壹期煤工塵肺患者血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平變化

獨創(chuàng)性說明本人鄭重聲明:所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究エ作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，也不包含為獲得河北聯(lián)合大學(xué)以外其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書所使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中做了明確的說明并表示了謝意。論文作者簽名: 日期: 年月日關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解河北聯(lián)合大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即:已獲學(xué)位的研究生必須按學(xué)校規(guī)定提交學(xué)位論文，學(xué)校有權(quán)保留、送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱;學(xué)?？梢詫W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容采用影印、縮印或編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行公開、檢索和交流。作者及導(dǎo)師同意論文公幵及網(wǎng)上交流的時間:□自授予學(xué)位之日起;口自年月日起。作者簽名:簽字日期:導(dǎo)師簽名:簽字日期: 年月日摘要目的煤エ塵肺(Coalworker'spneumoconiosis,CWP)是煤礦作業(yè)人員在煤炭生產(chǎn)中長期吸入粉塵而致的以肺結(jié)構(gòu)慢性炎癥、纖維化為主要病理表現(xiàn)的ー類疾病-也是我國職業(yè)病中發(fā)病率最高，對工人健康危害極為嚴(yán)重的ー類疾病。最近?許多研究發(fā)現(xiàn)肺部炎癥和纖維化發(fā)病機(jī)制除與機(jī)體免疫功能有關(guān)外，氧化/抗氧化失衡起到重要作用。以前的許多研究中，常用超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)'過氧化氫酶(Catalase,CAT)'谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathioneperoxidase,GSH-Px)及丙二醛(Maleicdialdehyde,MDA)等來評價患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的程度，但易受檢測方法本身及干擾因素的影響。近年來?研究者們又發(fā)現(xiàn)幾個新的評價指標(biāo)如血紅素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1,HO-1)'核因子E2相關(guān)因子2(Nuclearfector-E2-relatedfactor2,Nrf2)和8ー異前列腺素F2a(8-iso-prostaglandinF2a,8-iso-PGF2a)。HO-1和Nrf2與抗氧化作用密切相關(guān)而8-iso-PGF2a則是脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物。當(dāng)粉塵進(jìn)入人體后?粉塵刺激機(jī)體產(chǎn)生許多抗氧化物質(zhì)?如HO-1(其水平的變化受Nrf2調(diào)控)等以對抗有害物質(zhì)引起的破壞作用(總抗氧化能力(Totalantioxidecapacity,T-AOC)可以反應(yīng)各種抗氧化物質(zhì)總的抗氧化水平)。當(dāng)抗氧化作用不充分或受到破壞時?引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng),產(chǎn)生有細(xì)胞毒性的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(Lipidperoxide,LPO)和終產(chǎn)物8-iso-PGF2a等?導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞。目前，HO-1'Nrf2和8-iso-PGF2a水平的變化在煤工塵肺中研究很少，因此，我們檢測CWP患者血清HO-1'Nrf2'8-iso-PGF2a含量，并結(jié)合檢測T-AOC、LPO含量的變化，進(jìn)ー步探討抗氧化及脂質(zhì)過氧化指標(biāo)在CWP發(fā)生發(fā)展中的變化及作用?為CWP的機(jī)制研究、臨床診斷和抗氧化治療提供依據(jù)。方法1本次研究對象來自2012-2013年開灤醫(yī)療集團(tuán)錢營職業(yè)病醫(yī)院部分住院的壹期CWP患者。選取經(jīng)開灤職業(yè)病防治院按照2009年國家塵肺診斷標(biāo)準(zhǔn)(GBZ-2009)確診患者91例，具備與病例組相同接塵條件的40例健康井下接塵礦エ(接塵組)和33例開灤非接塵井上健康查體工人(正常對照組)。各組性別、年齡及接塵年限匹配。全部查體人員均采集清晨空腹靜脈血，常規(guī)消毒后，抽取肘正中靜脈血4ml無抗凝劑采血管保存，住院患者于治療前采集。使用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測HO-1'Nrf2和8-iso-PGF2a的含量，比色法檢測T-AOC和LPO的含量。