餾水洗脫，體積流量lml／10min，按2ml每管分部收集，洗脫液用0．1％蒽酮一硫酸法顯色，紫外測(cè)定吸光度值，依吸光度對(duì)洗脫液體積作圖。紙色譜(PC)初步結(jié)構(gòu)鑒定

酸水解：稱取l0mg多糖RP置25ml具塞試管中，加入6％硫酸3ml，封管，在120°C烘箱中水解6h，用CaCO3中和至中性，過濾，用蒸餾水洗滌濾渣3～4次，每次3～5ml，濾液濃縮后點(diǎn)樣于層析紙，并用標(biāo)準(zhǔn)單糖葡萄糖、D一半乳糖、D一阿拉伯糖、D一木糖、D一甘露糖作對(duì)照，展開劑為乙酸乙酯一啶．冰乙酸．水(5：5：1：2)，顯色劑為苯胺．鄰苯二甲酸，在1l0噴霧顯色10min。第19頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本案例凝膠滲透色譜法表征廣東蟲草多糖柱層析分離純化第20頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五廣東蟲草多糖的制備廣東蟲草菌絲體干品,經(jīng)粉碎、過篩(100目)后得菌絲體粉末。稱取該粉末20.0g,先后用用石油醚、無水乙醇回流脫脂,所得殘?jiān)贸暡ㄝo助提取其中的水溶性多糖,提取條件為:料液比(g/mL)1∶20,水浴溫度60°C,提取時(shí)間30min/次,提取3次。合并提取液,蒸發(fā)濃縮后用717陰離子交換樹脂脫色,Sevage法除蛋白(6次),透析24h。之后向多糖透析液中加入無水乙醇,調(diào)節(jié)醇濃度(體積分?jǐn)?shù))為75%,冰箱中醇沉過夜。醇沉物依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌一次,真空干燥至恒質(zhì)量,即得廣東蟲草多糖。第21頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五蟲草多糖的柱層析分離純化柱層析路徑1分離純化CGP按圖1所示,流程對(duì)CGP進(jìn)行分離純化.DEAESephadexA-50裝柱(1.6cm×30cm),0.02mol/LPBS平衡后上樣CGP30mg,進(jìn)行洗脫收集,流速0.3mL/min,每15min收集一管;SephadexG-200裝柱(1.6cm×40cm),0.02mol/LPBS平衡后上樣CGP-s110mg,進(jìn)一步分離純化,流速0.2mL/min,每15min收集一管。第22頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五柱層析路徑2分離純化CGP按圖2所示流程對(duì)CGP進(jìn)行分離純化。DEAECellulose裝柱(1.6cm×40cm),0.02mol/LPBS平衡后上樣CGP30mg,進(jìn)行洗脫收集。流速1.0mL/min,每10min收集一管;用過的DEAESephadexA-50柱經(jīng)再生處理后用0.02mol/LPBS平衡,完畢后上樣CGP-c110mg,進(jìn)一步分離純化,流速0.2mL/min,每15min收集一管。第23頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五分部收集及多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法測(cè)定每管收集洗脫液的吸光值,并以每管洗脫液的吸光值為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的管數(shù)為橫坐標(biāo),繪制蟲草多糖各柱層析過程的蟲草多糖洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線合并每個(gè)波峰相應(yīng)波寬長度的洗脫管數(shù),定容后測(cè)定多糖含量。第24頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五

疑難疑點(diǎn)點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本多糖制備過程中蛋白質(zhì)的脫除是目前分離純化多糖的難點(diǎn)。Sevag法需要消耗大量的有機(jī)溶劑，且操作煩瑣；三氟三氯乙烷的沸點(diǎn)較低(bp56℃)易揮發(fā)，不宜大量應(yīng)用；三氯乙酸可引起多糖的降解，從而影響其生理活性；酶價(jià)格昂貴，不適合工業(yè)化生產(chǎn)?？梢越梃b其它蛋白質(zhì)脫除的方法，例如用天然澄清劑能簡(jiǎn)化提取工藝，提高多糖純度。

脫色也是多糖提取純化過程中面臨的一個(gè)難題。活性炭會(huì)吸附多糖而造成多糖的損失；H2O2氧化脫色容易引起有些多糖的降解第25頁，共28頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)59分，星期五我國對(duì)多糖的研究起步較晚，但近年來的工作取得了較大的進(jìn)展，愈來愈多的多糖被發(fā)現(xiàn)．并證實(shí)它們具有復(fù)雜、廣泛的生物活性和功能．隨著對(duì)多糖生物活性的深入研究，多糖的生物活性機(jī)理，功效因子會(huì)更加明確，它的應(yīng)用領(lǐng)域也將會(huì)更加拓寬．然而，由于多糖本身結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，種類繁多，其結(jié)構(gòu)測(cè)定和分離純化有很大的難度