呼吸道病毒標(biāo)本采集運(yùn)輸、保存與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果判讀ppt參考課件

呼吸道病毒標(biāo)本采集運(yùn)輸、保存與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果判讀1相關(guān)呼吸道病毒概況22022/10/28呼吸道病毒

呼吸道病毒是指一大類能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病變，或僅以呼吸道為入侵門戶，主要引起呼吸道外組織器官病變的病毒。拒統(tǒng)計(jì)，90%以上的急性上呼吸道感染由病毒引起。32022/10/28呼吸道病毒的分類正粘病毒科

流感病毒（A、B、C）副粘病毒科

副流感病毒（I-IV）、呼吸道合胞病毒、

偏肺炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒小RNA病毒科

腸道病毒（脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、?？刹《荆?、鼻病毒、心病毒腺病毒科

腺病毒冠狀病毒科

SARS-CoV,229E,OC43,NL63,HKU1細(xì)小病毒

博卡病毒（1-4）呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬皰疹病毒科單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒水痘－帶狀皰疹病毒、披膜病毒科風(fēng)疹病毒多瘤病毒

WU、KI42022/10/28呼吸道病毒感染的特點(diǎn)病毒的多樣性和變異性；在引起成人感冒的病毒群中：鼻病毒占30%-35%，冠狀病毒占20%-30%，其他病毒占10%-15%。大部分情況下，病毒入侵部位、入侵后繁殖部位、由此引發(fā)的組織和免疫病理改變以及表現(xiàn)出的臨床癥狀和體征的部位基本在呼吸道，表現(xiàn)的病情較輕；一般無(wú)病毒血癥；有些病毒還可引起腸道感染；免疫力不持久；52022/10/28正粘病毒的基本特征流行性感冒病毒（簡(jiǎn)稱流感病毒）：

是一種造成人類及動(dòng)物患流行性感冒的RNA病毒，在分類學(xué)上，流感病毒屬于正黏液病毒科理化特性：

對(duì)熱敏感,56℃30min可滅活；最適pH為7.0～8.0，＜3.0和＞10.0感染力很快被破壞；對(duì)紫外線敏感；對(duì)乙醚、氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑均敏感。

62022/10/28流行性感冒概述流行性感冒（簡(jiǎn)稱流感）：

是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒分別引起的急性呼吸道傳染病。臨床表現(xiàn)：

起病急、高熱（38～40℃）、肌痛、頭痛伴有嚴(yán)重不適、干咳、咽喉痛或鼻炎，多數(shù)患者可在一到兩周內(nèi)恢復(fù)。

潛伏期短（1-

3天）、經(jīng)呼吸道飛沫傳播，傳播迅速，抗原易變異，人群對(duì)變異株普遍易感，控制難度大，流感流行呈一定季節(jié)性。72022/10/28流感病毒概述分型與命名◆

根據(jù)流感病毒感染的對(duì)象，可以將病毒分為人類流感病毒、豬流感病毒、馬流感病毒以及禽流感病毒等類群。◆根據(jù)病毒粒核蛋白（NP）和膜蛋白（MP)抗原特性及其基因特性的不同，可以將病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型?！艏仔土鞲胁《靖鶕?jù)其表面結(jié)構(gòu)（H和N）及其基因特性的不同可分為多種亞型。

