細(xì)胞全能性課件

*第二章細(xì)胞全能性與形態(tài)發(fā)生

第一節(jié)細(xì)胞全能性及其表達(dá)

第二節(jié)器官發(fā)生

第三節(jié)體細(xì)胞胚胎發(fā)生-*第二章細(xì)胞全能性與形態(tài)發(fā)生

第一節(jié)1第一節(jié)細(xì)胞全能性及其表達(dá)細(xì)胞全能性概述細(xì)胞脫分化細(xì)胞再分化-第一節(jié)細(xì)胞全能性及其表達(dá)細(xì)胞全能性概述細(xì)胞脫分化細(xì)胞再分2細(xì)胞的全能性----

一個細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整生物個體的固有能力。細(xì)胞全能性的絕對性與相對性:

不是所有基因型的所有細(xì)胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應(yīng);即使對于植物細(xì)胞而言，細(xì)胞全能性也并不意味著任何細(xì)胞均可以直接產(chǎn)生植物個體;動、植物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異。一.細(xì)胞全能性概述-細(xì)胞的全能性----一個細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整生物個體的固有3植物細(xì)胞按照分裂能力分為三類：第一類是始終保持分裂能力，從一個周期進(jìn)入另一個周期的周期細(xì)胞。如莖尖、根尖及形成層細(xì)胞；第二類是永久失去分裂能力的細(xì)胞，為終端分化細(xì)胞。如篩管、導(dǎo)管、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等特化細(xì)胞；第三類是在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可重新啟動分裂的Go細(xì)胞。表皮細(xì)胞及各種薄壁細(xì)胞。-植物細(xì)胞按照分裂能力分為三類：-4一個植物細(xì)胞向分生狀態(tài)回復(fù)過程所能進(jìn)行的程度，取決于它在自然部位上所處位置和生理狀態(tài)。（引自Gautheret,1966）-一個植物細(xì)胞向分生狀態(tài)回復(fù)過程所能進(jìn)行的程度，取決于它在自然5植物細(xì)胞全能性表現(xiàn)根據(jù)細(xì)胞類型不同從強(qiáng)到弱:

營養(yǎng)生長中心>形成層>薄壁細(xì)胞>厚壁細(xì)胞(木質(zhì)化細(xì)胞)>特化細(xì)胞(篩管、導(dǎo)管細(xì)胞)；根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同從強(qiáng)到弱為：頂端分生組織>居間分生組織>側(cè)生分生組織>薄壁組織(基本組織)>厚角組織>輸導(dǎo)組織>厚壁組織。-植物細(xì)胞全能性表現(xiàn)根據(jù)細(xì)胞類型不同從強(qiáng)到弱:-6細(xì)胞全能性脫分化再分化細(xì)胞分裂個體再生細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過細(xì)胞脫分化和再分化實(shí)現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的前體，再分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的最終體現(xiàn)。-細(xì)胞全能性脫分化再分化細(xì)胞分裂個體再生細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過7二.細(xì)胞脫分化細(xì)胞生理與結(jié)構(gòu)變化細(xì)胞脫分化調(diào)控機(jī)理細(xì)胞分裂與愈傷組織形成-二.細(xì)胞脫分化細(xì)胞生理與結(jié)構(gòu)變化細(xì)胞脫分化調(diào)控機(jī)8培養(yǎng)條件下使一個已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過程就是細(xì)胞脫分化（dedifferentiation）。離體培養(yǎng)下，脫分化過程發(fā)生在第一次有絲分裂之前.靜止細(xì)胞啟動分裂是分化細(xì)胞成功脫分化的重要標(biāo)志。細(xì)胞脫分化過程中生理和結(jié)構(gòu)變化-培養(yǎng)條件下使一個已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀9薄壁細(xì)胞：

細(xì)胞核較小，核位于細(xì)胞邊緣，細(xì)胞中央有大的液泡，細(xì)胞體內(nèi)核糖體密度較低，多聚核糖體數(shù)目較少，質(zhì)體為分化程度較高的葉綠體、雜色體、白色體和淀粉體。脫分化細(xì)胞：

細(xì)胞質(zhì)顯著變濃，大液泡消失，核體積增加并逐漸移位至細(xì)胞中央，細(xì)胞器增加。在這些變化中，液泡蛋白體的出現(xiàn)和質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體被認(rèn)為是細(xì)胞脫分化的重要特征。-薄壁細(xì)胞：脫分化細(xì)胞：-10細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理細(xì)胞周期對脫分化的調(diào)控

激素誘導(dǎo)表達(dá)基因與細(xì)胞脫分化PSK的發(fā)現(xiàn)及其對細(xì)胞脫分化的影響細(xì)胞脫分化與染色體解凝聚環(huán)境因素的作用-細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理細(xì)胞周期對脫分化的調(diào)控激素誘導(dǎo)表達(dá)111.損傷作用-----損傷細(xì)胞產(chǎn)生的自溶物質(zhì)可能對脫分化的早期誘導(dǎo)起作用。2光線----影響外植體最初的分裂3.氧-----有利于脫分化-1.損傷作用-----損傷細(xì)胞產(chǎn)生的自溶物質(zhì)可能對脫分化的早12細(xì)胞脫分化調(diào)控的實(shí)質(zhì)即是G0期細(xì)胞回復(fù)到分裂周期的調(diào)控過程

G1“限制點(diǎn)”G0期缺少外界生長信號或某些必需的營養(yǎng)成分細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和依賴周期蛋白激酶(CDK-細(xì)胞脫分化調(diào)控的實(shí)質(zhì)即是G0期細(xì)胞回復(fù)到分裂周期的調(diào)控過程132001年度的諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎獲得者，美國科學(xué)家Hartwell與英國科學(xué)家Hunt和Nurse的工作揭開了這一過程的調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和依賴周期蛋白激酶(CDKcyclin-dependentkinase)是兩類主要的調(diào)控分子。細(xì)胞周期運(yùn)行的動力主要來自CDK，其活性則主要通過cyclin調(diào)節(jié)和依賴周期蛋白抑制子（CKIcyclin-dependentkinaseinhibitor）的負(fù)調(diào)節(jié)。-2001年度的諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎獲得者，美國科學(xué)家Hart14植物激素是離體培養(yǎng)中所必需的條件，因此與植物激素相關(guān)的基因表達(dá)被認(rèn)為是啟動細(xì)胞脫分化的關(guān)鍵。Takahashi等（1989）從一個葉肉原生質(zhì)體cDNA文庫中分離到一個2,4-D誘導(dǎo)表達(dá)的基因，命名為par。par基因在細(xì)胞從G0期轉(zhuǎn)入S期的早期啟動中具有功能性作用。Kyo等克隆了一組花粉富含硫蛋白(pollen-abundantphosphoproteins)基因NtEPa，NtEPb，NtEPc。其中NtEPc的表達(dá)與花粉細(xì)胞脫分化轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞高度偶聯(lián)，認(rèn)為該基因參與花粉細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞脫分化的過程但不參與細(xì)胞進(jìn)入分裂周期后的調(diào)控過程。-植物激素是離體培養(yǎng)中所必需的條件，因此與植物激素相關(guān)的基因表15不同植物愈傷組織誘導(dǎo)對激素的需求不同，一般分為四類：需生長素的-----菊芋的休眠塊莖需細(xì)胞分裂素的----白蕪菁的根需生長素、細(xì)胞分裂素---煙草的髓、胡蘿卜根、馬鈴薯塊莖需復(fù)雜天然提取物----范圍較廣。-不同植物愈傷組織誘導(dǎo)對激素的需求不同，一般分為四類：-16Matsubayashi和Sakagami（1996）在石刁柏葉肉細(xì)胞低密度懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中，首次分離到2個促分裂肽—phytosulfokine-α和β(PSKα,PSKβ)，檢測分析發(fā)現(xiàn)，在同時有NAA和BA存在的條件下，第一次細(xì)胞分裂發(fā)生在培養(yǎng)96小時，而培養(yǎng)48小時即可檢測到PSKα，在培養(yǎng)基沒有NAA和BA的培養(yǎng)細(xì)胞中，檢測不到PSKα的存在，同時細(xì)胞也停留在G0/G1期而不能啟動分裂，由此推測，PSKα可能介導(dǎo)了與生長素和細(xì)胞分裂素密切相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑-Matsubayashi和Sakagami（1996）在石刁17煙草葉肉細(xì)胞脫分化過程中染色體有2次解凝聚過程。第一次解凝聚發(fā)生在細(xì)胞壁酶解過程中第二次解凝聚發(fā)生在原生質(zhì)體在含有生長素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)36小時第二次解凝聚對于細(xì)胞進(jìn)入S期是十分重要的，發(fā)生二次解凝聚的細(xì)胞在培養(yǎng)72小時后即進(jìn)入S期，在不含植物激素的培養(yǎng)基中細(xì)胞，染色體不發(fā)生第二次解凝聚，以后迅速死亡。第一次染色體解凝聚是細(xì)胞脫分化的轉(zhuǎn)換過程，通過此過程細(xì)胞關(guān)閉分化狀態(tài)，而第二次解凝聚則是有絲分裂周期銜接過程。-煙草葉肉細(xì)胞脫分化過程中染色體有2次解凝聚過程。-18細(xì)胞脫分化與愈傷組織形成細(xì)胞脫分化是細(xì)胞狀態(tài)的改變，但成功的脫分化必然會導(dǎo)致細(xì)胞分裂，對于單個細(xì)胞而言，分化細(xì)胞啟動分裂顯然是發(fā)生在細(xì)胞完全脫分化之后-細(xì)胞脫分化與愈傷組織形成細(xì)胞脫分化是細(xì)胞狀態(tài)的改變，但成功的19*脫分化與愈傷組織的形成在性質(zhì)上是不能等同的，脫分化是細(xì)胞生理狀態(tài)的改變，而形成愈傷組織是離體培養(yǎng)中的一個階段。