2運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示,兩均數(shù)比較采用t檢驗;偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）、四分位數(shù)間距（Q）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，多組間的兩兩比較采用Nemenyi檢驗-Mann-WhitneyU檢驗用于兩組間的比較，采用Spearman方法進(jìn)行相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1壹期CWP組、接塵組及正常對照組血清中HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化:三組間的Kruskal-WallisH檢驗結(jié)果顯示，Nrf2、T-AOC和LPO各組間有統(tǒng)計學(xué)差異（ノ=8.809、34.075、55.462-P=0.012、0.000'0.000），而HO-1和8-iso-PGF2a無明顯差異（ノ=2.657'2.705-P=0.265'0,259）。Nemenyi檢驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比,壹期CWP組LPO含量明顯升高（P<0.01）-Nrf2和T-AOC有升高趨勢?HO-1和8-iso-PGF2a有降低趨勢?但均無明顯差異（尸>0.05）;與接塵組比較,CWP組血清T-AOC含量明顯降低?差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），HO-1'Nr￡2ヽ8-iso-PGF2a和LPO含量降低，但均無明顯差異（t>0.05）。接塵組與正常對照組相比，Nrf2、T-AOC和LPO含量明顯升高（P<0.05）?而HO-1和8-iso-PGF2a也升高，但變化不明顯。2不同接塵年限壹期CWP患者血清中HO-1'Nrf2ヽT-AOCヽ8-iso-PGF2a和LPO含量變化:接塵年限~25年、25~30年和30年~3組Kruskal-WallisH檢驗結(jié)果顯示，壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO濃度均無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（2>0.05）。3壹期CWP并發(fā)肺部疾病組與單純壹期CWP組血清中HO-1'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化:壹期CWP并發(fā)肺部疾病組與單純壹期CWP組Kruskal-WallisH檢驗結(jié)果顯示?HO-1、Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO血清含量無明顯變化?差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。4壹期CWP吸煙與非吸煙患者血清中HO-1'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化:壹期CWP吸煙與非吸煙患者兩組之間進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗,結(jié)果顯示，兩組CWP患者血清中HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量無顯著性差異（2>0.05）。5壹期CWP飲酒與非飲酒患者血清HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化:壹期CWP飲酒與非飲酒患者兩組之間進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗，結(jié)果顯示?壹期CWP飲酒患者血清中HO-1'Nrf2和8-iso-PGF2a含量降低?差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.122'-2.138'-2.253，P<0.05）-T-AOC和LPO也有降低趨勢，但無顯著性差異（P>0,05）。6壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO的相共性分析:壹期CWP組相關(guān)分析結(jié)果顯示?HO-1與Nrf2'8-iso-PGF2a-8-iso-PGF2a與Nrf2'LPO-T-AOC與LPO均呈明顯正相關(guān)(厶=0.840ヽ0.882'0.885'0,292'0.316?P<0.05)?其余各指標(biāo)之間均不相關(guān)(尸>0.05)。7壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2ヽT-AOC、8-iso-PGF2a、LPO與肺功能的相關(guān)性分析:壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2、T-AOC、8-iso-PGF2a'LPO與肺功能指標(biāo)FEV1(%)'FVC(%)'FEV1/FVC(%)'MW(%)無相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。結(jié)論1壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量較接塵組均降低，但T-AOC含量降低明顯?認(rèn)為T-AOC在CWP的早期篩檢中可能具有重要作用。