82022/10/28目前已從甲型流感病毒的天然宿主水禽中分離到16種HA與9種NA亞型的甲型流感病毒。92020/3/15禽流感病毒H5N1、H9N2、H7N7以及H10N7等均有感染人的報(bào)道。血清學(xué)的證據(jù)表明H4、H6以及H11亞型AIVs也可能感染過(guò)人。根據(jù)禽流感病毒對(duì)雞致病性的不同，AIVs可以分為低致病性禽流感病毒（LPAIV）和高致病性禽流感病毒（HPAIV）。近幾十年，不斷有HPAIV和LPAIV感染人的報(bào)道，均是由禽直接傳給了人，并沒(méi)有病毒能在人群中有效傳播的證據(jù)。H7亞型AIVs也可按照地域不同分為兩個(gè)基因譜系：北美譜系和歐亞譜系，且均有感染人的報(bào)道102022/10/28副粘病毒的基本特征副粘病毒科(Paramyxoviridae)擁有2個(gè)病毒亞科6個(gè)屬。副粘病毒的基因組為單股負(fù)鏈RNA，不分節(jié)段。基因組約15~20kb，編碼的蛋白8~11個(gè)或更多。副粘病毒毒粒直徑約150~350nm，含有螺旋狀核殼。病毒顆粒呈多形性，但通常為圓形，均有包膜。即使在同一種病毒，毒粒的大小也不相同。細(xì)胞漿內(nèi)復(fù)制。112022/10/28122022/10/28小RNA病毒的基本特征小RNA病毒(Picornavirus)小RNA病毒有9個(gè)屬，其中已知5個(gè)含有人類病原。小RNA病毒顆粒每個(gè)含有4種蛋白（VP1-VP4），各有60個(gè)拷貝，呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑大約30nm，無(wú)包膜。小RNA病毒基因組為單股正鏈RNA分子，大小約8kb，能夠在細(xì)胞漿內(nèi)翻譯出病毒復(fù)制所需的所有病毒蛋白，因此具有感染性。132022/10/28Cox腸道病毒感染特點(diǎn)非脊髓灰質(zhì)炎腸道病毒（NPEV），主要包括Cox、ECHO和一些新型腸道病毒；感染廣泛，僅在美國(guó)每年癥狀性感染達(dá)500萬(wàn)～1000萬(wàn)。感染主要發(fā)生在夏秋季節(jié)，發(fā)病率和嚴(yán)重程度與年齡成反比，幼兒是主要受害者；可引起普通感冒、心肌炎、無(wú)菌性腦膜炎、腦炎等多種疾病。絕大部分感染是無(wú)癥狀性的，很難與鼻病毒感染區(qū)分。142022/10/28在液體中穩(wěn)定；腦脊液、血清、全血、尿可以放在原始采集管中送交實(shí)驗(yàn)室；直腸或咽拭子、鼻洗液等放入VTM；樣本采集腸道病毒152022/10/28鼻病毒病毒復(fù)制及癥狀特征主要在鼻部，人普通感冒有1/3～1/2由鼻病毒引起；1960年代分離成功，至1987年已經(jīng)鑒別了>100血清型；根據(jù)基因特征可將這些血清型分為A、B兩屬；2007年發(fā)現(xiàn)C屬，目前不能培養(yǎng)溫帶地區(qū)感染高峰為每年9月，春天有第二次感人那高峰，夏天可持續(xù)發(fā)生；無(wú)組特異性抗原，型見(jiàn)可有交叉，血清型變化頻繁；病毒經(jīng)呼吸道分泌物從人傳播到人；潛伏期2～3d,病毒排出高峰期與急性鼻炎一致；4～5d時(shí)檢測(cè)不到病毒或維持低滴度達(dá)2周，癥狀一般維持7d;下呼吸道感染也常發(fā)生。尤其是對(duì)于嬰幼兒、老年人、慢性病患者或原有肺病患者，常與RSV感染不易區(qū)分；沒(méi)有胞膜，對(duì)有機(jī)溶劑有抵抗力。感染特點(diǎn)162022/10/28癥狀出現(xiàn)后1～6d均可分離到病毒，病毒排泌1～3d明顯；標(biāo)本應(yīng)在鼻部采集而不是咽部采集；鼻洗液是鼻病毒分離最好的標(biāo)本；樣本4℃可保存24～48h。鼻病毒樣本采集172022/10/28線型雙鏈DNA，不分節(jié)段，基因組長(zhǎng)30000~42000bp，編碼約30種蛋白；病毒無(wú)包膜，二十面立體對(duì)稱，直徑約70~90nm，具12個(gè)頂角和纖維刺突。腺病毒182022/10/28潛伏期5~8d；通常為局部感染；約5%的兒童急性呼吸道疾病及約10%的嬰幼兒腹瀉由腺病毒引起；咽炎，急性呼吸系統(tǒng)疾?。?，4，7，21，1，2，5，6），濾泡性結(jié)膜炎，流行性角膜結(jié)膜炎，咽結(jié)膜熱，尿路感染（子宮頸炎、尿道炎、出血性膀胱炎）以及無(wú)癥狀持續(xù)感染；腦膜腦炎可為腺病毒呼吸道感染的并發(fā)癥。腺病毒感染特點(diǎn)192022/10/28202022/10/28212022/10/28鼻咽拭子或抽出物、鼻拭子或抽出物、眼分泌物拭子、糞便或直腸拭子、尿、尿道或?qū)m頸拭子以及活檢或尸檢組織都是可根據(jù)病人癥狀獲得的合適標(biāo)本。疾病早期正確收集樣品并立即冷凍送往實(shí)驗(yàn)室可大大提高病毒檢出率。用血清學(xué)方法建立或證實(shí)診斷需要配對(duì)的血樣。第一份樣品在癥狀出現(xiàn)后應(yīng)立即盡快收集，第二份應(yīng)在2-4周后收集。樣本采集腺病毒222022/10/28冠狀病毒

單股正鏈RNA，27-31KD,5’端甲基化“帽子”，3’端polyA尾。

根據(jù)基因序列和血清學(xué)，分成三組，感染人類的分屬于I和II組，包括229E、NL63、OC43、HKU1和SARS-CoV。Woo,etal.ExpBiolMed.2009,234:1117–1127232020/3/15可引起呼吸道、腸道感染，也可能引起神經(jīng)癥狀。非SARS-CoV病毒，通過(guò)呼吸道飛沫傳播，尚無(wú)動(dòng)物模型，多數(shù)感染較輕，為自限性，可加重慢阻肺等疾病。分布廣泛，主要發(fā)生在冬季和早春，美國(guó)數(shù)據(jù)表明，占成人上呼吸道感染的10~24%。病毒分離可用人胚腎細(xì)胞或器官培養(yǎng)。冠狀病毒感染特點(diǎn)242022/10/28呼吸道病毒標(biāo)本采集、運(yùn)輸、保存252022/10/28流感樣病例定義是指發(fā)熱（體溫大于等于38℃），伴咳嗽或咽痛之一者。262022/10/28不明原因肺炎病例定義同時(shí)具備以下4條,不能明確診斷為其它疾病的肺炎病例:(1)發(fā)熱(腋下體溫≥38℃);(2)具有肺炎的影像學(xué)特征;(3)發(fā)病早期白細(xì)胞總數(shù)降低或正常,或淋巴細(xì)胞分類計(jì)數(shù)減少;(4)經(jīng)規(guī)范抗菌藥物治療3-5天，病情無(wú)明顯改善或呈進(jìn)行性加重。272022/10/28呼吸道癥候群病例定義（一）急性感染表現(xiàn)（至少符合下列的一項(xiàng)）：

發(fā)熱（從發(fā)病開(kāi)始有報(bào)告和記錄），WBC升高或降低，或WBC分布異常，寒戰(zhàn)，體溫降低（考慮年齡）（二）呼吸道臨床表現(xiàn)（至少符合下列的一項(xiàng)）：

