體積排阻色譜和光散射技術(shù)市公開課金獎市賽課一等獎?wù)n件

SizeExclusionChromatographywithLightScatteringDetection(SEC-MALS)LightScatteringUniversityWyattTechnologyCorporationCHINA第1頁主要內(nèi)容SEC技術(shù)與SEC-MALS技術(shù)儀器參數(shù)確定小結(jié)第2頁多角度光散射法：兩種測定模式單機模式(Batchmode)Mw(weight-averagedmolarmass)，Rz(z-averagedRMSradius)，A2無法測定：樣品多分散性系數(shù)（

PDI

）；聯(lián)機模式(Onlinemode,flowmode)MolarMass，RMS，Distributions，PDI；第3頁SEC=SizeExclusionChromatography（體積排阻色譜）SizeExclusionChromatography(SEC)：

基于高分子分子尺寸大小不一樣而分離色譜法。（分子尺寸大小：hydrodynamicvolume.）MALS=Multi-AngleLightScattering（多角度光散射）SEC-MALS:多角度光散射與體積排阻法聯(lián)用技術(shù)什么是

SEC-MALS?第4頁體積排阻色譜第5頁傳統(tǒng)SEC

假設(shè)弊端Sizeexclusionchromatographyofnativeandreduced,carboxymethylatedRnaseAdaptedfrom“Size-exclusionchromatographywithon-linelight-scattering,absorbance,andrefractiveindexdetectorsforstudyingproteinsandtheirinteractions”byJ.Wen,etal.,Anal.Biochem.240155–166(1996).傳統(tǒng)SEC

假設(shè)待測樣與標樣性質(zhì)相同：構(gòu)象相同；密度相同；與柱填料無任何相互作用。第6頁高分子表征需要BSALSRIMwDextranLSRIMw多分散性樣品:Mn,Mw,Mz,PDI(Mw/Mn)單分散性樣品:檢測，識別聚集體以及各組分數(shù)量。第7頁經(jīng)典光散射與色譜聯(lián)用配置第8頁對于水相體系，提議使用0.1μm對流動相過濾；而對于有機相體系，提議使用0.2μm對流動相過濾；使用在線脫氣裝置（In-linedegasser）；添加在線過濾器（

In-linemembranefilter）：

水相體系：PEEK材質(zhì)在線過濾器；有機相體系：不銹鋼材質(zhì)在線過濾器；

逐步增加或降低流速，切不可大幅度調(diào)整流速；SEC-MALS測定法幾點提議*以上提議有利于延長泵、柱子壽命（即使不使用光散射儀）。第9頁摩爾質(zhì)量-定義Numberaveragemolarmass:Weightaveragemolarmass:Z-averagemolarmass:色譜洗脫曲線中，每一洗脫體積其摩爾質(zhì)量由光散射儀測定。色譜洗脫曲線中，每一洗脫體積其濃度由濃度型檢測器測定。第10頁范例:2個分子(“1-mer”和

“9-mer”)相對分子質(zhì)量分別是1和9ass范例：摩爾質(zhì)量計算第11頁LSRI多分散性樣品摩爾質(zhì)量Mn<Mv<Mw<MzMw

直接有LS測定良好SEC分離效果是準確測定摩爾質(zhì)量主要前提。MzMwMpMn第12頁均方根半徑（旋轉(zhuǎn)半徑）MeanSquareRadius:

z-averagemeansquareradius

直接由MALS測定

。Astra直接計算出數(shù)均、重均以及z-均方根半徑。

RootMeanSquare(rms)Radiusrg:單分子鏈中質(zhì)量為mj鏈段多分散性高分子：Z-averageMeanSquareRadiusmjrj第13頁模板參數(shù)創(chuàng)建（TemplateGeneration）:歸一化系數(shù)（Normalizationcoefficients）

激光光電二極管檢測能力差異修正延遲體積（Alignment）：

檢測器間管路體積。寬峰校正（Bandbroadening）：

樣品稀釋效應(yīng)修正。儀器系統(tǒng)有效性確認（SystemValidation）模板參數(shù)創(chuàng)建與系統(tǒng)有效性確認第14頁建立儀器參數(shù):“第一針”--BSAASTRA經(jīng)過儀器配置自動識別、標識不一樣儀器、并存放數(shù)據(jù)。也能夠支持第三方檢測器如UV、RI等。LS90°UV第15頁數(shù)據(jù)分析-Baselines設(shè)定LS與濃度信號基線設(shè)定基線時，其應(yīng)覆蓋可能基線漂移區(qū)。

第16頁數(shù)據(jù)分析

–Peaks單分散性高分子：選峰范圍對結(jié)果影響很小。多分散性高分子：選峰范圍對結(jié)果影響較大。LSUV,

RI第17頁使用各向同性高分子對（不包含90度角）不一樣角度光電二極管相對于90度進行歸一化。修正光電二極管靈敏度及幾何形狀差異。歸一化要求:各向同性散射體必須用流動相配制。同一檢測池中使用。數(shù)據(jù)分析–Normalization慣用歸一化標樣

水相:10,000-40,000g/moldextran,pullulan,BSA(0.02μm過濾頭)