2與正常對照組相比，接塵組LPO和T-AOC的升高幅度明顯高于CWP組,認(rèn)為接塵組中氧化應(yīng)激程度較CWP組強(qiáng)烈。同時，2組中LPO升高幅度均高于T-AOC?說明CWP患者和接塵工人體內(nèi)氧化損傷作用占優(yōu)勢。3壹期CWP飲酒患者血清HO-1'Nrf2和8-iso-PGF2a含量顯著降低，提示CWP患者體內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的變化受飲酒影響。圖5幅;表8個;參71篇。關(guān)鍵詞:煤エ塵肺;血紅素氧合酶-1;核因子E2相關(guān)因子2；總抗氧化能力;8-異前列腺素F2a;脂質(zhì)過氧化物分類號：R135.2AbstractObjectivesCoalworker'spneumoconiosis(CWP)isaseriouskindofsystemicdisease,whichiscausedbylong-terminhalationofCoaldustwithchronicpulmonaryinflamationandfibrosis.IthasthehighestincidenceofoccupationdiseaseinChina.Manyresearchesfindthatthemechanismofpulmonaryinflammationandfibrosisisrelatedtothebody'simmunefunction.Oxidant/antioxidantimbalancemayalsopalysanimportantroleinthemechanism.Inmanyofthepreviousstudies,peopledetectthechangeofsuperoxidedismutase(SOD),catalase(CAT),glutathioneperoxidase(GSH-Px)andmaleicdialdehyde(MDA)toevaluatethelevelofoxidativestressinpatients,buteasytobeinfluencedbythemethodandinterferencefactors.Inrecentyears,researchershavediscoveredseveralbetterevaluationindicatorssuchasHemeoxygenase-1(HO-1),Nuclearfactor-E2-relatedfactor2(Nrf2)and8-iso-prostaglandinF2a(8-iso-PGF2a).ItiscloselyrelatedtoHO-1andNrf2inantioxidanteffect.8-iso-PGF2aistheendproductoflipidperoxidation.Theduststimulatethebodytoproducemanyantioxidantsubstances,suchasHO-1(changeofitslevelisregulatedbyNrf2)againstharmfulsubstancescauseddamage(Totalantioxidantcapacity(T-AOC)levelresponsevariousantioxidants).Whentheantioxidanteffectofinadequateordamage,lipidperoxidationofcellmembranemaybeinduced,generatinglipidperoxidesandendproduct8-iso-PGF2a.Atpresent,thechangesofserumHO-1,Nrf2and8-iso-PGF2aisrareincoalworkerspneumoconiosis.Therefore,thedetectionofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLipidperoxide(LPO)contentinpatientswithCWP,tofiitherexploretheantioxidantandlipidperoxidationindexinCWPchangesanddevelopment,providethebasisforthemechanismresearch,clinicaldiagnosisandthetreatmentofantioxidantCWP.MethodsThecasegroupofthisstudyinclude91caseswithstageICWPfrom2012to2013,allofthemwerediagnosedaccordingto2009nationalpneumoconiosisstandards(GBZ70-2009).Meanwhile,40casesofhealthyminerwererecruitedasdustcontactedgroup,Besides,another33casesofhealthyvolunteerswhoneverworkedinminewerealsorecruitedascontrolgroup,whichmatchedwiththecasegroupinsex,agesandwordedcondition.AllcasesaboveweredonehealthyexaminationintheInstituteofOccupationDiseasePreventionandCureofKaiLuanin2013.Allcasesweredrawnout4mlveinbloodreservedwithnonanticoagulanttubesafterroutineantisepsisinearlymorning.Enzyme-linkedImmunosorbentAssayswereappliedtodetecttheconcentrationofserumHO-1,Nrf2and8-iso-PGF2a.ColorimetricmethodwereappliedtodetecttheconcentrationofserumT-AOCandLPO.2SPSS13.0statisticalsoftwarewasusedtoanalyzetheabovementioneddate.Measuermentdatewhichfollowsthenormaldistributionweredescribedwithmean±standard,thenT-testwasusedtocomparethedifferencebetweentwogroups.F-testwasusedtocomparethedifferenceamongthreegroups.Thedatewhichdonotfollowsthenormaldistributionweredescribedwithmedianandquartilerange.Mann-WhitneyUtestwasusedtocomparethedifferencebetweentwogroup.Kruskal-WallisHtestwasusedtocomparethedifferenceamongthreegroups,thenNemenyitestwasusedtocomparethedifferencebetweentwogroupsamongthreegroups.Thespearsonmethodwasusedforthecorrelationanalysis.P<0.05wassupposedtobestatisticallysignificant.Results1ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstageICWP.Kruskal-WallisHtestwasusedtocomparethedifferenceamongCWPgroup,dustcontactedgroupandhealthycontrolgroup,theconcentrationsofserumNrf2,T-AOCandLPOwereobviousdifference(x2=8.809,34.075,55.462,P=0.012,0.000,0.000),butHO-1and8-iso-PGF2awerenoobviousdifference(x2=2.657,2.705,P=0.265,0.259).TheconcentrationsofserumLPOinpatientswithstageICWPweresignificantlyhigher(P<0.01),thanthatinhealthycontrolgroup,theconcentrationsofserumNrf2andT-AOCwereslightlyhigher,theconcentrationsofserumHO-1and8-iso-PGF2awereslightlylower.TheconcentrationsofserumNrf2,T-AOC,HO-1and8-iso-PGF2ahadnodistinctdifferenceamonggroupsinstatistics(P>0.05).TheconcentrationsofserumT-AOCweresignificantlylowerinstageICWPgroupthanthatindustcontactedgroup(P<0.01),whileHO-1,Nrf2,8-iso-PGF2aandLPOwerelower,buthadnoobviousdifference(P>0.05).TheconcentrationsofserumNrf2,T-AOCandLPOindustcontactedgroupweresignificantlyhigherthanthatinhealthycontrolgroup(P<0.05),therewerenodifferencefbrtheconcentrationsofserumHO-1and8-iso-PGF2aincreased.2ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstageICWPindustexposureyears.Kruskal-WallisHtestwasusedtocomparethedifferenceamongpatientswithstageICWPwhoengagedindustexposurefor~25years,25?30yearsand30years~,theconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstagesimpleICWPhadnodistinctdifferenceamonggroupsinstatistics(P>0.05).3ThechangesofserumHO-1,Nrf2,1-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstageICWPwithcomplication.Kruskal-WallisHtestwasusedtocomparethedifferencebetweengroups,theconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstagesimpleICWPhadnodistinctdifferenceamonggroupsinstatistics(P>0.05).4ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinsmokingpatientswithstageICWP.TheconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOhadnodistinctdifferencebetweensmokingpatientswithstageICWPandnon-smokingpatientswithstageICWPinstatistics(P>0.05).5ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOindrinckingpatientswithstageICWP.TheconcentrationsofserumHO-1,Nrりand8-iso-PGF2aindrinckingpatientswithCWPweresignificantlylowerthanthatinno-drinckingpatientswithCWP(Z=-2.122,-2.138,-2.253,P<0.05),whiletheconcentrationsofserumT-AOCandLPOindrinckingpatientswithCWPwerealsoslightlylowerthanthatinno-drinckingpatientswithCWP(P>0.05).6ThecorrelationoftheconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstageICWP.TheconcentrationsofserumHO-1hadsignificantlypositivecorrelationtoNrf2and8-iso-PGF2a,theconcentrationsof8-iso-PGF2ahadalsopositivecorrelationtoNrf2andLPO,T-AOCwaspositivelycorrelatedwithLPO(ね=0.840,0.882,0.885,0.292,0.316,P<0.05)inpatientswithstageICWP.Therestindexwerenotreleated(P>0.05).7ThecorrelationoftheconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2a,LPOandpulmonaryfunctionindexesinpatientswithstageICWP.InstageICWPpatients,theconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2a,LPOandlungfunctionindexesrespectivelyFEV1(%),FVC(%),FEV1/FVC(%),MVV(%)isnocorrelation(P>0.05).Conclusions1TheconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOwerealllower,butT-AOCwassignificantlylowerinpatientswithstageICWPthanthatindustcontactedgroup,suggestthatT-AOCmayplayanimportantroleintheearlydetectionofCWP.2Comparedwiththenormalcontrolgroup,serumLPOandT-AOCchangescopewassignificantlyhigherindustcontactedgroupthanthatinCWPgroup,itsuggestedthatthedegreeofoxidativestresstobestrongerindustcontactedgroup.Atthesametime,serumLPOchangescopeintwogroupsincreasedsignificantlyhigherthanthatoftheT-AOC,suggestedthattheoxidativedamageeffectsplayedamajorroleinstageICWPgroupanddustcontactedgroup.3TheconcentrationsofserumHO-1,Nrf2and8-iso-PGF2aweresignificantlylowerindrinkingpatientswithstageICWPthanthatno-drinkingpatients,suggestedthatthechangesofserumoxidativestressindexlevelwereinfluencedbydrinking.Figure5;Table8;Reference71Keywords:cwp,ho-1,nrf2,t-aoc,8-iso-pgf2a,IpoChinesebookscatalog:R135.2目次TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"引言 1\o"CurrentDocument"第1章實驗研究 4\o"CurrentDocument"樣本收集 4一般資料 4標(biāo)本的采集與處理 5主要檢測指標(biāo) 5所需儀器及設(shè)備 5主要試劑 6實驗操作方法 6統(tǒng)計學(xué)分析 11質(zhì)量控制 11結(jié)果 12壹期CWP組、接塵對照及正常對照組血清中H0-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化 12不同接塵年限壹期CWP患者血清中HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化 12壹期CWP并發(fā)肺部疾病組與單純壹期CWP組血清中H0-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化 