咽部不適、咽干或咽痛，鼻塞、流涕，鼻/咽/喉明顯充血、水腫，咳嗽（新發(fā)或咳嗽加重），咳痰，氣短，聽(tīng)診呼吸音異常（濕啰音，干啰音，哮鳴音，濁音），胸痛其中肺炎病例具有上述(一)和(二),并具備----（三）肺炎癥狀：

胸部X線片提示肺部炎性改變注:從肺炎病例采集的標(biāo)本數(shù)比例不少于所承擔(dān)發(fā)熱呼吸道癥候群總?cè)蝿?wù)量的20%。282022/10/28針對(duì)各種標(biāo)本的病毒與細(xì)菌檢測(cè)項(xiàng)目的流程圖如下：病例標(biāo)本采集全血鼻/咽拭子尿液鼻咽抽吸物支氣管肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定急性期/恢復(fù)期血清可疑病毒抗體檢測(cè)（備選項(xiàng)）、肺炎支原體和肺炎衣原體抗體檢測(cè)（備選項(xiàng)）病毒核酸檢測(cè)（陽(yáng)性者部分繼續(xù)進(jìn)行病毒分離）、肺炎支原體和肺炎衣原體DNA檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎鏈球菌快速抗原檢測(cè)痰液肺炎支原體及肺炎衣原體DNA檢測(cè)；細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定（鼻咽抽吸物和支氣管肺泡灌洗液陰性者進(jìn)行細(xì)菌DNA檢測(cè)）；病毒核酸檢測(cè)（陽(yáng)性者部分繼續(xù)進(jìn)行病毒分離）胸腔穿刺液292022/10/28相關(guān)法律法規(guī)依據(jù)《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》開(kāi)展標(biāo)本的采集和檢測(cè)。標(biāo)本的采集和檢測(cè)應(yīng)嚴(yán)格遵守《病原微生物實(shí)

驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》(國(guó)務(wù)院424號(hào)令2004

年11月12日起實(shí)施)，并嚴(yán)格做好個(gè)人防護(hù)標(biāo)本的保存與運(yùn)輸嚴(yán)格遵守《可感染人類的高

致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理

規(guī)定》（衛(wèi)生部45號(hào)令2006年2月1日起施行）具體依據(jù)《人間傳染的病原微生物名錄》（衛(wèi)科教發(fā)[2006]15號(hào)2006年1月11日發(fā)布）302022/10/28病原微生物標(biāo)本的采集條件具有與采集病原微生物樣本所需要的生物安全防護(hù)水平相適應(yīng)的設(shè)備，包括個(gè)人防護(hù)用品（隔離衣、帽、口罩、鞋套、手套、防護(hù)眼鏡等）、防護(hù)材料、器材和防護(hù)設(shè)施等具有掌握相關(guān)專業(yè)知識(shí)和操作技能的工作人員具有有效的防止病原微生物擴(kuò)散和感染的措施具有保證病原微生物樣本質(zhì)量的技術(shù)方法和手段

采集過(guò)程中應(yīng)對(duì)標(biāo)本的來(lái)源、采集過(guò)程和方法等作詳細(xì)記錄。312022/10/28病原微生物標(biāo)本采集原則早、快、近（病變部位）、多、凈應(yīng)根據(jù)病例的臨床表現(xiàn)采集不同時(shí)期、不同種類的標(biāo)本死亡病例最好采集尸檢標(biāo)本，并盡可能地收集醫(yī)院已檢的臨床標(biāo)本沒(méi)有條件進(jìn)行尸體解剖的，可根據(jù)檢測(cè)目的采集呼吸道灌洗液、肛拭子或經(jīng)皮穿刺采集胸水、腹水、肺組織標(biāo)本等322022/10/28病原微生物標(biāo)本的種類呼吸道樣品：上呼吸道樣品：咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、鼻洗液、咽漱液、深咳痰液、鼻咽抽取物。最佳采集時(shí)間為發(fā)病后3天內(nèi)，一般不超過(guò)7天。下呼吸道樣品：呼吸道抽取物、呼吸道灌洗液、胸水、肺組織標(biāo)本。下呼吸道標(biāo)本最有利于病毒分離。消化道樣品：糞便、肛拭子、胃內(nèi)容物。其他樣品：血液、腦脊液、尿液、皰疹液、瘀斑或出血點(diǎn)、皮膚潰瘍分泌液、體液標(biāo)本、膿或傷口標(biāo)本、尸檢標(biāo)本。332022/10/28標(biāo)本采集的器材和容器標(biāo)本采集的器材和容器應(yīng)是無(wú)菌的，在有效期內(nèi)使用。標(biāo)本容器最好使用可耐深低溫的塑料制品。如外螺旋蓋帶密封墊圈的無(wú)菌螺口塑料管或瓶。采集好的標(biāo)本應(yīng)規(guī)范標(biāo)識(shí)獨(dú)立包裝在帶密封條的塑料袋中。342022/10/28標(biāo)本容器352022/10/28采咽拭子的器材和容器362022/10/28采鼻拭子的器材和容器372022/10/28采集血標(biāo)本的器材和容器382022/10/28BDSST血清分離膠管

BDSST管內(nèi)壁均勻噴涂促凝劑加速血液凝固，縮短周轉(zhuǎn)時(shí)間（TAT）。惰性分離膠用于離心后分隔血細(xì)胞和血清，可提高血清產(chǎn)量，較長(zhǎng)時(shí)間保持血清成分的穩(wěn)定，利于樣本的復(fù)檢。分離膠穩(wěn)定性強(qiáng)，不易吸附血清中的蛋白質(zhì)，對(duì)藥物檢測(cè)及普通的生化檢測(cè)可得出真實(shí)的結(jié)果。

