張正昊答辯幻燈-PPT幻燈片

資料與方法3討論5小結

6前言

12結果4研究目的

前言隨著基因靶向藥物、造血干細胞移植等治療方法的廣泛開展，白血病患者的長期生存率大幅提高，但是仍然有相當大的一部分患者面臨著復發(fā)的危險。

微小殘留病（MRD）是指白血病患者在治療達到完全緩解后，患者血液細胞計數正常，用形態(tài)學方法在骨髓和血液中都不能檢測出白血病細胞，但是用更敏感方法能檢測出的白血病細胞。

MRD緩解后患者復發(fā)常規(guī)細胞遺傳學雖然也能檢測出染色體的異常結構，但檢測速度慢檢測靈敏性低對于復雜核型分析效果差熒光原位雜交(FISH)技術是近幾年發(fā)展起來的一種新的分子細胞遺傳學技術。基本原理應用非放射性熒光物質標記克隆化的基因或DNA片段后，與染色體DNA進行雜交，直接從染色體上檢查形成雜交部位的熒光信號。

經典t(9;22)細胞信號(DF)能發(fā)現常規(guī)細胞遺傳方法無法檢測的基因或染色體重排

速度快、敏感性高，更適合臨床使用

12能檢測到間期細胞核的染色體異常

3可同時觀察數百個細胞，充分了解患者染色體信息4優(yōu)點研究目的探討：FISH敏感性是否優(yōu)于常規(guī)染色體核型分析FISH動態(tài)隨訪微小殘留?。∕RD）的臨床意義FISH是否能反映白血病治療效果FISH是否能預測移植物抗宿主病（GVHD）發(fā)生

資料與方法一般資料新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液科2009.10-2010.10收治的白血病患者44例，收集骨髓標本85份，男性27例，女性17例，中位年齡38（14～68）歲。其中漢族35例，維吾爾族4例，回族2例，錫箔族2例，哈薩克族1例。依據骨髓形態(tài)學標準確診CML25例M212例M33例B-ALL2例M01例M4b1例技術路線骨髓標本

治療前組

陽性患者給予干預性治療

造血干細胞移植組

藥物治療組

統計學分析,得出結論

檢測方法1.預處理：接種培養(yǎng)低滲固定2.老化：2×SSC液30分鐘，梯度脫水3.雜交：變性后，37℃溫箱16小時以上4.洗滌：0.4×SSC液；2×SSC/吐溫5.復染：DAPI復染6.鏡檢：觀察200個分裂間期細胞檢測指標1.AML1/ETO雙色雙融合探針盒2.PML/RARA雙色雙融合探針盒3.BCR/ABL雙色雙融合探針4.X/Y紅綠雙色探針均購于英國Cytocell公司。檢測指標：白血病陽性細胞率，結果以百分數表示。表1FISH與常規(guī)染色體核型分析樣本陽性率及對比分析注：P>0.05一致性檢驗Kappa=0.819

1.FISH與常規(guī)染色體核型對比分析：結果

FISH檢測顯示15份(17.6%)樣本為陽性，染色體核型分析11例(12.9%)為陽性，有4例FISH顯示陽性結果的樣本，染色體核型分析其中3例結果陰性，1例因中期分裂象極低，而無法分析。2.治療后患者的動態(tài)隨訪造血干細胞移植后：在移植后1月，2例陽性，給予免疫抑制劑減量等相關治療后轉陰。甲磺酸伊馬替尼：治療后3月內1例陽性，考慮藥物起效時間，囑繼續(xù)服藥，3月后復查轉陰。全反式維甲酸：所有檢測結果均為陰性。表2造血干細胞移植后各檢測時間點之間FISH結果比較

NMRD均值(%)標準差(%)1個月1-6個月6月以上162173.7192.4762.074.69391.55301.336注：組間比較P>0.053.FISH是否能反映白血病治療效果表3經典方法治療前后患者FISH均值比較NMRD均值(%)標準差(%)移植后組藥物治療后組治療前組4612112.8374.95874.2273.03145.083218.7928總數6914.58727.3376注：兩治療組與治療前組比較P<0.01，兩治療組間P>0.054.MRD與GVHD是否有相關性表4GVHD發(fā)生組與未發(fā)生組FISH結果比較NMRD均值(%)標準差(%)未發(fā)生GVHD組發(fā)生GVHD組1264.2081.7505.20692.1852注：組間比較P>0.05

討論1.FISH具有方法學優(yōu)勢國內外很多研究都對兩種檢測方法做了比較：如Brown等對69例G顯帶顯示陰性的患者進行FISH檢測，結果發(fā)現其中3例患者表現出染色體異常。本研究同樣在所有G顯帶陰性的患者中監(jiān)測出3例染色體異常。

在檢測敏感性方面，多數研究表明，FISH的敏感性可以達到10-2-10-3

，本研究應用FISH技術觀察200個細胞，敏感性達到0.005，比起常規(guī)染色體分析僅僅觀察20個細胞，敏感性提高了10倍以上。實驗證實FISH技術速度快，靈敏性高，能夠檢測出常規(guī)染色體方法檢測不出或無法檢測的MRD。

然而，本實驗也同樣證實：兩種方法的檢測陽性率比較不具有統計學差別，且兩種方法檢測的結果具有高度的相關性，所以在沒有條件進行FISH檢測的情況下，先進行常規(guī)染色體核型分析也是必要的。

2.FISH技術對治療后患者MRD的動態(tài)檢測在治療后患者的隨訪過程中，我們發(fā)現了3例MRD陽性患者，在采取了相應治療后全部轉陰。因此，我們認為采用FISH技術在治療后早期發(fā)現MRD，并給予有效治療可以扭轉疾病的不良后果。

在動態(tài)隨訪過程中檢測結果持續(xù)陰性的病人，臨床均未出現復發(fā)，說明MRD的結果是監(jiān)測復發(fā)的一個良好的指標。3.FISH結果可以準確反映白血病的治療效果我們選擇了3種國際公認的白血病有效治療方案的患者，應用FISH檢測他們在治療前后的MRD值。結果反映治療前后差異具有統計學意義，表明治療效果明顯。這說明FISH對MRD的檢測結果，能夠準確反映白血病的治療效果。4.MRD與GVHD的相關性發(fā)生GVHD組與未發(fā)生GVHD的MRD比較差別不具有統計學意義。依據現有資料，我們尚不能認為GVHD的發(fā)生與MRD值具有相關性。雖然國外有文獻證實兩者之間存在相關性，但考慮本研究中病例樣本量有限，還需要更大樣本的實驗來證實。小結1.FISH檢測結果與常規(guī)染色體核型分析結果基本一致，但FISH檢測速度更快、敏感性更高,且能夠檢測出部分常規(guī)染色體檢測不到或無法檢測的陽性標本。2.FISH對白血病患者MRD的動態(tài)檢測對于準確評估白血病狀態(tài)，預測復發(fā)，并指導臨床及時給予干預性治療具有重要意義。3．對3種治療方法的FISH檢測結果顯示：在治療后陽性細胞率表現明顯減少，說明FISH能夠準確反映白血病的臨床治療效果。4．對移植后患者GVHD的發(fā)生與MRD的相關性分析表明兩者之間無相關性，但病例樣本不足，需要