13壹期CWP吸煙與非吸煙患者血清中HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化 14壹期CWP飲酒與非飲酒患者血清HO-1'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化 14壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO的相關(guān)性分析 15壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2、T-AOCヽ8-iso-PGF2a'LPO與肺功能的相關(guān)性分析 16\o"CurrentDocument"討論 16\o"CurrentDocument"結(jié)論 22-VII-河北聯(lián)合大學(xué)碩士學(xué)位論文TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"參考文獻(xiàn) 22\o"CurrentDocument"第2章綜述 26\o"CurrentDocument"HO-1和Nrf2在氧化/抗氧化肺部疾病中的研究進(jìn)展 26\o"CurrentDocument"HO-1和Nrf2分子結(jié)構(gòu)、來源及生物學(xué)功能 26\o"CurrentDocument"HO-1和Nrf2在哮喘中的作用 27\o"CurrentDocument"HO-1和Nrf2在慢性阻塞性肺疾病中的作用 28\o"CurrentDocument"HO-1和Nrf2在急性肺損傷中的作用 29\o"CurrentDocument"HO-1和Nrf2在肺癌中的作用 29\o"CurrentDocument"HO-1和Nrf2在肺纖維化中的作用 30\o"CurrentDocument"纟言語 31\o"CurrentDocument"參考文獻(xiàn) 31附錄 35\o"CurrentDocument"致謝 40\o"CurrentDocument"導(dǎo)師簡介 41\o"CurrentDocument"作者簡介 43子位Iロ乂數(shù)扌居集 44VIII-英文縮略表英文縮略表英文縮寫英文全稱中文全稱CWPCoalworker'spneumoconiosis煤エ塵肺COPDChronicobstructivepulmonarydisease慢性阻塞性肺疾病HO-1Hemeoxygenase-1血紅素氧合酶ー1Nrf2Nuclearfactor-E2-relatedfactor2核因子E2相關(guān)因子2T-AOCrotaIantioxidantcapacity總抗氧化能力8-iso-PGF2a8-iso-prostaglandinF2a8ー異前列腺素F2aLPOLipidperoxide脂質(zhì)過氧化物ROSReactiveoxygenspecies活性氧MDAMaleicDialdehyde丙二醛ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶聯(lián)免疫吸附試驗ODOpticaldensity光密度FEV1Forcedexpiratoryvolumeinonesecond一秒鐘用カ呼氣量FVCForcedvitalcapacity用カ肺活量MWMaximalvoluntaryventilation每分鐘最大通氣量ILInterleukin白細(xì)胞介素ThHelperTcell輔助性T細(xì)胞SODSuperoxidedismutase超氧化物歧化酶CATCatalase過氧化氫酶GSH-PxGlutathioneperoxidase谷胱甘肽過氧化物酶GSHGlutataione谷胱甘肽引言CWP是煤礦作業(yè)人員在煤炭生產(chǎn)中長期吸入粉塵而致的以肺結(jié)構(gòu)慢性炎癥、纖維化為主要病理表現(xiàn)的ー類疾病川，它是我國職業(yè)病中發(fā)病率最高、嚴(yán)重危害煤礦工人健康的主要疾病。目前，CWP的發(fā)病機(jī)制尚不明確，特別是關(guān)于促進(jìn)炎癥和纖維化形成的機(jī)制仍不十分清楚，也無有效的治療手段。最近，許多研究發(fā)現(xiàn)肺部炎癥和纖維化發(fā)病機(jī)制除與機(jī)體免疫功能有關(guān)外，氧化/抗氧化失衡起到重要作用[2]"以往研究中，經(jīng)典的抗氧化酶有超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)'過氧化氫酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathioneperoxidase,GSH-Px)等，而評價脂質(zhì)過氧化的常見指標(biāo)有丙二醛(Maleicdialdehyde,MDA)，抗氧化酶能夠抑制脂質(zhì)過氧化作用，減輕氧化應(yīng)激給機(jī)體造成的損傷。但是，上述指標(biāo)檢測方法特異性不高，易受非特異物質(zhì)如糖、膽紅素，乙醛等干擾，加熱時間和溫度會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響網(wǎng)。因此.我們期待進(jìn)ー步尋求新的抗氧化及脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，以期彌補(bǔ)上述物質(zhì)檢測中的不足。