BDPST血漿分離膠管

BDPST管內(nèi)含有惰性分離膠，可分隔血細(xì)胞和血漿，提高血漿產(chǎn)量，保持血漿成分的穩(wěn)定。用于采集血漿樣本，消除凝血時(shí)間，縮短周轉(zhuǎn)時(shí)間(TAT)。通常用于重癥監(jiān)護(hù)和急診檢測(cè)。

BD血清管

BD血清管用于采集靜脈血后分離出血清，應(yīng)用于臨床化學(xué)、血清學(xué)、免疫學(xué)、治療藥物監(jiān)測(cè)、微量元素測(cè)定。促凝劑的作用是加速血液凝固。采用促凝管可以縮短周轉(zhuǎn)時(shí)間。

BD血漿管

BD血漿管用于采集靜脈血后分離出血漿，應(yīng)用于臨床生化等檢驗(yàn)。血漿管內(nèi)壁均勻噴涂肝素鋰或肝素鈉用于血液抗凝，適于大多數(shù)臨床生化檢測(cè)，可以作為那些不用分離膠管而又需要血漿標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室的主要采血管。

BD血糖管

BD血糖管用于血糖測(cè)定或糖耐量檢測(cè)，管壁均勻噴涂抗凝劑（草酸鉀）及糖原穩(wěn)定劑（氟化鈉），糖原穩(wěn)定劑可以使血糖濃度在室溫條件下保持24小時(shí)穩(wěn)定。

BDEDTA血常規(guī)管

血常規(guī)管含有EDTA的二鉀鹽或三鉀鹽，其中二鉀鹽呈霧狀均勻噴涂于管壁。該管主要用于血細(xì)胞學(xué)檢測(cè)如血象，血紅蛋白，糖化血紅蛋白，環(huán)胞素，紅細(xì)胞葉酸及輸血前檢測(cè)（血型、抗體篩查、交叉配型）。

BD血凝管

BD血凝管主要用于凝血四項(xiàng)檢測(cè)（凝血酶原時(shí)間、凝血酶時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間、纖維蛋白原），指導(dǎo)臨床如口服華法林治療的監(jiān)控、靜脈輸注肝素治療的監(jiān)控以及“特殊凝血研究”（凝血因子檢測(cè)、如第VIII因子或血友病因子、血小板功能檢測(cè)）。

BDVacutainer?血沉管（ESR管）

血沉管用于紅細(xì)胞沉降率的測(cè)定，含有3.2%枸櫞酸鈉溶液抗凝，抗凝劑與血液的比例為1:4。玻璃管可配合血沉架或全自動(dòng)血沉儀聯(lián)合使用，該方法為封閉系統(tǒng)，無(wú)需打開(kāi)管帽，采血后直接操作。-BDPAXgeneTM

全血RNA管能穩(wěn)定血細(xì)胞內(nèi)的RNA水平，延長(zhǎng)血液標(biāo)本體外放置的時(shí)間，利于批量采集，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平保真性好可用于與血細(xì)胞RNA相關(guān)的RT-PCR檢測(cè)，人類疾病基因轉(zhuǎn)錄譜的研究及其他RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)的檢測(cè)392022/10/28標(biāo)本采集方法

咽拭子：用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時(shí)檫拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋。402022/10/28標(biāo)本采集方法

鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出；取另1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔；將上述2根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋。412022/10/28標(biāo)本采集方法鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。先將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出；收集抽取的粘液，并用采樣液3ml涮洗收集器1次（可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來(lái)代替收集）422022/10/28吸取過(guò)程正確錯(cuò)誤錯(cuò)誤不要觸摸病人的臉!432022/10/28標(biāo)本采集方法咽漱液：用10ml不含抗菌素的采樣液漱口（漱時(shí)讓患者頭部微后仰，發(fā)“噢”聲，讓洗液在咽部轉(zhuǎn)動(dòng)），然后將咽漱液收集于50ml無(wú)菌的螺口塑料管中。無(wú)條件的可用平皿或燒杯收集咽漱液并轉(zhuǎn)入10ml螺口采樣管中。442022/10/28標(biāo)本采集方法深咳痰液：肺部感染應(yīng)采取痰標(biāo)本，以清晨第一口痰為最佳。采集前要求患者用清水漱口數(shù)次，以除去口腔內(nèi)的大量雜菌，患者深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的50ml無(wú)菌螺口采樣管中。呼吸道灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出；收集抽取的粘液，并用采樣液涮洗收集器1次（可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來(lái)代替收集）。452022/10/28標(biāo)本采集方法胸水：在B超定位下進(jìn)行胸腔穿刺，抽取胸水5ml，置于無(wú)菌的塑料螺口管中。肺組織活檢標(biāo)本：在超聲或X線定位下，經(jīng)皮穿刺取肺組織活檢標(biāo)本，置于含3ml采樣液的塑料螺口管中。尸檢標(biāo)本：在嚴(yán)格按照生物安全防護(hù)的條件下，進(jìn)行尸檢，根據(jù)檢測(cè)目的可采集肺、肝、腎、脾、心臟、腦、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本。病人死亡后應(yīng)依法盡早進(jìn)行解剖，無(wú)菌采集，每一采集部位分別使用不同消毒器械，以防交叉污染；每組織應(yīng)多部位取材，各組織應(yīng)取20～50g，淋巴取2個(gè)。462022/10/28標(biāo)本采集方法糞便標(biāo)本：對(duì)黏液膿血便應(yīng)挑取黏液或膿血部分，液狀糞便采集水樣便或含絮狀物的液狀糞便2～5ml；成形糞便至少取5g糞便置于無(wú)菌螺口管中，最好加有保存液或增菌液。肛拭子：若無(wú)法獲得糞便時(shí)，可用保存液或增菌液濕潤(rùn)過(guò)的棉拭子插入肛門4～5cm深處（小兒2～3cm）輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)一圈，取直腸表面的黏液后取出，用于病毒檢測(cè)的肛拭子立即放入含3ml病毒保存液的帶外螺旋蓋的試管中，用于細(xì)菌檢測(cè)的肛拭子需將樣品接種到增菌液中，或?qū)?biāo)本插入Cary-Blair運(yùn)送半固體培養(yǎng)基中，但不得冷凍。