盡管細(xì)胞脫分化后進(jìn)入細(xì)胞分裂的結(jié)果，在大多數(shù)情況下是形成愈傷組織，但絕不是說所有的細(xì)胞脫分化的結(jié)果都必然形成愈傷組織，許多試驗(yàn)表明，有些外植體的細(xì)胞脫分化以后直接形成胚性細(xì)胞進(jìn)而形成體細(xì)胞胚。

-*脫分化與愈傷組織的形成在性質(zhì)上是不能等同的，脫分化20愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞并不是均一未分化的，即同一愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞之間其狀態(tài)存在一定差異，特別是在組織器官培養(yǎng)時，往往出現(xiàn)部分細(xì)胞不完全脫分化的現(xiàn)象，從而使其很容易再分化再生植株，這對培養(yǎng)來說無疑是十分有利的。-愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞并不是均一未分化的，即同一愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞之21從外植體到形成愈傷組織可分為三個階段：誘導(dǎo)期---靜止細(xì)胞準(zhǔn)備分裂，其長短各植物不一。誘導(dǎo)期需高生長素和低細(xì)胞分裂素。分裂期（增殖期）---細(xì)胞不斷分裂，可進(jìn)行繼代培養(yǎng)，保持細(xì)胞分裂分化期---出現(xiàn)次生生長，愈傷組織長期不繼代培養(yǎng)，分化是不可避免的。-從外植體到形成愈傷組織可分為三個階段：-22三.細(xì)胞再分化所謂細(xì)胞分化（Differentiation），是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。一個細(xì)胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)和機(jī)能，這是在時間上的分化；同一種細(xì)胞后代，由于所處的環(huán)境不同而可以有相異的形態(tài)和機(jī)能，這是在空間上的分化。-三.細(xì)胞再分化所謂細(xì)胞分化（Differenti23從分化的遺傳控制角度講，細(xì)胞分化是各個處于不同時空條件下的細(xì)胞，基因表達(dá)與修飾差異的反應(yīng)，所以，分化也可以說是相同基因型的細(xì)胞由于基因選擇性表達(dá)所反應(yīng)的各種不同的表現(xiàn)型。在離體條件下，當(dāng)細(xì)胞脫分化以后，無序生長的細(xì)胞及其愈傷組織要重新進(jìn)入有序生長進(jìn)而才能再生個體，因此，通常把離體培養(yǎng)下的這一過程稱為再分化（redifferentiation）。-從分化的遺傳控制角度講，細(xì)胞分化是各個處于不同時空條件下的細(xì)24細(xì)胞分化與基因組變化TE分化及其調(diào)控激素在細(xì)胞分化中的作用極性與細(xì)胞分化-細(xì)胞分化與基因組變化TE分化及其調(diào)控激素在細(xì)胞分化中的作用極25染色體的反復(fù)復(fù)制DNA的差異擴(kuò)增基因重排基因表達(dá)產(chǎn)物及其調(diào)控與修飾是細(xì)胞分化的本質(zhì)所在。越來越多的研究顯示，細(xì)胞分化主要受基因在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，其中一些特異蛋白基因的表達(dá)調(diào)節(jié)在細(xì)胞分化過程中起到了重要作用細(xì)胞分化中的基因組變化-染色體的反復(fù)復(fù)制細(xì)胞分化中的基因組變化-26極性（polarity）是植物細(xì)胞分化中的一個基本現(xiàn)象。

所謂極性是指植物的器官、組織、甚至單個細(xì)胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。在很多情況下，細(xì)胞的不均等分裂是是細(xì)胞極性建立的標(biāo)志。極性與細(xì)胞分化-極性（polarity）是植物細(xì)胞分化中的一個基本現(xiàn)象。極27Fucus合子細(xì)胞不均等分裂及其早期發(fā)育（引自Bouget等，1998）

極性建立與質(zhì)膜離子通道的不對稱分布和細(xì)胞周質(zhì)微管重排有關(guān)-Fucus合子細(xì)胞不均等分裂及其早期發(fā)育（引自Bouget等28通常把離體培養(yǎng)中TE（TEtrachearyelements）細(xì)胞的出現(xiàn)作為組織分化的標(biāo)志而極性的建立似乎又是維管發(fā)生的一個信號，極性建立后生長素按極性方向流動，導(dǎo)致TE細(xì)胞分化由于TE細(xì)胞在分化過程中具有細(xì)胞壁加厚，原生質(zhì)體自溶等容易觀察的細(xì)胞特征，從而又為植物細(xì)胞分化研究提供了模式體系TE的形成與細(xì)胞分化-通常把離體培養(yǎng)中TE（TEtrachearyelemen29百日草葉肉細(xì)胞向TE細(xì)胞分化的主要調(diào)控過程（引自Fukuda，1997）

-百日草葉肉細(xì)胞向TE細(xì)胞分化的主要調(diào)控過程（引自Fukuda30由百日草葉肉細(xì)胞分化形成的TE細(xì)胞（引自Motose,2001）-由百日草葉肉細(xì)胞分化形成的TE細(xì)胞（引自Motose,2031百日草葉肉細(xì)胞向TE分化過程中的基因表達(dá)分析（引自Demura等，2002）-百日草葉肉細(xì)胞向TE分化過程中的基因表達(dá)分析-32激素是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化的主要因素，其中生長素和細(xì)胞分裂素是兩類主要的調(diào)控培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長和分化的植物激素。此外，在有些試驗(yàn)中也顯示，GA3、ABA、乙烯等也在細(xì)胞分化中起到一定調(diào)節(jié)作用。激素對細(xì)胞分化的調(diào)控作用-激素是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化的主要因素，其中生33*在離體條件下，如果用生長素和細(xì)胞分裂素處理的順序不同，其作用也不一樣。如果先用生長素處理，后用細(xì)胞分裂素處理，則有利于細(xì)胞分裂而不利于細(xì)胞分化；反之，則有利于細(xì)胞分化。如果兩者同時處理，則可促使分化頻率的提高。

生長素與細(xì)胞分裂素在細(xì)胞分化中的協(xié)同調(diào)控作用。-*在離體條件下，如果用生長素和細(xì)胞分裂素處理的順序不同，34除了生長素和細(xì)胞分裂素外，赤霉酸（GA）、乙烯（EL）、脫落酸（ABA）、油菜素內(nèi)酯（BR）等植物激素在細(xì)胞分化中的作用也有報(bào)道。越來越多的研究顯示，植物激素對細(xì)胞生長與分化的調(diào)控是一個復(fù)雜的級聯(lián)調(diào)控過程，離體培養(yǎng)條件下，由于外植體細(xì)胞所處的生理狀態(tài)不同以及內(nèi)源激素水平的差異，試圖尋找外源激素水平在分化中作用的共同模式可能是很困難的。-除了生長素和細(xì)胞分裂素外，赤霉酸（GA）、乙烯（EL）、脫落35細(xì)胞脫分化和再分化是離體培養(yǎng)過程中細(xì)胞全能性表現(xiàn)的基本過程，了解這一過程的調(diào)控機(jī)理，最終是為再生個體奠定基礎(chǔ)。生物個體形成是通過形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）實(shí)現(xiàn)的，建立在離體培養(yǎng)基礎(chǔ)上的形態(tài)發(fā)生稱之為體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生（somaticmorphogenesis）。體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生過程及其調(diào)控機(jī)理是細(xì)胞工程學(xué)研究的核心內(nèi)容。

-細(xì)胞脫分化和再分化是離體培養(yǎng)過程中細(xì)胞全能性表現(xiàn)的基本過程，36*第二節(jié)器官發(fā)生

植物的離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的過程。-*第二節(jié)器官發(fā)生

植物的離體器官發(fā)生37器官發(fā)生方式器官發(fā)生過程起始材料對器官分化的影響激素對器官分化的調(diào)控光照對器官分化的影響器官分化的基因調(diào)控-器官發(fā)生方式器官發(fā)生過程起始材料激素對器官光照對器官分化38先芽后根

