原始不加密溫州醫(yī)學(xué)院臨床免疫學(xué)檢驗

一、外周血單個核細(xì)胞的分離概述外周血單個核細(xì)胞（PBMC）指淋巴細(xì)胞和

單核細(xì)胞，是免疫學(xué)實驗中最常用的細(xì)胞群。細(xì)胞分離的主要原理之一是根據(jù)各類血細(xì)胞的大小、密度、沉降率、黏附力等方面的差異，利用特定的技術(shù)加以區(qū)分。目前臨床和科研實驗中常用的細(xì)胞分離方法是密度梯度離心法。PBMC的密度與血液中的其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞密度較大，約為1.093，多形核粒細(xì)胞約為1.092，血小板約為

1.032，PMBC密度介于1.075~1.090之間。利用一種密度為1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺混合液（淋巴細(xì)胞分離液）進行密度梯度離心，離心后不同類別的血細(xì)胞因密度不同而呈梯度分布。實驗原理血漿單個核細(xì)胞分離液粒細(xì)胞紅細(xì)胞試劑：淋巴細(xì)胞分離液（密度1.0770.001）肝素溶液（500U/ml）Hanks液、含20％滅活小牛

的Hanks液4．2g/L臺盼藍(lán)染液器材：試管、滴管、吸管、無菌干燥注射器、無菌棉球、橡皮止血帶、水平式離心機、顯微鏡、血細(xì)胞計數(shù)板等。實驗材料抗凝全血緩沖液實驗步驟1．抽取靜脈血1.5ml，加入含肝素抗凝管中混勻，再加等量Hanks液，混勻稀釋。2．將稀釋的全血沿管壁緩緩地加到分層液上方，使稀釋血液

于淋巴細(xì)胞分離液上，且分離液與稀釋血液體積比例為1:2。分離液3．將離心管置于水平式離心機內(nèi)，以2000r/min

，離心20min。實驗步驟用吸管插到血漿與分離液的界面處，沿管壁周緣吸出單個核細(xì)胞。置入另一試管中，加入5倍體積的Hanks液混勻，1000rpm，離心5min，棄上

滌細(xì)胞）按上述方法將細(xì)胞重復(fù)洗滌2次（末次用含20％滅活小牛

的Hanks液洗），末次洗滌后，棄上清，留在管底的即為PBMC，用含20％滅活小牛

的Hanks液0.5ml重懸細(xì)胞充池、計數(shù)，將細(xì)胞調(diào)節(jié)成1～2×106/ml取50l細(xì)胞懸液和50l臺盼蘭染液混勻，取15l滴于玻片上，加蓋玻片，高倍鏡下計數(shù)100個細(xì)胞，計算細(xì)胞實驗步驟4個藍(lán)域為白細(xì)胞計數(shù)池實驗結(jié)果PBMC計數(shù)結(jié)果記錄和計算單個核細(xì)胞計數(shù)結(jié)果記錄和計算注：活細(xì)胞可排斥

不被

，折光性強；死細(xì)胞著藍(lán)色，體積略膨大；正常情況下，活細(xì)胞比例大于95%。分離不同種類動物外周血單個核細(xì)胞時，對分離液的密度要求不同。人的細(xì)胞密度為1.0770.001。大鼠為1.0880.001。小鼠為1.0920.001。兔為1.0960.001

等。將血液稀釋后分離可降低血液粘稠度和紅細(xì)胞

，提高單個核細(xì)胞的回收率。注意事項向分離液管加稀釋血液時，應(yīng)沿管壁緩緩加入，使血液與分離液形成明顯界面。注意輕拿輕放，避免沖散界面。為保持淋巴細(xì)胞活性，采血后應(yīng)在2h內(nèi)分離細(xì)胞，盡快完成操作全程。離心時，離心機轉(zhuǎn)速的增加或減少要注重均勻、平穩(wěn)，以免影響分離效果。淋巴細(xì)胞分離液需平衡到室溫后使用，否則會影響分離液的密度，使得率降低臨床應(yīng)用本方法操作簡便、穩(wěn)定，細(xì)胞回收率達80％～90％，單個核細(xì)胞純度可達95％，細(xì)胞

可達95％以上。該方法是目前最理想、最常用的分離淋巴細(xì)胞

段，其的細(xì)胞（主要是淋巴細(xì)胞，約占90%～95%

）懸液已能滿足許多細(xì)胞免疫實驗要求，也可用于進一步

T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞，故在免疫學(xué)實驗中有廣泛應(yīng)用，是細(xì)胞免疫檢測中最基本的方法之一。二、E花環(huán)形成試驗實驗原理人T細(xì)胞表面具有能與綿羊紅細(xì)胞（SRBC）表面糖肽結(jié)合的受體，稱為E受體（CD2）。已證實E受體是人類T細(xì)胞所特有的表面標(biāo)志。當(dāng)T細(xì)胞與SRBC混合后，SRBC便粘附于T細(xì)胞表面，呈現(xiàn)花環(huán)狀，根據(jù)花環(huán)形成的多少，可測知T細(xì)胞的數(shù)目。實驗材料試劑：0.5％SRBC懸液、0.8％戊二醛、瑞氏染液器材：

滴管、玻璃管、載玻片、蓋玻片、加樣槍、加樣頭、離心機、4℃冰箱、顯微鏡實驗步驟1.

取上述

的1～2×106/ml的PBMC懸液0.2ml和0.5％SRBC

0.2ml，混勻，37℃水浴5min。500rpm×5min，放4℃冰箱2h。輕輕吸去上清0.2ml，沿管壁輕輕加入0.8％戊二醛0.2ml，放4℃冰箱20min。4.

輕輕吹吸均勻沉淀細(xì)胞。濕片法：取1d細(xì)胞懸液滴加于玻片上，直接高倍鏡下觀察。干片法：取細(xì)胞懸液涂片，自然干燥，瑞氏染色〔I液（藍(lán)色）10s，II液（無色）2min〕，流水輕輕沖洗，干燥后，油鏡下觀察。實驗結(jié)果淋巴細(xì)胞呈藍(lán)紫色，SRBC淡藍(lán)色，凡結(jié)合3個或3個以上SRBC的細(xì)胞則為E花環(huán)形成細(xì)胞，計數(shù)100個淋巴細(xì)胞，求出E花環(huán)形成率。正常值：Et花環(huán)形成率為60％～80％注意事項SRBC與淋巴細(xì)胞混合后離心速度不能過高，置4℃應(yīng)至少1h以上或過夜。SRBC以保存1周以內(nèi)最好，超過2

與淋巴細(xì)胞結(jié)合力下降，超過5～6

不能再用。SRBC與淋巴細(xì)胞混合比例以100:1～200:1為宜；淋巴細(xì)胞離體后

過6h，否則會影響花環(huán)形成率。溫度對實驗結(jié)果影響較大，故實驗溫度條件應(yīng)該保持一致，從4℃取出后應(yīng)立即計數(shù)。計數(shù)前將沉淀重懸時，使細(xì)胞團塊松散即可，不可強力吹打，以免SRBC從淋巴細(xì)胞上脫落。臨床應(yīng)用該試驗可用于性細(xì)胞免疫缺陷病的檢測；腫瘤