472022/10/28標(biāo)本采集方法血清標(biāo)本：用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于2ml無(wú)菌螺口塑料管中。每一例病人須采集急性期、恢復(fù)期雙份血清。第一份血清應(yīng)盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）采集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3～4周采集。以空腹血為佳。病例診斷需雙份血清。全血：用一次性真空抗凝采血管采集病人5ml靜脈血，立即緩慢地顛倒采血管3-5次，4℃條件下立即送至有關(guān)實(shí)驗(yàn)室。482022/10/28不同疾病標(biāo)本的采集

流行性感冒：采發(fā)病3天內(nèi)流感樣病例（T≥38℃、伴有咽痛或咳嗽癥狀之一者,缺乏其它實(shí)驗(yàn)室確定診斷依據(jù)）的咽拭子或鼻咽拭子放入3-5ml采樣液中或采集病人的含漱液10ml，冷藏運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。最好沒(méi)有服用過(guò)抗病毒藥物。

麻疹：作病毒分離的樣品，要在前驅(qū)期或出疹初期（T≥38℃、3天內(nèi)）采病人的咽拭子放入3-5ml采樣液中冷藏送至實(shí)驗(yàn)室；作血清學(xué)診斷的樣品，則在出疹后４-１５天采集靜脈血，必要時(shí)間隔1周再采1次。492022/10/28不同疾病標(biāo)本的采集SARS/人禽流感/MERS：應(yīng)在發(fā)病不同時(shí)期分別采集住院病人的不同標(biāo)本，早期可采集病人的咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液等上呼吸道標(biāo)本；病人上呼吸機(jī)后，可采集呼吸道抽取物、支氣管灌洗液等下呼吸道標(biāo)本；如果病例有腹瀉癥狀，可采集糞便標(biāo)本；有胸水者可采集胸水標(biāo)本；須采集急性期、恢復(fù)期雙份血清；必要時(shí)還可采集全血。502022/10/28標(biāo)本的采集（一）注意事項(xiàng)確認(rèn)符合病例定義后盡早采集（盡量在采取治療措施前）采集時(shí)嚴(yán)格無(wú)菌操作，減少或避免機(jī)體正常菌群及其它雜菌污染采集后應(yīng)盡快送檢。床旁接種可提高病原菌檢出率。送檢標(biāo)本應(yīng)貼條形碼，并附送檢單，送檢單上應(yīng)注明姓名、(編號(hào))、標(biāo)本來(lái)源、檢驗(yàn)?zāi)康暮蜆?biāo)本采集具體時(shí)間。填寫病例信息調(diào)查表。嚴(yán)格按生物安全規(guī)范操作。512022/10/28（二）各種標(biāo)本的采集要求病毒檢測(cè)：（檢測(cè)一類標(biāo)本即可）鼻/咽拭子（必采項(xiàng)）痰液（盡量采集）鼻咽抽吸物（盡量采集）胸腔穿刺液（盡量采集）支氣管肺泡灌洗液（盡量采集）血液（盡量采集）細(xì)菌檢測(cè)：血液（必采項(xiàng)）痰液（必采項(xiàng)）胸腔穿刺液（盡量采集）支氣管肺泡灌洗液（盡量采集）尿液：軍團(tuán)菌、肺炎鏈球菌快速抗原檢測(cè)（必采項(xiàng)）522022/10/28聯(lián)合國(guó)對(duì)感染性物質(zhì)的運(yùn)輸分類根據(jù)其所運(yùn)輸病原體的傳染性和感染后對(duì)個(gè)體或群體的危害程度不同，分為A類和B類。A類指人感染后發(fā)病的可能性大，傳染性強(qiáng)，對(duì)人群危害性大的烈性感染性物質(zhì)。高度懷疑具有嚴(yán)重危害性的感染性物質(zhì)也屬于A類。A類之外，僅具有一般危險(xiǎn)性，引起感染的機(jī)會(huì)較少的感染性物質(zhì)感染性物質(zhì)為B類532022/10/28感染性物質(zhì)運(yùn)輸?shù)陌b系統(tǒng)感染性及潛在感染性物質(zhì)的運(yùn)輸應(yīng)使用三層包裝系統(tǒng)：內(nèi)層容器、中層包裝、外層包裝將樣品采用防水、防漏的內(nèi)層容器包裝并貼上指示內(nèi)容物的標(biāo)簽后裝入中層容器內(nèi)層容器和中層容器間應(yīng)放置足量的吸水性材料，以便內(nèi)層容器打破或泄漏時(shí)能吸收溢出的所有液體。然后將中層容器固定在硬質(zhì)外層容器中以免中層容器在運(yùn)輸過(guò)程中受到物理性損壞。542022/10/28標(biāo)本的包裝A類包裝，符合UN2814要求容器或包裝材料應(yīng)達(dá)到國(guó)際民航組織《危險(xiǎn)物品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》（Doc9284包裝說(shuō)明PI602）規(guī)定的A類包裝標(biāo)準(zhǔn)552022/10/28標(biāo)本的包裝三層包裝第一層為離心管第二層為防水、防漏的安全殼容器第三層為運(yùn)輸包裝包裝要求樣本應(yīng)用吸水紙等包裹，固定在自封袋或離心管內(nèi)在堅(jiān)固、防水、防漏的第二層安全殼容器中，用吸水紙等填充物將內(nèi)有標(biāo)本的自封袋或離心管固定好，裝入第三層包裝第二層和第三次包裝之間應(yīng)放置冰排等制冷材料安全殼容器和外包裝須與IATA危險(xiǎn)物品條例包裝制度650相符合562022/10/28標(biāo)本的運(yùn)送血液標(biāo)本、鼻/咽拭子、痰液、鼻咽抽吸物、支氣管肺泡灌洗液、胸腔穿刺液、尿液標(biāo)本采集后應(yīng)該盡快送檢。血培養(yǎng)瓶須在24小時(shí)內(nèi)送檢，送檢前置于常溫環(huán)境（15-30℃）保存。其他標(biāo)本送檢前應(yīng)保存在4-8℃，如24小時(shí)內(nèi)無(wú)法檢測(cè)的標(biāo)本則應(yīng)置于-70℃或以下保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)本運(yùn)送過(guò)程中，血培養(yǎng)瓶應(yīng)置于15-30℃環(huán)境中,其他標(biāo)本應(yīng)置4-8℃運(yùn)送。572022/10/28收取標(biāo)本由醫(yī)院所在地的疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)到醫(yī)院收取標(biāo)本。標(biāo)本運(yùn)輸之前，應(yīng)按相關(guān)生物安全規(guī)定，與樣本接收單位生物安全管理部門聯(lián)系，辦理相關(guān)手續(xù)運(yùn)送日期確定后，立即將運(yùn)送時(shí)間和運(yùn)輸方式通知接收單位，做好接收準(zhǔn)備582022/10/28標(biāo)本的保存（一）檢測(cè)標(biāo)本的存放血清、呼吸道標(biāo)本、尿液標(biāo)本、胸腔穿刺液標(biāo)本抵達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室后，原則上應(yīng)盡早進(jìn)行病毒和細(xì)菌檢測(cè)；進(jìn)行病毒檢測(cè)的標(biāo)本，24小時(shí)內(nèi)能進(jìn)行檢測(cè)的可置于4℃保存，24小時(shí)內(nèi)不能進(jìn)行檢測(cè)的則應(yīng)置于-70℃或以下保存；用于細(xì)菌培養(yǎng)的標(biāo)本，應(yīng)立即分離，不應(yīng)存放后分離。標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。（二）標(biāo)本的長(zhǎng)期保存所采標(biāo)本抵達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，血清、呼吸道標(biāo)本、尿液標(biāo)本、胸腔穿刺液標(biāo)本按需要分裝成所需份數(shù)，置-70℃冰箱或以下保存。592022/10/28（二）標(biāo)本的處理