先根后芽

根芽同步發(fā)生

器官發(fā)生方式一般而言，先芽后根，如先根則抑制芽形成。-先芽后根先根后芽根芽同步發(fā)生器官發(fā)生方式一般而言，先芽39經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生器官發(fā)生過程-經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生器官發(fā)生過程-40經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程愈傷組織形成生長中心形成器官原基及器官形成-經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程愈傷組織形成生長中心形成器官原基41愈傷組織形成-愈傷組織形成-42生長中心形成，具有單向極性，與胚狀體不同-生長中心形成，具有單向極性，與胚狀體不同-43芽形成-芽形成-44芽外生芽內(nèi)生-芽外生芽內(nèi)生-45不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生在有些情況下，外植體不經(jīng)過典型的愈傷組織即可形成器官原基，這一途徑有兩種情況：一是外植體中已存在器官原基，進(jìn)一步培養(yǎng)即形成相應(yīng)組織器官進(jìn)而再生植株，如莖尖、根尖分生組織培養(yǎng)。另一種情況是外植體某些部位的細(xì)胞在重新分裂后，直接形成分生細(xì)胞團(tuán)，然后由分生細(xì)胞團(tuán)形成器官原基。這種不經(jīng)過愈傷組織直接發(fā)生器官的途徑在以品種繁殖為目的的離體培養(yǎng)中具有重要的實(shí)踐意義。-不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生在有些情況下，外植體不經(jīng)過典型的愈傷46a.細(xì)胞第一次平周分裂b.生長中心形成c.原初分生組織d.芽原基形成-a.細(xì)胞第一次平周分裂b.生長中心形成c.原初分生組織d.47外植體的類型母體植物的遺傳基礎(chǔ)起始材料對器官分化的影響-外植體的類型母體植物的遺傳基礎(chǔ)起始材料對器官分化的影響-48總體上說，被子植物比裸子植物容易培養(yǎng)，在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培養(yǎng)成功的報(bào)道最多。通常情況下，自然繁殖以無性繁殖為主的植物在培養(yǎng)條件下也有較強(qiáng)的器官分化的能力同種植物不同品種（基因型）的培養(yǎng)效果具有較大差異已是不爭的事實(shí)?；蛐蛯τ谂囵B(yǎng)反應(yīng)的差異，器官分化能力的差異大于愈傷組織誘導(dǎo)的差異。-總體上說，被子植物比裸子植物容易培養(yǎng)，在被子植物中又以茄科、49外植體對誘導(dǎo)反應(yīng)及其再生能力的影響體還現(xiàn)在生理狀態(tài)上來源于生長活躍或生長潛力大的組織、器官的細(xì)胞更有利于培養(yǎng)對于多年生植物而言，以幼嫩組織為材料無論是誘導(dǎo)還是分化均較容易。一、二年生無性繁殖植物的取材則可塑性較大，但仍以自然繁殖器官為外植體更易成功。-外植體對誘導(dǎo)反應(yīng)及其再生能力的影響體還現(xiàn)在生理狀態(tài)上-50外植體選取合理與否，不僅影響培養(yǎng)的難易，而且有時甚至影響分化的程度和器官類型?；ㄑ繝I養(yǎng)芽，花芽營養(yǎng)芽TranThanhVan等，1974-外植體選取合理與否，不僅影響培養(yǎng)的難易，而且有時甚至影響分化51激素對器官發(fā)生的影響離體培養(yǎng)下的器官分化在大多數(shù)情況下是通過外源提供適宜的植物激素而實(shí)現(xiàn)的。在眾多的植物激素中，生長素與細(xì)胞分裂素是2類主要的植物激素，在離體器官分化調(diào)控中占有主導(dǎo)地位。GA3,PSK在器官分化中也具有一定調(diào)控作用。-激素對器官發(fā)生的影響離體培養(yǎng)下的器官分化在大多數(shù)情況下是通過52生長素/細(xì)胞分裂素高有利于根分化生長素/細(xì)胞分裂素低有利于芽分化生長素與細(xì)胞分裂素必須協(xié)調(diào)使用才能再生正常個體（引自Pierik,1987）-生長素/細(xì)胞分裂素高有利于根分化（引自Pierik,53離體培養(yǎng)中，外源激素在細(xì)胞內(nèi)的吸收和代謝影響到激素的活性從而影響其培養(yǎng)效果。外源細(xì)胞分裂素被外植體吸收后，在細(xì)胞內(nèi)被修飾和轉(zhuǎn)化形成活化形式和鈍化形式。一般認(rèn)為，細(xì)胞分裂素自由堿基形式是活性形式，而核苷形式為鈍化形式。通過細(xì)胞分裂素氧化酶對側(cè)鏈的修飾可能是植物組織細(xì)胞中降低細(xì)胞分裂素活性的主要機(jī)制，在煙草細(xì)胞培養(yǎng)中使用二氫玉米素比使用玉米素更為有效，可能與二氫玉米素核糖苷不是細(xì)胞分裂素氧化酶的底物有關(guān)。-離體培養(yǎng)中，外源激素在細(xì)胞內(nèi)的吸收和代謝影響到激素的活性從而54生長素進(jìn)入細(xì)胞后，一部分以游離狀態(tài)存在，另一部分則與氨基酸結(jié)合形成生長素－氨基酸復(fù)合體。

與生長素結(jié)合的氨基酸主要為天門冬氨酸，也有谷氨酸。

2,4-D、NAA、IAA是常用的3種生長素。

Ribnicky等（1996）的研究顯示，由于生長素種類不同，形成生長素－氨基酸復(fù)合體的量具有顯著差異，從而亦表現(xiàn)出作為外源生長素在培養(yǎng)效果上的差異。-生長素進(jìn)入細(xì)胞后，一部分以游離狀態(tài)存在，另一部分則與氨基酸結(jié)55外源生長素在胡蘿卜上胚軸培養(yǎng)細(xì)胞中的總量和游離生長素含量*培養(yǎng)時間外源生長素濃度生長素游離形式（ng/gFW）總濃度（ng/gFW）1周2,4-DNAA[2H4]IAA23,247.4±3,912.799.3±9.730.3±3.521,979.4±2,526.31,776.7±50.17,557.0±279.04周2,4-DNAA[2H4]IAA20,003.8±4,365.964.8±17.53.4±1.433,119.4±3,835.01,637.0±509.8763.5±420.0*引自Ribnicky等1996。-外源生長素在胡蘿卜上胚軸培養(yǎng)細(xì)胞中的總量和游離生長素含量*56光照是離體培養(yǎng)中比較復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子，光照時間、強(qiáng)度以及光質(zhì)對器官分化均有影響。光照對器官分化的影響-光照是離體培養(yǎng)中比較復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子，光照時間、強(qiáng)度以及光質(zhì)對57連續(xù)的光照有利于培養(yǎng)細(xì)胞維管組織的形成，而一定的晝夜光照周期則有利于極性建立和形態(tài)發(fā)生。培養(yǎng)條件下，光照的作用更大程度上是調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化狀態(tài)，而不是合成光合產(chǎn)物。光照對器官發(fā)生的調(diào)節(jié)可能與調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的內(nèi)源激素平衡有關(guān)，光照還可能影響生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)整生長素的極性運(yùn)輸，從而引起器官分化。光質(zhì)對器官分化的影響可能與光受體精確調(diào)節(jié)系統(tǒng)有關(guān)。-連續(xù)的光照有利于培養(yǎng)細(xì)胞維管組織的形成，而一定的晝夜光照周期58基因調(diào)控

homebox細(xì)胞周期基因

其它-基因調(diào)控homebox細(xì)胞周期基因其它-59Kn1（KNOTTED1）是從玉米中鑒定出的第一個植物homebox基因，Kn1-likehomebox（knox）基因又可分為2組（classI和classII），classIIknox在各種分化組織器官中均表達(dá)，而classIknox只在分生組織中表達(dá)。在玉米和大麥離體培養(yǎng)中，大量不定芽生成的部位也檢測到KN1基因的大量表達(dá)。在一些轉(zhuǎn)Kn1相似基因地研究中表明，轉(zhuǎn)基因植株能大量產(chǎn)生復(fù)合芽以及不定分生組織。STM（SHOOTMERISTEMLESS）基因以及它們的直系同源（orthologues）基因均參與了莖尖分生組織的分化調(diào)控。在轉(zhuǎn)Homeobox相關(guān)基因的煙草植物中還檢測分析到赤霉素含量減少和生長素含量上升的內(nèi)源激素變化，這也暗示，Homeobox基因可能通過一些調(diào)節(jié)因子（如激素）介導(dǎo)調(diào)控器官分化。-Kn1（KNOTTED1）是從玉米中鑒定出的第一個植物hom60植物編碼細(xì)胞周期依賴性激酶基因cdc2在離體培養(yǎng)中，調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入分裂狀態(tài)的過程起著關(guān)鍵性作用，在玉米和大麥離體培養(yǎng)中，cdc2的表達(dá)高峰發(fā)生在不定芽形成的過程中，在培養(yǎng)初期的表達(dá)量較少，同時，該基因的表達(dá)部位處于分生組織的外層細(xì)胞，因此認(rèn)為，cdc2基因?qū)Ψ稚M織的形成和維持分生組織狀態(tài)均有重要作用。-植物編碼細(xì)胞周期依賴性激酶基因cdc2在離體培養(yǎng)中，調(diào)節(jié)細(xì)胞61Banno等（2001）從擬南芥根培養(yǎng)再生芽的體系中克隆了一個增強(qiáng)芽再生能力的基因ESR1，將該基因與35S啟動子連接轉(zhuǎn)化擬南芥，在有細(xì)胞分裂素存在的情況下轉(zhuǎn)基因外植體可以顯著提高不定芽的分化率。而生長素不能誘導(dǎo)該基因表達(dá)，同樣也不能提高不定芽分化頻率。-Banno等（2001）從擬南芥根培養(yǎng)再生芽的體系中克隆了一62從煙草溫度突變體中鑒定出3個與離體器官發(fā)生有關(guān)的基因SRD1、SRD2和SRD3，當(dāng)它們發(fā)生隱形突變時，在離體培養(yǎng)中表現(xiàn)出器官發(fā)生在不同時期受阻，3個基因均定位于擬南芥I號染色體上。（引自Cary等，2001）-從煙草溫度突變體中鑒定出3個與離體器官發(fā)生有關(guān)的基因SRD163--64*第三節(jié)體細(xì)胞胚胎發(fā)生

離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚的類似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞），統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。

-*第三節(jié)體細(xì)胞胚胎發(fā)生

離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過65這一定義有以下幾方面的界定：其一，體細(xì)胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于離體培養(yǎng)范圍使用，以區(qū)別于無融合生殖胚；其二，體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，以區(qū)別于合子胚；其三，體細(xì)胞經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程，以區(qū)別與離體培中器官發(fā)生形成個體的途徑。其四，胚狀體最根本的特征是具有兩極性，即在發(fā)育早期階段能從相反的兩個方向分化出莖端和根端，可一次再生完整的植株。而不定根和不定芽都是單極性的，必須先誘導(dǎo)芽再生根。-這一定義有以下幾方面的界定：-66體細(xì)胞胚的形成體細(xì)胞胚的發(fā)育與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素體細(xì)胞胚發(fā)生的生化與分子基礎(chǔ)-體細(xì)胞胚的形成體細(xì)胞胚的發(fā)育與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素67直接途徑一.體細(xì)胞胚的形成間接途徑-直接途徑一.體細(xì)胞胚的形成間接-68體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生1.誘導(dǎo)階段2.胚胎發(fā)育階段（引自Chen等,1999）