有機相:10,000-40,000g/molpolystyrene或

PMMA第18頁光散射信號疊加圖（Overlayplots）歸一化后，光散射信號疊加圖能夠評價歸一化效果：歸一化效果；是否存在雜散光（Straylight）；流通池污染，池窗污染等。Baseline設(shè)定是否合理。第19頁修正LS與濃度型檢測器之間管路體積

。

只有單分散性樣品才能使用Alignment數(shù)據(jù)分析:AlignmentUVLSRI第20頁為何使用單分散性樣品修正?Alignment&BandBroadening修正單分散性樣品LS

&RI信號重合第21頁Alignment&BandBroadening修正

為何不能使用多分散性樣品?多分散性樣品LS&RI不可能重合

(不能使用alignment修正)LSRI第22頁檢測器間寬峰效應(yīng)：BandBroadening樣品隨流動相依次經(jīng)過DAWN、

RI時，造成峰變寬寬峰效應(yīng)致使

LS

&RI

分離Mwdata第23頁檢測器間寬峰效應(yīng)：BandBroadeningASTRA能修正檢測器間寬峰效應(yīng)第24頁參數(shù)詳細信息與SEC、溶劑相關(guān)?與樣品種類相關(guān)?Calibration90°LSdetector（甲苯體系）NoNoNormalization同一檢測池,同一溶劑同一各性同向散射體MaybeNoDelayVolume&BandBroadeningCorrection相同檢測池，

不一樣檢測器間管路,

單分散性樣品NoNo儀器參數(shù)第25頁ZimmPlot：在單機試驗中，進樣系列濃度不能太低。DebyePlot

：在聯(lián)機模式下，僅需要1個濃度（低濃度）。二者擬合數(shù)據(jù)數(shù)學公式：

ZimmFormalism:

其它擬合公式:Debye,Berry,RandomCoilZimmPlot與DebyePlot第26頁

Zimm公式DebyePlot擬合度為1時：高分子

rmsradius<50nm縱坐標截距：1/Mw

；斜率與rmsradius

平方成正比。以

對

作圖1/MwRrms2第27頁Zimm公式Zimm–適合小到中等尺寸高分子

(RMSradii<50nm).6.528e+4g/mol1storderfitASTRA軟件中顯示某一保留時間下摩爾質(zhì)量與均方根半徑第28頁數(shù)據(jù)分析-DistributionPlotsMolarMassLSRIEASIGraph可查看更多類型圖第29頁數(shù)據(jù)分析-EASITableEASIGraph可比較不一樣試驗結(jié)果第30頁EASIGraph：摩爾質(zhì)量分布曲線擬合數(shù)據(jù)能夠處理信噪比較低區(qū)域散射數(shù)據(jù)

PolysaccharideLSRIMwBSALSRIMw第31頁均方根半徑分布曲線LSRI擬合數(shù)據(jù)能夠處理信噪比較低時散射數(shù)據(jù)

RMSradiusfit1storderexponentialRMSradius第32頁摩爾質(zhì)量與均方分半徑分布：

累計摩爾質(zhì)量與均方根半徑MolarMassHA4HA2HA3RMSRadiusHA4HA2HA3第33頁摩爾質(zhì)量與均方分半徑分布：

微分摩爾質(zhì)量與均方根半徑MolarMassHA4HA2HA3RMSRadiusHA4HA2HA3第34頁BSA：累積與微分摩爾質(zhì)量分布曲線累積分布（cumulativedistribution）可判斷樣品聚集體情況，如寡聚體等樣品展現(xiàn)臺階式分布；每一組分含量可由臺階高度決定。微分分布（differentialdistribution）可判斷某一分子量范圍組分質(zhì)量百分含量。第35頁判斷多分散性樣品對于rmsradius>10nm樣品*，Mw

和rmsradius同時能夠測定；

*而半徑<10nm時，Mw

與特征粘度或QELS數(shù)據(jù)能夠揭示分子構(gòu)象信息。分子構(gòu)象圖（Conformation）無歸線團

(斜率0.5–0.6)

棒狀（Rod）: 長度與rmsradius

、M成正比；無歸線團（Randomcoil）:

末端距與

rmsradius、M1/2成正比；球形（Sphere）: 球體半徑與

rmsradius

、M1/3成正比；棒狀(斜率

=1)球形

(斜率=1/3)logrglogM第36頁構(gòu)象圖了解高分子支化信息以log(rmsradius)

對log(Mw)作圖HA2Slope:0.48HA3Slope:0.49HA4Slope:0.18Highlybranchedmolecule第37頁單機模式vs.聯(lián)機模式SEC-MALS：Mn，Mw，Mz，PD，分子構(gòu)象SEC-MALS試驗:散射光強度，濃度，

dn/dc(Debyeplot,A2)建立SEC-MALS系統(tǒng)參數(shù):normalization，alignment/bandbroadening摩爾質(zhì)量與均方半徑分布曲線：EasiGraphs構(gòu)象圖：logRgvs.logMw小結(jié)第38頁附錄Zimm,Debye,Berry,orRandomCoil公式適用范圍公式y(tǒng)軸應(yīng)用說明Zimm10to100nmmostlinearBerry100to200nminsteadofZimmplotDebyeWidesizerange,GenerallyhigherfitorderRandomCoilAssumesrandomcoilconformation第39頁ZimmFormal