（一）呼吸道標(biāo)本用于病毒檢測(cè)前需進(jìn)行分裝分裝鼻/咽拭子標(biāo)本時(shí)，注意充分?jǐn)D壓拭子頭，保證細(xì)胞充分脫落分裝管中用于核酸檢測(cè)的標(biāo)本，如粘液成分較重，可進(jìn)行液化等處理（二）血清標(biāo)本從血標(biāo)本中分離血清，分裝后按方案要求儲(chǔ)存602022/10/28呼吸道病原譜（1）流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒、冠狀病毒、博卡病毒和鼻病毒8種病毒以及肺炎支原體和肺炎衣原體的核酸檢測(cè)。進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定，培養(yǎng)的重點(diǎn)是肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、A組乙型鏈球菌、流感嗜血桿菌。612022/10/28呼吸道病原譜（2）對(duì)所有細(xì)菌分離培養(yǎng)陰性的胸腔穿刺液和支氣管肺泡灌洗液，進(jìn)行針對(duì)所檢測(cè)細(xì)菌和肺炎支原體、肺炎衣原體的核酸檢測(cè)。對(duì)全部尿標(biāo)本進(jìn)行肺炎鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌的快速抗原檢測(cè)。凡從無(wú)菌部位（全血、支氣管肺泡灌洗液、胸腔穿刺液）采集標(biāo)本證實(shí)一種病原體感染，即可視為檢測(cè)終點(diǎn)，不要求繼續(xù)進(jìn)行其它病原體檢測(cè)。622022/10/28（三）檢測(cè)程序檢測(cè)病毒：人流感病毒、呼吸道合胞病毒、人腺病毒、人副流感病毒、人偏肺病毒、人冠狀病毒、人博卡病毒、人鼻病毒檢測(cè)方法：核酸PCR檢測(cè)/Real-timePCR（逐步完善）