-體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生1.誘導(dǎo)階段2.胚胎發(fā)育階段（69經(jīng)過愈傷組織的體細(xì)胞胚形成經(jīng)過懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚形成間接發(fā)生-經(jīng)過愈傷組織的體細(xì)胞胚形成經(jīng)過懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚形成間接發(fā)生70誘導(dǎo)愈傷組織形成愈傷組織胚性化球性胚形成子葉胚期（引自Lin等，2000）

-誘導(dǎo)愈傷組織形成愈傷組織胚性化球性胚形成子葉胚期（引自Lin71愈傷組織胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)的胚性細(xì)胞團(tuán)球性胚形成成熟子葉胚（引自Choi等，1997）

-愈傷組織胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)的胚性細(xì)胞團(tuán)球性胚形成成熟子葉胚72體細(xì)胞胚發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)體細(xì)胞胚的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)二.體細(xì)胞胚的發(fā)育與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)-體細(xì)胞胚發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)體細(xì)胞胚的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)二.體細(xì)胞胚的發(fā)73類似于植物合子胚的發(fā)育早期原胚發(fā)生胚胎細(xì)胞發(fā)生球形胚形成完整胚結(jié)構(gòu)形成（引自Figueroa等，2002）

-類似于植物合子胚的發(fā)育早期原胚發(fā)生胚胎細(xì)胞發(fā)生球形胚形成完整74類似于動物胚胎早期的發(fā)育胚胎細(xì)胞發(fā)生發(fā)育早期2次均等分裂胚結(jié)構(gòu)的形成（引自Fifueroa等，2002）

-類似于動物胚胎早期的發(fā)育胚胎細(xì)胞發(fā)生發(fā)育早期2次均等分裂胚結(jié)75結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與器官發(fā)生形成個體的途徑相比，體細(xì)胞胚發(fā)育再生植株有兩個明顯的特點(diǎn)：一是體細(xì)胞胚具有雙極性（doulblepolarity）；二是體細(xì)胞胚形成后與母體的維管束系統(tǒng)連系較少，即出現(xiàn)所謂的生理隔離（physiologicalisolation）現(xiàn)象。-結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與器官發(fā)生形成個體的途徑相比，體細(xì)胞胚發(fā)育再生76*合子胚：發(fā)育初期具有明顯的胚柄，

體細(xì)胞胚:沒有真正的胚柄,只有類似胚柄的結(jié)構(gòu)。

合子胚:子葉是相當(dāng)規(guī)范

體細(xì)胞胚:子葉常不規(guī)范。體積明顯小于合子胚，

合子胚在胚胎發(fā)育完全進(jìn)入子葉期胚以后，經(jīng)過一系列的物質(zhì)積累和脫水就進(jìn)入休眠，

體細(xì)胞胚沒有明顯的脫水干燥過程,在心形期以后的各個階段均可直接形成植株。-*合子胚：發(fā)育初期具有明顯的胚柄，

體細(xì)胞胚:77三.影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素激素的調(diào)控作用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的影響基因型的影響-三.影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素激素的調(diào)控作用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件782,4-D是應(yīng)用最為廣泛的生長素。2,4-D的應(yīng)用有著規(guī)律性的變化，首先是在較高濃度下誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的形成，然后在降低2,4-D的濃度下產(chǎn)生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生長素有利于體細(xì)胞胚的繼續(xù)發(fā)育?，F(xiàn)有研究證明，在球形胚期形成的生長素極性運(yùn)輸對于體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育尤為重要，如果球形胚阻斷生長素的極性運(yùn)輸或改變生長素的極性運(yùn)輸方向，均會影響體細(xì)胞胚的正常發(fā)育。激素的調(diào)控作用-2,4-D是應(yīng)用最為廣泛的生長素。2,4-D的應(yīng)用有著規(guī)律性79細(xì)胞分裂素對體細(xì)胞胚發(fā)育的影響研究報(bào)道較少，但幾乎所有的有關(guān)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的培養(yǎng)基配方中，均有細(xì)胞分裂素的配合使用。細(xì)胞分裂素在促進(jìn)細(xì)胞分裂，維持細(xì)胞活躍生長中具有重要生理功能，而完成體細(xì)胞胚胎發(fā)育細(xì)胞分裂是基本前體，當(dāng)胚胎結(jié)構(gòu)建立后，細(xì)胞分裂素對于維持分生組織正常發(fā)育具有重要作用。-細(xì)胞分裂素對體細(xì)胞胚發(fā)育的影響研究報(bào)道較少，但幾乎所有的有關(guān)80培養(yǎng)基中的氮源亦會顯著影響離體條件下的胚胎發(fā)生，體細(xì)胞胚的產(chǎn)生要求培養(yǎng)基中含有一定濃度的還原態(tài)氮。Vesco和Guerra在Feijoa植物體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的試驗(yàn)也證明，培養(yǎng)基氮源影響體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率。在NH4+和NO3-（15:34）的培養(yǎng)基中，每個外植體的體細(xì)胞胚可達(dá)10個以上，而培養(yǎng)基只有NH4+或NO3-時，體細(xì)胞胚發(fā)生頻率很低。一些氨基酸可以代替還原態(tài)氮的作用，上述Feijoa植物的體細(xì)胞胚培養(yǎng)體系，在只含NO3-的培養(yǎng)基中，如果加入4mM的甘氨酸，可以顯著提高體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率。培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的影響-培養(yǎng)基中的氮源亦會顯著影響離體條件下的胚胎發(fā)生，體細(xì)胞胚的產(chǎn)81一些體細(xì)胞胚規(guī)模生產(chǎn)模式的試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，球形胚形成后，如果降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，可以顯著促進(jìn)體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育。Choi等（2002）在西伯利亞人參（E.senticosus）培養(yǎng)中證明，在體細(xì)胞胚培養(yǎng)后期，降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，可顯著提高體細(xì)胞胚的成苗率。在一些試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞胚發(fā)育后期降低蔗糖濃度，也有利于胚的繼續(xù)發(fā)育和提高體細(xì)胞胚的成苗率。-一些體細(xì)胞胚規(guī)模生產(chǎn)模式的試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，球形胚形成后，如果降低82Lee等（2001）在改進(jìn)胡蘿卜體細(xì)胞胚生產(chǎn)程序的試驗(yàn)中，將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入減少濃度的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，結(jié)果顯示，當(dāng)胚性愈傷組織形成后，在只含1/2MS無機(jī)鹽濃度的培養(yǎng)基中，體細(xì)胞胚形成可以比在MS培養(yǎng)基中高3－4倍。-Lee等（2001）在改進(jìn)胡蘿卜體細(xì)胞胚生產(chǎn)程序的試驗(yàn)中，將83Choi等（2002）在西伯利亞人參（E.senticosus）培養(yǎng)中也證明，在體細(xì)胞胚培養(yǎng)后期，降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，可顯著提高體細(xì)胞胚的成苗率。-Choi等（2002）在西伯利亞人參（E.senticosu84馬鈴薯不同基因型體細(xì)胞胚形成能力比較（引自Seabrook和Douglass，2001）基因型的影響-馬鈴薯不同基因型體細(xì)胞胚形成能力比較基因型的影響-85內(nèi)源激素調(diào)控基因特異蛋白四.體細(xì)胞胚胎發(fā)生的生化與分子基礎(chǔ)-內(nèi)源激素調(diào)控基因特異蛋白四.體細(xì)胞胚胎發(fā)生的生化與分子基礎(chǔ)86外源生長素的對體細(xì)胞胚產(chǎn)生和發(fā)育的調(diào)控是通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素的合成、代謝、極性運(yùn)輸和平衡而起作用的。Ribnicky等在胡蘿卜上胚軸培養(yǎng)中證明，體細(xì)胞胚形成初期細(xì)胞內(nèi)具有較高濃度的游離態(tài)生長素，外源2,4-D和NAA比IAA誘導(dǎo)體細(xì)胞胚效果好，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)初期，細(xì)胞內(nèi)高濃度的游離生長素是必要條件，直接添加外源IAA對其合成有反饋抑制，從而也影響體細(xì)胞胚的形成，而2,4-D對IAA的合成不存在反饋抑制，其結(jié)果也提高了體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率。水稻胚性細(xì)胞的誘導(dǎo)也證明，高濃度的2,4-D引誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)IAA含量升高，當(dāng)加入外源IAA或阻止細(xì)胞內(nèi)IAA滲出而提高細(xì)胞內(nèi)IAA含量時，均可促進(jìn)胚性愈傷組織形成。-外源生長素的對體細(xì)胞胚產(chǎn)生和發(fā)育的調(diào)控是通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素的合87胡蘿卜胚發(fā)育過程中內(nèi)源IAA的變化發(fā)育時期胚大?。é蘭）IAA濃度（ng/gFW）自由態(tài)結(jié)合肽總含量受精前子房受精前子房受精后子房受精后子房球形胚晚期/心形胚早期魚雷形胚早期魚雷形胚晚期

75-12575-125125-225400-500900-110015±428±5608±69504±522060±69624±527±42257±4241962±5634986±5951063±4827490±3440824±386796±2922272±4131990±4835594±5821567±4639550±4126848±392823±289（引自Ribnichy等2002）

