EST技術(shù)及其在基因全長(zhǎng)cDNA克隆上的應(yīng)用策略

二軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室；上海200433何志穎；姚玉成（綜述）；胡以平（審校）關(guān)鍵詞：est技術(shù)；“電子”基因克??；生物信息學(xué)；基因摘要：隨著人類基因組計(jì)劃的順利進(jìn)行，est技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因識(shí)別、繪制基因表達(dá)圖譜、尋找新基因等研究領(lǐng)域。利用人類基因組研究不斷產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，從ESTs即cDNA的部分序列入手，通過(guò)同源篩選，獲得基因部分乃至全長(zhǎng)cDNA序列，避免或減輕了構(gòu)建與篩選cDNA文庫(kù)等繁鎖實(shí)驗(yàn)室工作。本文從原理、應(yīng)用及其在科學(xué)研究上產(chǎn)生的影響等方面對(duì)est技術(shù)進(jìn)行了概述。表達(dá)序列標(biāo)簽（expressedsequencetags,ESTs）是指從不同組織來(lái)源的cDNA序列。這一概念首次由Adams等于1991年提出。近年來(lái)由此形成的技術(shù)路線被廣泛應(yīng)用于基因識(shí)別、繪制基因表達(dá)圖譜、尋找新基因等研究領(lǐng)域，并且取得了顯著成效。在通過(guò)mRNA差異顯示、代表性差異分析等方法獲得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全長(zhǎng)cDNA序列，以便對(duì)該基因的功能進(jìn)行研究。克隆全長(zhǎng)cDNA序列的傳統(tǒng)途徑是采用噬斑原位雜交的方法篩選cDNA文庫(kù)，或采用PCR的方法，這些方法由于工作量大、耗時(shí)、耗材等缺點(diǎn)已滿足不了人類基因組時(shí)代迅猛發(fā)展的要求。而隨著人類基因組計(jì)劃的開展，在基因結(jié)構(gòu)、定位、表達(dá)和功能研究等方面都積累了大量的數(shù)據(jù)，如何充分利用這些已有的數(shù)據(jù)資源，加速人類基因克隆研究，同時(shí)避免重復(fù)工作，節(jié)省開支，已成為一個(gè)急迫而富有挑戰(zhàn)性的課題擺在我們面前，采用生物信息學(xué)方法延伸表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）序列，獲得基因部分乃至全長(zhǎng)cDNAycg，將為基因克隆和表達(dá)分析提供空前的動(dòng)力，并為生物信息學(xué)功能的充分發(fā)揮提供廣闊的空間。文本將就EST技術(shù)的應(yīng)用并就其在基因全長(zhǎng)cDNA克隆上的應(yīng)用作一較為詳細(xì)的介紹。1、ESTs與基因識(shí)別EST技術(shù)最常見(jiàn)的用途是基因識(shí)別，傳統(tǒng)的全基因組測(cè)序并不是發(fā)現(xiàn)基因最有效率的方法,這一方法顯得即昂貴又費(fèi)時(shí)。因?yàn)榛蚪M中只有2%的序列編碼蛋白質(zhì)，因此一部分科學(xué)家支持首先對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，即從真正編碼蛋白質(zhì)的mRNA出發(fā)，構(gòu)建各種cDNA文庫(kù)，并對(duì)庫(kù)中的克隆進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序。Adams等提出的表達(dá)序列標(biāo)簽的概念標(biāo)志著大規(guī)模cDNA測(cè)序時(shí)代的到來(lái)。雖然ESTs序列數(shù)據(jù)對(duì)不精確，精確度最高為97%，但實(shí)踐證明EST技術(shù)可大大加速新基因的發(fā)現(xiàn)與研究。Medzhitov等通過(guò)果蠅黑胃TOLL蛋白進(jìn)行dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，該蛋白已證實(shí)在成熟果蠅抗真菌反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，通過(guò)同源分析的方法，找到相應(yīng)的人類同源EST（登錄號(hào)為H48602），這為接下來(lái)研究人類TOLL同源蛋白的功能提供了很好的條件。