分離培養(yǎng)和免疫熒光/PCR鑒定血清學(xué)檢測(cè)：各實(shí)驗(yàn)室視情況和條件選擇實(shí)施。632022/10/28呼吸道病毒的核酸檢測(cè)1.核酸的提?。鹤詣?dòng)化核酸提取商品化的核酸人工提取試劑盒公認(rèn)的傳統(tǒng)方法：如《分子克隆》。2.核酸的檢測(cè)：RT-PCR，PCRReal-timePCR3.結(jié)果的確證和記錄：膠回收克隆和測(cè)序642022/10/28病毒的分離培養(yǎng)（1）1.進(jìn)行病毒分離的標(biāo)本選擇原則：我國(guó)目前尚缺乏或存量較少，且具有較大的研究意義的病毒，包括人偏肺病毒，人冠狀病毒。在常規(guī)監(jiān)測(cè)研究時(shí)，某種病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性比例的異常增高時(shí)或非常規(guī)的聚集性病例時(shí)，從中選擇適當(dāng)數(shù)量病例分離5-10株病毒。鼓勵(lì)建立人博卡病毒的細(xì)胞培養(yǎng)分離體系。652022/10/282.分離得到的病毒，應(yīng)采用核酸檢測(cè)、免疫熒光等方法鑒定病毒種類。3.細(xì)胞株：應(yīng)有明確的生物學(xué)背景，來(lái)源清楚，并已排除病原體的污染。病毒的分離培養(yǎng)（2）662022/10/28實(shí)驗(yàn)室生物安全要求實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)相關(guān)活動(dòng)嚴(yán)格按照《人間傳染的病原微生物名錄》的要求，在相應(yīng)的生物安全級(jí)別實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展病毒培養(yǎng)在BSL-x實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)在ABSL-x實(shí)驗(yàn)室未經(jīng)培養(yǎng)的感染材料的操作在BSL-x實(shí)驗(yàn)室滅活材料的操作在BSL-x實(shí)驗(yàn)室按照《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》等相關(guān)規(guī)定要求，做好生物安全工作672022/10/28標(biāo)本上送要求根據(jù)要求，應(yīng)將陽(yáng)性和部分陰性標(biāo)本送省疾控中心、中國(guó)控中心進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果應(yīng)及時(shí)反饋標(biāo)本送檢單位，并盡快上報(bào)上級(jí)主管部門682022/10/28A類標(biāo)本運(yùn)輸?shù)纳锇踩笥蓪Ｈ藢＼囘\(yùn)送，運(yùn)送人員須有相關(guān)資質(zhì)，且不得少于兩人申請(qǐng)單位對(duì)與運(yùn)送人員進(jìn)行相關(guān)的生物安全培訓(xùn)在運(yùn)送過(guò)程中采取相應(yīng)的防護(hù)措施運(yùn)輸前仔細(xì)檢查容器，要符合安全要求按照規(guī)定進(jìn)行標(biāo)本運(yùn)輸前的包裝和送達(dá)后的開(kāi)啟692022/10/28呼吸道病毒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果判讀702022/10/28核酸檢測(cè)技術(shù)的原理PCR的基本工作原理就是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板互補(bǔ)的DNA片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。特異性：引物序列靈敏度：擴(kuò)增100萬(wàn)倍1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1～3步25～35輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍712022/10/28RT-PCR和real-timePCRRT-PCR：即逆轉(zhuǎn)錄PCR，擴(kuò)增的模板為RNA，增加RNA→DNA過(guò)程。Real-timePCR：即實(shí)時(shí)熒光定量PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。722022/10/28RT-PCR/Real-timeRT-PCR的基本步驟需要主要設(shè)備：高速冷凍離心機(jī)，PCR儀或熒光定量PCR儀，電泳儀，水平電泳槽，凝膠電泳成像系統(tǒng)，可調(diào)加樣槍（10ul，200ul，1000ul）。裂解細(xì)胞或病毒釋放核酸純化核酸反應(yīng)管中加入提取的核酸PCR試劑盒混合反應(yīng)體系反應(yīng)管放入PCR儀，自動(dòng)完成擴(kuò)增程序反應(yīng)管中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳電泳拍照結(jié)果分析裂解細(xì)胞或病毒釋放核酸純化核酸反應(yīng)管中加入提取的核酸PCR試劑盒混合反應(yīng)體系反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，自動(dòng)完成擴(kuò)增程序732022/10/28PCR檢測(cè)結(jié)果判讀742022/10/28熒光PCR結(jié)果判讀752022/10/28結(jié)果解釋－陰性樣品762022/10/28結(jié)果解釋－試驗(yàn)失敗772022/10/28結(jié)果解釋－可疑樣品782022/10/28結(jié)果解釋－可疑樣品792022/10/28陽(yáng)性樣品擴(kuò)增曲線802022/10/28病毒分離結(jié)果-采用的細(xì)胞系MDCK細(xì)胞：流感病毒LLCMK2細(xì)胞：副流感病毒，偏肺病毒，冠狀病毒CoV-OC43Hep-2細(xì)胞：腺病毒，RSVHela細(xì)胞：腺病毒，RSV，冠狀病毒CoV-229E，副流感病毒HEL細(xì)胞：冠狀病毒CoV-229EBSC-1細(xì)胞：冠狀病毒CoV-OC43812022/10/28MDCKLLCMK2Hep-2822022/10/28832022/10/28檢測(cè)流程標(biāo)本敏感細(xì)胞系收獲培養(yǎng)2-7天PCR、免疫熒光等方法篩選/檢測(cè)分型842022/10/28InfluenzaAInfluenzaBScreeningScreening852022/10/28RSVNegative862022/10/28尼基氏小體（Negri

body）神經(jīng)細(xì)胞熒光染色照片872022/10/28血凝和血凝抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷雞或火雞紅細(xì)胞陽(yáng)性(淚滴)陰性豚鼠或人O型血紅細(xì)胞陽(yáng)性（環(huán)狀）陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性882022/10/28中東呼吸綜合征冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)892020/3/15參考標(biāo)準(zhǔn)中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南WHO:Laboratory

TestingforMiddleEastRespiratorySyndrome

Coronavirus：interim

recommendations(revised)