-胡蘿卜胚發(fā)育過程中內(nèi)源IAA的變化發(fā)育時期胚大小IAA濃88生長素不僅影響體細(xì)胞胚的早期發(fā)生，同時也影響體細(xì)胞胚的后期發(fā)育。生長素對體細(xì)胞胚后期發(fā)育的影響是通過極性運(yùn)輸實(shí)現(xiàn)的。在合子胚的發(fā)育中，這種極性運(yùn)輸嚴(yán)重影響胚形態(tài)的建立。Liu等（1993）利用擬南芥幼胚培養(yǎng)體系，揭示了生長素極性運(yùn)輸由球形胚期得軸向?qū)ΨQ轉(zhuǎn)向心形胚期的兩側(cè)對稱的過程，如果這一過程受阻，則導(dǎo)致子葉異常發(fā)育成筒狀子葉，而不是正常的2個子葉。在生長素極性運(yùn)輸突變體pin1中證實(shí)了上述結(jié)果，已克隆的pin同源基因研究顯示，生長素的極性運(yùn)輸及其對胚胎發(fā)育的調(diào)控，是一系列胚胎發(fā)育相關(guān)基因有序表達(dá)到結(jié)果。-生長素不僅影響體細(xì)胞胚的早期發(fā)生，同時也影響體細(xì)胞胚的后期發(fā)89有關(guān)體細(xì)胞胚形成中蛋白質(zhì)含量和組分的變化，盡管不同研究在絕對含量上不盡相同，但總體趨勢均表現(xiàn)出體細(xì)胞胚形成過程中水溶性蛋白明顯增加。李中奎等（1993）比較水稻胚性與非胚性愈傷組織的蛋白質(zhì)含量變化顯示，兩種愈傷組織蛋白質(zhì)含量的差異主要表現(xiàn)為胚性愈傷組織的水溶性和鹽溶性蛋白高于非胚性愈傷組織，而醇溶性蛋白則低于非胚性愈傷組織。特異蛋白-有關(guān)體細(xì)胞胚形成中蛋白質(zhì)含量和組分的變化，盡管不同研究在絕對90阿拉伯半乳糖蛋白（AGPs）是植物中廣泛存在的糖蛋白，大多數(shù)AGPs存在有Ala-Hyp重復(fù)序列或類似重復(fù)序列，暗示AGPs可能作為調(diào)控蛋白調(diào)控某些基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞中，AGPs主要分布在細(xì)胞壁和質(zhì)膜上，利用一系列單克隆抗體已鑒定出一些與特殊發(fā)育相關(guān)和特殊組織相關(guān)的AGPs，其中與單克隆抗體JIM8抗體結(jié)合的AGPs在油菜中主要存在性細(xì)胞中、胚胎發(fā)育早期的胚柄中。在胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)育中，這種抗體檢測的AGPs存在于胚性細(xì)胞和早期體細(xì)胞胚中，在非胚性細(xì)胞中沒有AGPs，如果在一些非胚性懸浮細(xì)胞系中加入這類AGPs，則可使其恢復(fù)胚胎發(fā)生能力，顯示AGPs在植物體細(xì)胞胚發(fā)生過程中起到了調(diào)控作用。特異蛋白-阿拉伯半乳糖蛋白（AGPs）是植物中廣泛存在的糖蛋白，大多數(shù)91近年來的研究發(fā)現(xiàn)，某些病程相關(guān)蛋白可能也與體細(xì)胞胚的形成有關(guān)。vanHengel（1998）在胡蘿卜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞衍生的原生質(zhì)體培養(yǎng)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚過程中，隨著體細(xì)胞胚的形成在培養(yǎng)基中檢測到幾丁酯酶（chitinases）和AGPs的積累；Dubois等（1991）在菊芋的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn)，β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanases）與愈傷葡聚糖降解有關(guān)，推測該酶可能與體細(xì)胞胚形成有關(guān)。Helleboid等（2000）在菊芋懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中比較了胚性和非胚性細(xì)胞蛋白質(zhì)組分差異，結(jié)果顯示，胚性細(xì)胞中3種不同組分（38kD、32kD、25kD）的蛋白質(zhì)顯著高于非胚性細(xì)胞。進(jìn)一步分析顯示，這些組分的蛋白質(zhì)主要是β-1,3-葡聚糖酶、幾丁酯酶和滲透相似蛋白（osmotin-likeprotein）。特異蛋白-近年來的研究發(fā)現(xiàn)，某些病程相關(guān)蛋白可能也與體細(xì)胞胚的形成有關(guān)92

胡蘿卜體細(xì)胞胚形成相關(guān)的部分基因基因表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)時期資料來源DC8

DC59DC3EMB-1ECP31ECP40EP2EP3DC2.1DC7.1DC9.1EF1-aCEM1

Gea14Gea31Gea41LEA(Grp3)

OleosinLEA(Grp3)LEA(Grp1)LEA(Grp4)LEA(Grp2)LipidtransferChintinasePro-richproteinGly-richproteinGly-richproteinElongationfactorEF1-a

LipidtransferPR-proteinHeat-shock心形胚

心形胚原胚、球形胚、心形胚球形胚、心形胚原胚原胚原胚原胚球形胚、心形胚、魚雷胚球形胚、心形胚胚性細(xì)胞、原胚球形胚原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚胚性細(xì)胞、球形胚、心形胚胚性細(xì)胞、球形胚、心形胚、魚雷胚、小植株球形胚、心形胚Borrkird等，1986；Franz等，1989；Halzopoulos等，1990Choi等，1987；Hatzopoulos等，1990Wilde等，1988；Vivekananda等，1992Ulrich等，1990；Wurtele等，1993Kiyosue等，1992，1993

DeVries等，1988；Sterk等，1991DeJong等，1992Aleith和Richter,1990

Apuya和Zimmerman，1992Kawahara等，1992

Liu等，1996

調(diào)控基因-

胡蘿卜體細(xì)胞胚形成相關(guān)的部分基因基因表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)93從已鑒定的基因表達(dá)時序分析，可分為3類：第一類是涉及到胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變和體細(xì)胞胚早期形態(tài)建立的基因，如ECP31、ECP40、EP2、EP3、DC9.1、EF1-a等，這類基因?qū)w細(xì)胞胚的早期發(fā)育極為重要，一些突變體分析顯示，當(dāng)這些基因突變時，則體細(xì)胞胚不能正常形成。第二類是體細(xì)胞胚胎的整個發(fā)生和發(fā)育過程中始終表達(dá)到基因，有的甚至持續(xù)到再生植株，如Gea31。第三類就是與體細(xì)胞胚發(fā)育過程有關(guān)的基因，如DC8、DC59、DC3、EMB-1、DC2.1、DC7.1、Gea41等，在此類基因中，不同基因在胚胎發(fā)育的不同時期其表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)順序亦有差異，如EMB-1、Gea41和DC7.1只在球形胚至心形胚期間表達(dá)，而DC8和DC59只在心形胚期間表達(dá)。調(diào)控基因-從已鑒定的基因表達(dá)時序分析，可分為3類：調(diào)控基因-94--95*第二章細(xì)胞全能性與形態(tài)發(fā)生

第一節(jié)細(xì)胞全能性及其表達(dá)

第二節(jié)器官發(fā)生

第三節(jié)體細(xì)胞胚胎發(fā)生-*第二章細(xì)胞全能性與形態(tài)發(fā)生

第一節(jié)96第一節(jié)細(xì)胞全能性及其表達(dá)細(xì)胞全能性概述細(xì)胞脫分化細(xì)胞再分化-第一節(jié)細(xì)胞全能性及其表達(dá)細(xì)胞全能性概述細(xì)胞脫分化細(xì)胞再分97細(xì)胞的全能性----

一個細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整生物個體的固有能力。細(xì)胞全能性的絕對性與相對性:

不是所有基因型的所有細(xì)胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應(yīng);即使對于植物細(xì)胞而言，細(xì)胞全能性也并不意味著任何細(xì)胞均可以直接產(chǎn)生植物個體;動、植物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異。一.細(xì)胞全能性概述-細(xì)胞的全能性----一個細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整生物個體的固有98植物細(xì)胞按照分裂能力分為三類：第一類是始終保持分裂能力，從一個周期進(jìn)入另一個周期的周期細(xì)胞。如莖尖、根尖及形成層細(xì)胞；第二類是永久失去分裂能力的細(xì)胞，為終端分化細(xì)胞。如篩管、導(dǎo)管、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等特化細(xì)胞；第三類是在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可重新啟動分裂的Go細(xì)胞。表皮細(xì)胞及各種薄壁細(xì)胞。-植物細(xì)胞按照分裂能力分為三類：-99一個植物細(xì)胞向分生狀態(tài)回復(fù)過程所能進(jìn)行的程度，取決于它在自然部位上所處位置和生理狀態(tài)。（引自Gautheret,1966）-一個植物細(xì)胞向分生狀態(tài)回復(fù)過程所能進(jìn)行的程度，取決于它在自然100植物細(xì)胞全能性表現(xiàn)根據(jù)細(xì)胞類型不同從強(qiáng)到弱:

營養(yǎng)生長中心>形成層>薄壁細(xì)胞>厚壁細(xì)胞(木質(zhì)化細(xì)胞)>特化細(xì)胞(篩管、導(dǎo)管細(xì)胞)；根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同從強(qiáng)到弱為：頂端分生組織>居間分生組織>側(cè)生分生組織>薄壁組織(基本組織)>厚角組織>輸導(dǎo)組織>厚壁組織。-植物細(xì)胞全能性表現(xiàn)根據(jù)細(xì)胞類型不同從強(qiáng)到弱:-101細(xì)胞全能性脫分化再分化細(xì)胞分裂個體再生細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過細(xì)胞脫分化和再分化實(shí)現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的前體，再分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的最終體現(xiàn)。-細(xì)胞全能性脫分化再分化細(xì)胞分裂個體再生細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過102二.細(xì)胞脫分化細(xì)胞生理與結(jié)構(gòu)變化細(xì)胞脫分化調(diào)控機(jī)理細(xì)胞分裂與愈傷組織形成-二.細(xì)胞脫分化細(xì)胞生理與結(jié)構(gòu)變化細(xì)胞脫分化調(diào)控機(jī)103培養(yǎng)條件下使一個已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過程就是細(xì)胞脫分化（dedifferentiation）。離體培養(yǎng)下，脫分化過程發(fā)生在第一次有絲分裂之前.靜止細(xì)胞啟動分裂是分化細(xì)胞成功脫分化的重要標(biāo)志。細(xì)胞脫分化過程中生理和結(jié)構(gòu)變化-培養(yǎng)條件下使一個已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀104薄壁細(xì)胞：