hMSH5基因是從釀酒酵母菌MSH5存在30%的一致性，它與hMSH4特異性相互作用，在減數(shù)分裂和精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。由此可見(jiàn)，應(yīng)用EST技術(shù)，可以跳過(guò)生物分類學(xué)的界限，從生物模型的已識(shí)別基因迅速克隆出人和小鼠基因組相應(yīng)的更復(fù)雜的未知基因。生物間在核苷酸水平上的進(jìn)貨差異阻礙了傳統(tǒng)意義上的雜交或以PCR為基礎(chǔ)的基因克隆策略，即使是親緣關(guān)系很接近的生物也不例外，如C.elegans和C.briggsae，它們僅在2?5千萬(wàn)年前分化形成。而通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行dbEST進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，其配制是電子雜交實(shí)驗(yàn)，提供了一條更為廣泛的基因識(shí)別路線，這一路線允許基因組間存在差異，這使得基因識(shí)別與新基因克隆策略發(fā)生革命性變化，同時(shí)它也提供了一個(gè)足夠大小和復(fù)雜的基因數(shù)據(jù)庫(kù)，目前，ESTs數(shù)量正以平均每月10萬(wàn)條的速度遞增。2、ESTs和物理圖譜構(gòu)建ESTs在多種以基因?yàn)榛A(chǔ)的人和植物基因組物理圖譜構(gòu)建中扮演著重要角色。在這一應(yīng)用中，從ESTs發(fā)展起來(lái)的PCR或雜交分析可用來(lái)識(shí)別YACs、BACs或其他含有大片段插入克隆類型的載體，它們是構(gòu)建基因組物理圖譜的基礎(chǔ)，將EST與基因組物理圖譜相比較即可辨認(rèn)出含有剩余基因序列的基因組區(qū)間，包括調(diào)控基因表達(dá)的DNA控制元件，對(duì)這些元件進(jìn)行分析就有可能獲得對(duì)基因功能的詳細(xì)了解。物理圖譜與遺傳圖譜間的相互參考，形成一個(gè)用途更廣泛的綜合資源，獲得這張綜合圖譜后，研究人員就可以孟德?tīng)栠z傳特征為基礎(chǔ)，將相關(guān)基因定位在基因組區(qū)間上，并且通過(guò)查詢以ESTs為基礎(chǔ)的藶圖譜，即可獲得這一區(qū)間上所有基因的名單。該綜合資源用途的大小取決于EST數(shù)據(jù)庫(kù)中擁有的基因數(shù)目。目前人和小鼠EST的不斷擴(kuò)充使其應(yīng)用更加廣泛和便捷。3、 ESTs和基因組序列注釋EST數(shù)據(jù)庫(kù)并非完美無(wú)瑕，因?yàn)镋STs不能被剪切為單列序列位點(diǎn)識(shí)讀，故精確度只能達(dá)到97%，另夕卜，ESTS受制于表達(dá)傾向(expressionbias)，因?yàn)楫a(chǎn)生ESTs的cDNA是組織中豐富的mRNA以一定比例反轉(zhuǎn)錄而成，因此，表達(dá)水平很低的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中找到，而表達(dá)量高的基因在EST數(shù)據(jù)庫(kù)中卻過(guò)量存在。雖然可在起始mRNA或由它合成雙鏈cDNA時(shí)進(jìn)行富集，減小cDNA文庫(kù)，但cDNA文庫(kù)中仍存在大量高豐度的cDNA克隆。因此，一個(gè)理想的cDNA文庫(kù)必須去除或盡量消除多科信息克隆的影響，這就涉及到cDNA文庫(kù)的前加工技術(shù)；均等化(normalization),減少與豐富編碼基因相關(guān)的cDNA數(shù)目；消減雜交(subtractivehybridization)，應(yīng)用序列標(biāo)記cDNA識(shí)別并去除文庫(kù)中多余的克降，這些技術(shù)的發(fā)展，使基因識(shí)別更依賴于EST技術(shù)，甚至可通過(guò)該技術(shù)獲得精確的基因組DNA序列，在華盛頓大學(xué)基因組測(cè)序中心和Sanger中心的聯(lián)合攻關(guān)下，C.elegans基因組10億個(gè)堿基對(duì)的測(cè)序工作基本完成。因此ESTs是一系列基因?qū)ふ夜ぞ咧胁豢扇鄙俸蟛糠?，而這些工具都是基因組序列為基礎(chǔ)的。EST技術(shù)關(guān)于基因組DNA序列的其他應(yīng)用還包括對(duì)基因內(nèi)含子、夕是子排列的精確預(yù)測(cè)，選擇性接合事件的識(shí)別，反?