.(September

2014

）USCDC：InterimGuidelinesforCollecting,Handling,andTestingClinicalSpecimensfromPatientsUnderInvestigation(PUIs)forMiddleEastRespiratorySyndromeCoronavirus(MERS-CoV)-Version2902022/10/28MERS-CoV感染標(biāo)本采集對(duì)象中東呼吸綜合征冠狀病毒感染疑似病例、臨床診斷病例及需要進(jìn)一步研究的確診病例；其它需要進(jìn)行MERS-CoV感染診斷或鑒別診斷者。912022/10/28標(biāo)本采集要求從事MERS-CoV檢測(cè)標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過(guò)生物安全培訓(xùn)，培訓(xùn)合格且具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能。在標(biāo)本采集過(guò)程中，采樣人員進(jìn)行安全防護(hù)。住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院醫(yī)護(hù)人員在當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)專業(yè)人員指導(dǎo)下采集。密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的需要，結(jié)合病程再次采樣。922022/10/28采集標(biāo)本種類和要求呼吸道（上、下呼吸道）和其他樣品（血清、尿液和糞便）、尸檢標(biāo)本。每個(gè)病例應(yīng)盡可能同時(shí)采集上、下呼吸道標(biāo)本，下呼吸道標(biāo)本最佳，建議同時(shí)采集糞便和尿液標(biāo)本。應(yīng)盡可能采取發(fā)病初期和恢復(fù)期雙份血清標(biāo)本以確定是否感染，雙份血清樣品間隔14~21天采集比較理想，第一份血清應(yīng)在發(fā)病第一周內(nèi)采集。但單份樣品的檢測(cè)對(duì)于確定疑似病例也有價(jià)值，如果只能采集一份樣品，應(yīng)該在出現(xiàn)癥狀后至少14天采集。932022/10/28標(biāo)本的保存樣品采集后應(yīng)盡快送至實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸過(guò)程需合理。若呼吸道樣品72小時(shí)以上才能到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，強(qiáng)烈推薦將樣品儲(chǔ)存在-80℃并使用干冰進(jìn)行運(yùn)輸，應(yīng)避免樣品反復(fù)凍融。從全血分離的血清應(yīng)4℃儲(chǔ)存并運(yùn)輸，或用干冰、液氮冷凍并運(yùn)輸。由于無(wú)霜冰柜溫度波動(dòng)較大，應(yīng)避免使用無(wú)霜冰柜儲(chǔ)存呼吸道和血清樣品。942022/10/28院內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，標(biāo)本應(yīng)該放置在耐用、防滲透的二級(jí)容器中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。為減少任何標(biāo)本破、漏的風(fēng)險(xiǎn)，不要使用任何氣動(dòng)傳輸系統(tǒng)來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)任何可能疑似患者標(biāo)本。轉(zhuǎn)運(yùn)至CDC的MERS-CoV標(biāo)本應(yīng)該充分包裹，轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)不能開(kāi)蓋或分裝標(biāo)本。標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)應(yīng)該符合三重包裝系統(tǒng)要求：內(nèi)層是主要的容器（一個(gè)可密封的標(biāo)本袋纏繞以可吸收材料），第二層是防水、防滲漏的容器，外層是用于轉(zhuǎn)運(yùn)的包裝。MERS-CoV感染標(biāo)本包裝和運(yùn)輸952022/10/28

MERS-CoV感染實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法核酸檢測(cè)：為目前早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)MERS-CoV感染病例的主要檢測(cè)方法，采用Real-timePCR進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)和診斷，患者呼吸道樣本中擴(kuò)增到特異性核酸，可確診MERS-CoV感染。傳統(tǒng)RT-PCR因易出現(xiàn)污染使用受限，但可以獲得病毒基因序列?？乖贵w檢測(cè):IgM捕獲法ELISA檢測(cè)血清特異性IgM抗體間接法ELISA或免疫熒光方法檢測(cè)IgG抗體利用假病毒進(jìn)行中和抗體檢測(cè)962022/10/28972022/10/28MERS-CoV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)靶標(biāo)目前病毒核酸的檢測(cè)方法主要有：檢測(cè)E蛋白上游基因（upE）、ORF1b、ORF1a

、N2基因四種。這些方法均高度敏感，推薦upE檢測(cè)用于初篩;檢測(cè)ORF1b基因的方法不如針對(duì)ORF1a的方法敏感，但比其更加特異;N2基因檢測(cè)具有較高的靈敏性。另外，已確定了中東呼吸綜合征冠狀病毒基因組中位于RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）和衣殼蛋白（N）基因的幾個(gè)適合測(cè)序驗(yàn)證的靶序列。982022/10/28巢式PCR普通PCRPCR產(chǎn)物電泳或測(cè)序逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA核酸提取標(biāo)本采集PCR檢測(cè)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方案99待檢樣品upE

特異性RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性陰性O(shè)RF1aRT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性陰性確診RdRp測(cè)序或N測(cè)序陰性抗原檢測(cè)抗體檢測(cè)病毒分離陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)流程1002022/10/28繼續(xù)采樣，如有必要應(yīng)送樣至有MERS-CoV檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)的參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)入選病例rRT-PCRupE基因進(jìn)行篩查實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性陰性rRT-PCRORF1a、ORF1b或N基因區(qū)進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)陰性，但如果臨床和流行病學(xué)證據(jù)充分，繼續(xù)采樣重復(fù)檢測(cè)陰性陽(yáng)性RdRp或N區(qū)測(cè)序?qū)嶒?yàn)陰性顯示為其他序列顯示MERS-CoV確診病例確診病例1012022/10/28upEupE-Fwd5'-GCAACGCGCGATTCAGTT-3'upE-Rev5'-GCCTCTACACGGGACCCATA-3'upE-Prb5'FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA3'ORF1bORF1b-Fwd5'-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3'ORF1b-Rev

5'-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3'ORF1b-Prb5'FAM-CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT-TAMRA3'ORF1aORF1a-Fwd 5'-CCACTACTCCCATTTCGTCAG-3'ORF1a-Rev 5'-CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA-3'ORF1a-Prb5'FAM-TTGCAAATTGGCTTGCCCCCACT-TAM