細(xì)胞核較小，核位于細(xì)胞邊緣，細(xì)胞中央有大的液泡，細(xì)胞體內(nèi)核糖體密度較低，多聚核糖體數(shù)目較少，質(zhì)體為分化程度較高的葉綠體、雜色體、白色體和淀粉體。脫分化細(xì)胞：

細(xì)胞質(zhì)顯著變濃，大液泡消失，核體積增加并逐漸移位至細(xì)胞中央，細(xì)胞器增加。在這些變化中，液泡蛋白體的出現(xiàn)和質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體被認(rèn)為是細(xì)胞脫分化的重要特征。-薄壁細(xì)胞：脫分化細(xì)胞：-105細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理細(xì)胞周期對脫分化的調(diào)控

激素誘導(dǎo)表達(dá)基因與細(xì)胞脫分化PSK的發(fā)現(xiàn)及其對細(xì)胞脫分化的影響細(xì)胞脫分化與染色體解凝聚環(huán)境因素的作用-細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理細(xì)胞周期對脫分化的調(diào)控激素誘導(dǎo)表達(dá)1061.損傷作用-----損傷細(xì)胞產(chǎn)生的自溶物質(zhì)可能對脫分化的早期誘導(dǎo)起作用。2光線----影響外植體最初的分裂3.氧-----有利于脫分化-1.損傷作用-----損傷細(xì)胞產(chǎn)生的自溶物質(zhì)可能對脫分化的早107細(xì)胞脫分化調(diào)控的實(shí)質(zhì)即是G0期細(xì)胞回復(fù)到分裂周期的調(diào)控過程

G1“限制點(diǎn)”G0期缺少外界生長信號或某些必需的營養(yǎng)成分細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和依賴周期蛋白激酶(CDK-細(xì)胞脫分化調(diào)控的實(shí)質(zhì)即是G0期細(xì)胞回復(fù)到分裂周期的調(diào)控過程1082001年度的諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎獲得者，美國科學(xué)家Hartwell與英國科學(xué)家Hunt和Nurse的工作揭開了這一過程的調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和依賴周期蛋白激酶(CDKcyclin-dependentkinase)是兩類主要的調(diào)控分子。細(xì)胞周期運(yùn)行的動力主要來自CDK，其活性則主要通過cyclin調(diào)節(jié)和依賴周期蛋白抑制子（CKIcyclin-dependentkinaseinhibitor）的負(fù)調(diào)節(jié)。-2001年度的諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎獲得者，美國科學(xué)家Hart109植物激素是離體培養(yǎng)中所必需的條件，因此與植物激素相關(guān)的基因表達(dá)被認(rèn)為是啟動細(xì)胞脫分化的關(guān)鍵。Takahashi等（1989）從一個葉肉原生質(zhì)體cDNA文庫中分離到一個2,4-D誘導(dǎo)表達(dá)的基因，命名為par。par基因在細(xì)胞從G0期轉(zhuǎn)入S期的早期啟動中具有功能性作用。Kyo等克隆了一組花粉富含硫蛋白(pollen-abundantphosphoproteins)基因NtEPa，NtEPb，NtEPc。其中NtEPc的表達(dá)與花粉細(xì)胞脫分化轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞高度偶聯(lián)，認(rèn)為該基因參與花粉細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞脫分化的過程但不參與細(xì)胞進(jìn)入分裂周期后的調(diào)控過程。-植物激素是離體培養(yǎng)中所必需的條件，因此與植物激素相關(guān)的基因表110不同植物愈傷組織誘導(dǎo)對激素的需求不同，一般分為四類：需生長素的-----菊芋的休眠塊莖需細(xì)胞分裂素的----白蕪菁的根需生長素、細(xì)胞分裂素---煙草的髓、胡蘿卜根、馬鈴薯塊莖需復(fù)雜天然提取物----范圍較廣。-不同植物愈傷組織誘導(dǎo)對激素的需求不同，一般分為四類：-111Matsubayashi和Sakagami（1996）在石刁柏葉肉細(xì)胞低密度懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中，首次分離到2個促分裂肽—phytosulfokine-α和β(PSKα,PSKβ)，檢測分析發(fā)現(xiàn)，在同時有NAA和BA存在的條件下，第一次細(xì)胞分裂發(fā)生在培養(yǎng)96小時，而培養(yǎng)48小時即可檢測到PSKα，在培養(yǎng)基沒有NAA和BA的培養(yǎng)細(xì)胞中，檢測不到PSKα的存在，同時細(xì)胞也停留在G0/G1期而不能啟動分裂，由此推測，PSKα可能介導(dǎo)了與生長素和細(xì)胞分裂素密切相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑-Matsubayashi和Sakagami（1996）在石刁112煙草葉肉細(xì)胞脫分化過程中染色體有2次解凝聚過程。第一次解凝聚發(fā)生在細(xì)胞壁酶解過程中第二次解凝聚發(fā)生在原生質(zhì)體在含有生長素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)36小時第二次解凝聚對于細(xì)胞進(jìn)入S期是十分重要的，發(fā)生二次解凝聚的細(xì)胞在培養(yǎng)72小時后即進(jìn)入S期，在不含植物激素的培養(yǎng)基中細(xì)胞，染色體不發(fā)生第二次解凝聚，以后迅速死亡。第一次染色體解凝聚是細(xì)胞脫分化的轉(zhuǎn)換過程，通過此過程細(xì)胞關(guān)閉分化狀態(tài)，而第二次解凝聚則是有絲分裂周期銜接過程。-煙草葉肉細(xì)胞脫分化過程中染色體有2次解凝聚過程。-113細(xì)胞脫分化與愈傷組織形成細(xì)胞脫分化是細(xì)胞狀態(tài)的改變，但成功的脫分化必然會導(dǎo)致細(xì)胞分裂，對于單個細(xì)胞而言，分化細(xì)胞啟動分裂顯然是發(fā)生在細(xì)胞完全脫分化之后-細(xì)胞脫分化與愈傷組織形成細(xì)胞脫分化是細(xì)胞狀態(tài)的改變，但成功的114*脫分化與愈傷組織的形成在性質(zhì)上是不能等同的，脫分化是細(xì)胞生理狀態(tài)的改變，而形成愈傷組織是離體培養(yǎng)中的一個階段。

盡管細(xì)胞脫分化后進(jìn)入細(xì)胞分裂的結(jié)果，在大多數(shù)情況下是形成愈傷組織，但絕不是說所有的細(xì)胞脫分化的結(jié)果都必然形成愈傷組織，許多試驗(yàn)表明，有些外植體的細(xì)胞脫分化以后直接形成胚性細(xì)胞進(jìn)而形成體細(xì)胞胚。

-*脫分化與愈傷組織的形成在性質(zhì)上是不能等同的，脫分化115愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞并不是均一未分化的，即同一愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞之間其狀態(tài)存在一定差異，特別是在組織器官培養(yǎng)時，往往出現(xiàn)部分細(xì)胞不完全脫分化的現(xiàn)象，從而使其很容易再分化再生植株，這對培養(yǎng)來說無疑是十分有利的。-愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞并不是均一未分化的，即同一愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞之116從外植體到形成愈傷組織可分為三個階段：誘導(dǎo)期---靜止細(xì)胞準(zhǔn)備分裂，其長短各植物不一。誘導(dǎo)期需高生長素和低細(xì)胞分裂素。分裂期（增殖期）---細(xì)胞不斷分裂，可進(jìn)行繼代培養(yǎng)，保持細(xì)胞分裂分化期---出現(xiàn)次生生長，愈傷組織長期不繼代培養(yǎng)，分化是不可避免的。-從外植體到形成愈傷組織可分為三個階段：-117三.細(xì)胞再分化所謂細(xì)胞分化（Differentiation），是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。一個細(xì)胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)和機(jī)能，這是在時間上的分化；同一種細(xì)胞后代，由于所處的環(huán)境不同而可以有相異的形態(tài)和機(jī)能，這是在空間上的分化。-三.細(xì)胞再分化所謂細(xì)胞分化（Differenti118從分化的遺傳控制角度講，細(xì)胞分化是各個處于不同時空條件下的細(xì)胞，基因表達(dá)與修飾差異的反應(yīng)，所以，分化也可以說是相同基因型的細(xì)胞由于基因選擇性表達(dá)所反應(yīng)的各種不同的表現(xiàn)型。在離體條件下，當(dāng)細(xì)胞脫分化以后，無序生長的細(xì)胞及其愈傷組織要重新進(jìn)入有序生長進(jìn)而才能再生個體，因此，通常把離體培養(yǎng)下的這一過程稱為再分化（redifferentiation）。-從分化的遺傳控制角度講，細(xì)胞分化是各個處于不同時空條件下的細(xì)119細(xì)胞分化與基因組變化TE分化及其調(diào)控激素在細(xì)胞分化中的作用極性與細(xì)胞分化-細(xì)胞分化與基因組變化TE分化及其調(diào)控激素在細(xì)胞分化中的作用極120染色體的反復(fù)復(fù)制DNA的差異擴(kuò)增基因重排基因表達(dá)產(chǎn)物及其調(diào)控與修飾是細(xì)胞分化的本質(zhì)所在。越來越多的研究顯示，細(xì)胞分化主要受基因在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，其中一些特異蛋白基因的表達(dá)調(diào)節(jié)在細(xì)胞分化過程中起到了重要作用細(xì)胞分化中的基因組變化-染色體的反復(fù)復(fù)制細(xì)胞分化中的基因組變化-121極性（polarity）是植物細(xì)胞分化中的一個基本現(xiàn)象。