；蚪M排列結(jié)構(gòu)的識(shí)別等。4、 ESTs與“電子”基因克隆利用計(jì)算機(jī)來(lái)協(xié)助克隆基因，稱為'電子”基因克隆(sillconcloning)，是與定位克隆、定位候選克隆策略并列的方法之一，即采用生物信息學(xué)的方法延伸EST序列，以獲得基因部分乃至全長(zhǎng)的cDNA序列。EST數(shù)據(jù)庫(kù)的迅速擴(kuò)張，已經(jīng)并將繼續(xù)導(dǎo)致識(shí)別與克隆新基因策略發(fā)生革命性變化。4.1EST序列的獲取利用計(jì)算機(jī)來(lái)協(xié)助克隆的第一步是必須獲得感興趣的EST，在dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中找出EST的最有途徑是尋找同源序列，標(biāo)準(zhǔn)：長(zhǎng)脛lOObp，同源性50%以上、85%以下。可通過(guò)數(shù)個(gè)萬(wàn)維網(wǎng)界而使用BLAST檢索程度實(shí)現(xiàn)，其中最常用的如NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的eneBank、意大利Tigem的ESTmachine(包括EST提取者和EST組裝機(jī)器)、THC(TentativeHumanConsensusSequences)數(shù)據(jù)庫(kù)、ESTBlast檢索程序——通過(guò)英國(guó)人類基因組作圖項(xiàng)目資源中心(HumanGenomeMappingProjectResourceCenter，HGMP—RC)服務(wù)器上訪問(wèn)。然后將檢出序列組裝為重疊群Contig),以此重疊群為被檢序列，重復(fù)進(jìn)行BLAST檢索與序列組裝，延伸重疊樣系列，重復(fù)以上過(guò)程，直到?jīng)]有更多的重疊EST檢出或者說(shuō)重疊群序列不能繼續(xù)延伸，有時(shí)可獲得全長(zhǎng)的基因編碼序列。獲得這些EST序列數(shù)據(jù)后，再與GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性檢測(cè)，假如鳳有精確匹配基因，將EST序列數(shù)據(jù)據(jù)EST六種閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)，接著與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較分析?；蚍治龅慕Y(jié)果大致有三種：第一是已知基因，是研究對(duì)象為人類已鑒定和了解的基因；第二是以前未經(jīng)鑒定的新基因；第三是未知基因，這部分基因之間無(wú)同種或異種基因的匹配。新基因和未知基因?qū)⑦M(jìn)一步用于生物學(xué)研究。4.2基因的電子定位基因的電子定位采用NCBI的電子PCR程序進(jìn)行檢索，尋找EST序列上是否存在序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequencetaggedsites,STS),STS作為基因組中的單拷貝序列，是新一代的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，其數(shù)目多，覆蓋密度較大，達(dá)到平均每lkb—個(gè)STS或更密集。將尋找到的STS與相應(yīng)的染色體相比較，即可將此序列定位在該染色體上。4.3IMAGE克隆的索取許多ESTs所對(duì)應(yīng)的cDNA克隆可通過(guò)基因組及其表達(dá)的整合分子分析(intergratedmolecularanalysisofgenomesandtheirexpression，IMAGE)協(xié)定免疫索取，這與電子基因克隆相輔相成,IMAGE協(xié)定由美國(guó)LLNL國(guó)家實(shí)驗(yàn)室主持，宗旨是共享排列好的cDNA文庫(kù)中的克隆重，大規(guī)模的EST測(cè)序項(xiàng)目如Merk&Cow公司投資的人類ESTs項(xiàng)目等都加入了IMAGE協(xié)定。當(dāng)研究者通過(guò)另外的途徑得到基因的部分序列，并通過(guò)同源性檢索后發(fā)現(xiàn)該片段與加入IMAGE協(xié)定的EST序列高度同源時(shí)，便可免費(fèi)索取其原始克隆，可通過(guò)