所謂極性是指植物的器官、組織、甚至單個細(xì)胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。在很多情況下，細(xì)胞的不均等分裂是是細(xì)胞極性建立的標(biāo)志。極性與細(xì)胞分化-極性（polarity）是植物細(xì)胞分化中的一個基本現(xiàn)象。極122Fucus合子細(xì)胞不均等分裂及其早期發(fā)育（引自Bouget等，1998）

極性建立與質(zhì)膜離子通道的不對稱分布和細(xì)胞周質(zhì)微管重排有關(guān)-Fucus合子細(xì)胞不均等分裂及其早期發(fā)育（引自Bouget等123通常把離體培養(yǎng)中TE（TEtrachearyelements）細(xì)胞的出現(xiàn)作為組織分化的標(biāo)志而極性的建立似乎又是維管發(fā)生的一個信號，極性建立后生長素按極性方向流動，導(dǎo)致TE細(xì)胞分化由于TE細(xì)胞在分化過程中具有細(xì)胞壁加厚，原生質(zhì)體自溶等容易觀察的細(xì)胞特征，從而又為植物細(xì)胞分化研究提供了模式體系TE的形成與細(xì)胞分化-通常把離體培養(yǎng)中TE（TEtrachearyelemen124百日草葉肉細(xì)胞向TE細(xì)胞分化的主要調(diào)控過程（引自Fukuda，1997）

-百日草葉肉細(xì)胞向TE細(xì)胞分化的主要調(diào)控過程（引自Fukuda125由百日草葉肉細(xì)胞分化形成的TE細(xì)胞（引自Motose,2001）-由百日草葉肉細(xì)胞分化形成的TE細(xì)胞（引自Motose,20126百日草葉肉細(xì)胞向TE分化過程中的基因表達(dá)分析（引自Demura等，2002）-百日草葉肉細(xì)胞向TE分化過程中的基因表達(dá)分析-127激素是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化的主要因素，其中生長素和細(xì)胞分裂素是兩類主要的調(diào)控培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長和分化的植物激素。此外，在有些試驗(yàn)中也顯示，GA3、ABA、乙烯等也在細(xì)胞分化中起到一定調(diào)節(jié)作用。激素對細(xì)胞分化的調(diào)控作用-激素是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化的主要因素，其中生128*在離體條件下，如果用生長素和細(xì)胞分裂素處理的順序不同，其作用也不一樣。如果先用生長素處理，后用細(xì)胞分裂素處理，則有利于細(xì)胞分裂而不利于細(xì)胞分化；反之，則有利于細(xì)胞分化。如果兩者同時處理，則可促使分化頻率的提高。

生長素與細(xì)胞分裂素在細(xì)胞分化中的協(xié)同調(diào)控作用。-*在離體條件下，如果用生長素和細(xì)胞分裂素處理的順序不同，129除了生長素和細(xì)胞分裂素外，赤霉酸（GA）、乙烯（EL）、脫落酸（ABA）、油菜素內(nèi)酯（BR）等植物激素在細(xì)胞分化中的作用也有報(bào)道。越來越多的研究顯示，植物激素對細(xì)胞生長與分化的調(diào)控是一個復(fù)雜的級聯(lián)調(diào)控過程，離體培養(yǎng)條件下，由于外植體細(xì)胞所處的生理狀態(tài)不同以及內(nèi)源激素水平的差異，試圖尋找外源激素水平在分化中作用的共同模式可能是很困難的。-除了生長素和細(xì)胞分裂素外，赤霉酸（GA）、乙烯（EL）、脫落130細(xì)胞脫分化和再分化是離體培養(yǎng)過程中細(xì)胞全能性表現(xiàn)的基本過程，了解這一過程的調(diào)控機(jī)理，最終是為再生個體奠定基礎(chǔ)。生物個體形成是通過形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）實(shí)現(xiàn)的，建立在離體培養(yǎng)基礎(chǔ)上的形態(tài)發(fā)生稱之為體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生（somaticmorphogenesis）。體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生過程及其調(diào)控機(jī)理是細(xì)胞工程學(xué)研究的核心內(nèi)容。

-細(xì)胞脫分化和再分化是離體培養(yǎng)過程中細(xì)胞全能性表現(xiàn)的基本過程，131*第二節(jié)器官發(fā)生

植物的離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的過程。-*第二節(jié)器官發(fā)生

植物的離體器官發(fā)生132器官發(fā)生方式器官發(fā)生過程起始材料對器官分化的影響激素對器官分化的調(diào)控光照對器官分化的影響器官分化的基因調(diào)控-器官發(fā)生方式器官發(fā)生過程起始材料激素對器官光照對器官分化133先芽后根

先根后芽

根芽同步發(fā)生

器官發(fā)生方式一般而言，先芽后根，如先根則抑制芽形成。-先芽后根先根后芽根芽同步發(fā)生器官發(fā)生方式一般而言，先芽134經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生器官發(fā)生過程-經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生器官發(fā)生過程-135經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程愈傷組織形成生長中心形成器官原基及器官形成-經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程愈傷組織形成生長中心形成器官原基136愈傷組織形成-愈傷組織形成-137生長中心形成，具有單向極性，與胚狀體不同-生長中心形成，具有單向極性，與胚狀體不同-138芽形成-芽形成-139芽外生芽內(nèi)生-芽外生芽內(nèi)生-140不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生在有些情況下，外植體不經(jīng)過典型的愈傷組織即可形成器官原基，這一途徑有兩種情況：一是外植體中已存在器官原基，進(jìn)一步培養(yǎng)即形成相應(yīng)組織器官進(jìn)而再生植株，如莖尖、根尖分生組織培養(yǎng)。另一種情況是外植體某些部位的細(xì)胞在重新分裂后，直接形成分生細(xì)胞團(tuán)，然后由分生細(xì)胞團(tuán)形成器官原基。這種不經(jīng)過愈傷組織直接發(fā)生器官的途徑在以品種繁殖為目的的離體培養(yǎng)中具有重要的實(shí)踐意義。-不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生在有些情況下，外植體不經(jīng)過典型的愈傷141a.細(xì)胞第一次平周分裂b.生長中心形成c.原初分生組織d.芽原基形成-a.細(xì)胞第一次平周分裂b.生長中心形成c.原初分生組織d.142外植體的類型母體植物的遺傳基礎(chǔ)起始材料對器官分化的影響-外植體的類型母體植物的遺傳基礎(chǔ)起始材料對器官分化的影響-143總體上說，被子植物比裸子植物容易培養(yǎng)，在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培養(yǎng)成功的報(bào)道最多。通常情況下，自然繁殖以無性繁殖為主的植物在培養(yǎng)條件下也有較強(qiáng)的器官分化的能力同種植物不同品種（基因型）的培養(yǎng)效果具有較大差異已是不爭的事實(shí)?；蛐蛯τ谂囵B(yǎng)反應(yīng)的差異，器官分化能力的差異大于愈傷組織誘導(dǎo)的差異。-總體上說，被子植物比裸子植物容易培養(yǎng)，在被子植物中又以茄科、144外植體對誘導(dǎo)反應(yīng)及其再生能力的影響體還現(xiàn)在生理狀態(tài)上來源于生長活躍或生長潛力大的組織、器官的細(xì)胞更有利于培養(yǎng)對于多年生植物而言，以幼嫩組織為材料無論是誘導(dǎo)還是分化均較容易。一、二年生無性繁殖植物的取材則可塑性較大，但仍以自然繁殖器官為外植體更易成功。-外植體對誘導(dǎo)反應(yīng)及其再生能力的影響體還現(xiàn)在生理狀態(tài)上-145外植體選取合理與否，不僅影響培養(yǎng)的難易，而且有時甚至影響分化的程度和器官類型。花芽營養(yǎng)芽，花芽營養(yǎng)芽TranThanhVan等，1974-外植體選取合理與否，不僅影響培養(yǎng)的難易，而且有時甚至影響分化146激素對器官發(fā)生的影響離體培養(yǎng)下的器官分化在大多數(shù)情況下是通過外源提供適宜的植物激素而實(shí)現(xiàn)的。在眾多的植物激素中，生長素與細(xì)胞分裂素是2類主要的植物激素，在離體器官分化調(diào)控中占有主導(dǎo)地位。GA3,PSK在器官分化中也具有一定調(diào)控作用。-激素對器官發(fā)生的影響離體培養(yǎng)下的器官分化在大多數(shù)情況下是通過147生長素/細(xì)胞分裂素高有利于根分化生長素/細(xì)胞分裂素低有利于芽分化生長素與細(xì)胞分裂素必須協(xié)調(diào)使用才能再生正常個體（引自Pierik,1987）-生長素/細(xì)胞分裂素高有利于根分化（引自Pierik,148離體培養(yǎng)中，外源激素在細(xì)胞內(nèi)的吸收和代謝影響到激素的活性從而影響其培養(yǎng)效果。外源細(xì)胞分裂素被外植體吸收后，在細(xì)胞內(nèi)被修飾和轉(zhuǎn)化形成活化形式和鈍化形式。一般認(rèn)為，細(xì)胞分裂素自由堿基形式是活性形式，而核苷形式為鈍化形式。通過細(xì)胞分裂素氧化酶對側(cè)鏈的修飾可能是植物組織細(xì)胞中降低細(xì)胞分裂素活性的主要機(jī)制，在煙草細(xì)胞培養(yǎng)中使用二氫玉米素比使用玉米素更為有效，可能與二氫玉米素核糖苷不是細(xì)胞分裂素氧化酶的底物有關(guān)。-離體培養(yǎng)中，外源激素在細(xì)胞內(nèi)的吸收和代謝影響到激素的活性從而149生長素進(jìn)入細(xì)胞后，一部分以游離狀態(tài)存在，另一部分則與氨基酸結(jié)合形成生長素－氨基酸復(fù)合體。

與生長素結(jié)合的氨基酸主要為天門冬氨酸，也有谷氨酸。

2,4-D、NAA、IAA是常用的3種生長素。

Ribnicky等（1996）的研究顯示，由于生長素種類不同，形成生長素－氨基酸復(fù)合體的量具有顯著差異，從而亦表現(xiàn)出作為外源生長素在培養(yǎng)效果上的差異。-生長素進(jìn)入細(xì)胞后，一部分以游離狀態(tài)存在，另一部分則與氨基酸結(jié)150外源生長素在胡蘿卜上胚軸培養(yǎng)細(xì)胞中的總量和游離生長素含量*培養(yǎng)時間外源生長素濃度生長素游離形式（ng/gFW）總濃度（ng/gFW）1周2,4-DNAA[2H4]IAA23,247.4±3,912.799.3±9.730.3±3.521,979.4±2,526.31,776.7±50.17,557.0±279.04周2,4-DNAA[2H4]IAA20,003.8±4,365.964.8±17.53.4±1.433,119.4±3,835.01,637.0±509.8763.5±420.0*引自Ribnicky等1996。-外源生長素在胡蘿卜上胚軸培養(yǎng)細(xì)胞中的總量和游離生長素含量*151光照是離體培養(yǎng)中比較復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子，光照時間、強(qiáng)度以及光質(zhì)對器官分化均有影響。光照對器官分化的影響-光照是離體培養(yǎng)中比較復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子，光照時間、強(qiáng)度以及光質(zhì)對152連續(xù)的光照有利于培養(yǎng)細(xì)胞維管組織的形成，而一定的晝夜光照周期則有利于極性建立和形態(tài)發(fā)生。培養(yǎng)條件下，光照的作用更大程度上是調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化狀態(tài)，而不是合成光合產(chǎn)物。光照對器官發(fā)生的調(diào)節(jié)可能與調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的內(nèi)源激素平衡有關(guān)，光照還可能影響生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)整生長素的極性運(yùn)輸，從而引起器官分化。光質(zhì)對器官分化的影響可能與光受體精確調(diào)節(jié)系統(tǒng)有關(guān)。-連續(xù)的光照有利于培養(yǎng)細(xì)胞維管組織的形成，而一定的晝夜光照周期153基因調(diào)控

homebox細(xì)胞周期基因

其它-基因調(diào)控homebox細(xì)胞周期基因其它-154Kn1（KNOTTED1）是從玉米中鑒定出的第一個植物homebox基因，Kn1-likehomebox（knox）基因又可分為2組（classI和classII），classIIknox在各種分化組織器官中均表達(dá)，而classIknox只在分生組織中表達(dá)。在玉米和大麥離體培養(yǎng)中，大量不定芽生成的部位也檢測到KN1基因的大量表達(dá)。在一些轉(zhuǎn)Kn1相似基因地研究中表明，轉(zhuǎn)基因植株能大量產(chǎn)生復(fù)合芽以及不定分生組織。STM（SHOOTMERISTEMLESS）基因以及它們的直系同源（orthologues）基因均參與了莖尖分生組織的分化調(diào)控。在轉(zhuǎn)Homeobox相關(guān)基因的煙草植物中還檢測分析到赤霉素含量減少和生長素含量上升的內(nèi)源激素變化，這也暗示，Homeobox基因可能通過一些調(diào)節(jié)因子（如激素）介導(dǎo)調(diào)控器官分化。-Kn1（KNOTTED1）是從玉米中鑒定出的第一個植物hom155植物編碼細(xì)胞周期依賴性激酶基因cdc2在離體培養(yǎng)中，調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入分裂狀態(tài)的過程起著關(guān)鍵性作用，在玉米和大麥離體培養(yǎng)中，cdc2的表達(dá)高峰發(fā)生在不定芽形成的過程中，在培養(yǎng)初期的表達(dá)量較少，同時，該基因的表達(dá)部位處于分生組織的外層細(xì)胞，因此認(rèn)為，cdc2基因?qū)Ψ稚M織的形成和維持分生組織狀態(tài)均有重要作用。-植物編碼細(xì)胞周期依賴性激酶基因cdc2在離體培養(yǎng)中，調(diào)節(jié)細(xì)胞156Banno等（2001）從擬南芥根培養(yǎng)再生芽的體系中克隆了一個增強(qiáng)芽再生能力的基因ESR1，將該基因與35S啟動子連接轉(zhuǎn)化擬南芥，在有細(xì)胞分裂素存在的情況下轉(zhuǎn)基因外植體可以顯著提高不定芽的分化率。而生長素不能誘導(dǎo)該基因表達(dá)，同樣也不能提高不定芽分化頻率。-Banno等（2001）從擬南芥根培養(yǎng)再生芽的體系中克隆了一157從煙草溫度突變體中鑒定出3個與離體器官發(fā)生有關(guān)的基因SRD1、SRD2和SRD3，當(dāng)它們發(fā)生隱形突變時，在離體培養(yǎng)中表現(xiàn)出器官發(fā)生在不同時期受阻，3個基因均定位于擬南芥I號染色體上。（引自Cary等，2001）-從煙草溫度突變體中鑒定出3個與離體器官發(fā)生有關(guān)的基因SRD1158--159*第三節(jié)體細(xì)胞胚胎發(fā)生

離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚的類似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞），統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。

-*第三節(jié)體細(xì)胞胚胎發(fā)生

離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過160這一定義有以下幾方面的界定：其一，體細(xì)胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于離體培養(yǎng)范圍使用，以區(qū)別于無融合生殖胚；其二，體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，以區(qū)別于合子胚；其三，體細(xì)胞經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程，以區(qū)別與離體培中器官發(fā)生形成個體的途徑。其四，胚狀體最根本的特征是具有兩極性，即在發(fā)育早期階段能從相反的兩個方向分化出莖端和根端，可一次再生完整的植株。而不定根和不定芽都是單極性的，必須先誘導(dǎo)芽再生根。-這一定義有以下幾方面的界定：-161體細(xì)胞胚的形成體細(xì)胞胚的發(fā)育與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素體細(xì)胞胚發(fā)生的生化與分子基礎(chǔ)-體細(xì)胞胚的形成體細(xì)胞胚的發(fā)育與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素162直接途徑一.體細(xì)胞胚的形成間接途徑-直接途徑一.體細(xì)胞胚的形成間接-163體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生1.誘導(dǎo)階段2.胚胎發(fā)育階段（引自Chen等,1999）

-體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生1.誘導(dǎo)階段2.胚胎發(fā)育階段（164經(jīng)過愈傷組織的體細(xì)胞胚形成經(jīng)過懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚形成間接發(fā)生-經(jīng)過愈傷組織的體細(xì)胞胚形成經(jīng)過懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚形成間接發(fā)生165誘導(dǎo)愈傷組織形成愈傷組織胚性化球性胚形成子葉胚期（引自Lin等，2000）

-誘導(dǎo)愈傷組織形成愈傷組織胚性化球性胚形成子葉胚期（引自Lin166愈傷組織胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)的胚性細(xì)胞團(tuán)球性胚形成成熟子葉胚（引自Choi等，1997）

-愈傷組織胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)的胚性細(xì)胞團(tuán)球性胚形成成熟子葉胚167體細(xì)胞胚發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)體細(xì)胞胚的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)二.體細(xì)胞胚的發(fā)育與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)-體細(xì)胞胚發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)體細(xì)胞胚的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)二.體細(xì)胞胚的發(fā)168類似于植物合子胚的發(fā)育早期原胚發(fā)生胚胎細(xì)胞發(fā)生球形胚形成完整胚結(jié)構(gòu)形成（引自Figueroa等，2002）

-類似于植物合子胚的發(fā)育早期原胚發(fā)生胚胎細(xì)胞發(fā)生球形胚形成完整169類似于動物胚胎早期的發(fā)育胚胎細(xì)胞發(fā)生發(fā)育早期2次均等分裂胚結(jié)構(gòu)的形成（引自Fifueroa等，2002）

-類似于動物胚胎早期的發(fā)育胚胎細(xì)胞發(fā)生發(fā)育早期2次均等分裂胚結(jié)170結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與器官發(fā)生形成個體的途徑相比，體細(xì)胞胚發(fā)育再生植株有兩個明顯的特點(diǎn)：一是體細(xì)胞胚具有雙極性（doulblepolarity）；二是體細(xì)胞胚形成后與母體的維管束系統(tǒng)連系較少，即出現(xiàn)所謂的生理隔離（physiologicalisolation）現(xiàn)象。-結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與器官發(fā)生形成個體的途徑相比，體細(xì)胞胚發(fā)育再生171*合子胚：發(fā)育初期具有明顯的胚柄，

體細(xì)胞胚:沒有真正的胚柄,只有類似胚柄的結(jié)構(gòu)。

合子胚:子葉是相當(dāng)規(guī)范

體細(xì)胞胚:子葉常不規(guī)范。體積明顯小于合子胚，

合子胚在胚胎發(fā)育完全進(jìn)入子葉期胚以后，經(jīng)過一系列的物質(zhì)積累和脫水就進(jìn)入休眠，

體細(xì)胞胚沒有明顯的脫水干燥過程,在心形期以后的各個階段均可直接形成植株。-*合子胚：發(fā)育初期具有明顯的胚柄，

體細(xì)胞胚:172三.影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素激素的調(diào)控作用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的影響基因型的影響-三.影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素