研究者們最近發(fā)現(xiàn)幾個比較新的反應(yīng)氧化應(yīng)激程度的指標(biāo)，包括血紅素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1,HO-1)、核因子E2相今因子2(Nuclearfactor-E2-relatedfactor2,Nrf2)和8ー異前列腺素F2a(8-iso-prostaglandinF2a,8-iso-PGF2a)■HO-1和Nrf2主要在抗氧化、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物8-iso-PGF2a主要在評價氧化損傷及疾病程度中發(fā)揮重要作用，SiO2粉塵進(jìn)入機(jī)體后可引起呼吸暴發(fā),產(chǎn)生大量的自由基,驅(qū)動肺泡巨噬細(xì)胞膜的過氧化反應(yīng)。氧自由基與生物膜的磷脂、酶和膜受體有關(guān)的多不飽和脂肪酸側(cè)鏈及核酸等作用，形成脂質(zhì)自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程，可以使生物膜的流動性和通透性產(chǎn)生變化⑷。體內(nèi)還可產(chǎn)生許多抗氧化物質(zhì)，如H0-1(其水平的變化受Nrf2調(diào)控⑸)等以對抗有害刺激引起的破壞作用(總抗氧化能力(Totalantioxidecapacity,T-AOC)可以反應(yīng)各種抗氧化作用總的抗氧化水平)。當(dāng)抗氧化作用不充分或受到破壞時，生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)占優(yōu)勢，產(chǎn)生有細(xì)胞毒性的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物L(fēng)ipidperoxide(LPO)和終末產(chǎn)物8-iso-PGF2a等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞。下面將幾個新指標(biāo)結(jié)合兩個反應(yīng)總體水平的指標(biāo)進(jìn)行介紹:人體HO-!蛋白由288個氨基酸組成，分子量為32000。HO-!基因定位于人第22號染色體長臂1區(qū)2帶，包括5個外顯子和4個內(nèi)含子。有一個官動子、ー個近端增強(qiáng)子和兩個遠(yuǎn)端增強(qiáng)子，這些區(qū)域含有許多轉(zhuǎn)錄因子如Nrf2的結(jié)合位點。生理狀態(tài)下，HO-1主要分布于單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的微粒體中，在神經(jīng)元、肝臟、脾臟中濃度較高，而又在脾臟組織中最高?約為肝臟的10倍。肺中HO-1主要在肺泡巨噬細(xì)胞中表達(dá)在上皮細(xì)胞中偶見表達(dá)，在淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞及漿細(xì)胞中均未見表達(dá)向。HO-1屬微粒體酶?是血紅素氧合酶同工酶之ー?為誘導(dǎo)型血紅素氧合酶,能被多種能夠產(chǎn)生氧化應(yīng)激的因素如炎性細(xì)胞因子、高熱、重金屬，紫外線照射、血紅素等所激活，以減少細(xì)胞損傷、蛋白質(zhì)氧化及脂質(zhì)過氧化。而且?HO-1對成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞和其他多種細(xì)胞具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗增殖的保護(hù)作用。Nrf2是ー個由2.2Kb的堿基對編碼,相對分子質(zhì)量為66000的蛋白。人類Nrf2基因位于2號染色體長臂3區(qū)1帶，含有6個不同的同源結(jié)構(gòu)域。Nrf2主要表達(dá)于如肝臟、腎臟等代謝和解毒組織中?以及ー些持續(xù)暴露在環(huán)境中的組織如皮膚，消化道、肺等?普遍表達(dá)于各種細(xì)胞。Nrf2在肺中主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞[7]。生理條件下，胞漿中的Nrf2處于不斷降解狀態(tài),以維持細(xì)胞內(nèi)平衡。當(dāng)受到氧化應(yīng)激刺激時?Nrf2穩(wěn)定性增加并被激活,轉(zhuǎn)移入核和相應(yīng)蛋白形成二聚體，這種復(fù)合物通過順式作用DNA元件激活HO-1基因轉(zhuǎn)錄陽。Nrf2起到感受器的作用，它水平的變化可能先于抗氧化酶的變化。體外研究稱?人Nrf2基因多態(tài)性對內(nèi)毒素刺激后巨噬細(xì)胞中的Nrf2蛋白和基因表達(dá)有顯著影響，并對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)平衡有重要的調(diào)控作用⑼。在對鼠肺泡H型上皮細(xì)胞的增殖與分化的研究中也發(fā)現(xiàn)，Nrf2-/?細(xì)胞中ROS水平較Nrf2+/+細(xì)胞高，而抗氧化物谷胱甘肽水平低下，認(rèn)為肺泡!!型細(xì)胞中Nri2的缺陷可使ROS水平升高，抗氧化物谷胱甘肽水平下降[10]〇T-AOC代表體內(nèi)酶類少數(shù)小分子量抗氧化物質(zhì)和非酶類抗氧化物質(zhì)的總和，反映各抗氧化物之間相互聯(lián)系、協(xié)同保護(hù)作用的關(guān)系，是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。它較其他單純反應(yīng)氧化/抗氧化損傷的指標(biāo)更加綜合和全面。T-AOC可用于早期發(fā)現(xiàn)CWP患者，其靈敏度達(dá)70.5%，特異度達(dá)68.1%口リ。8-iso-PGF2a是ー組含20個碳原子的不飽和脂肪酸，是ー個分子量為354.5的小分子脂類物質(zhì)。生理條件下，它主要存在于天然低密度脂蛋白中，當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激時，天然低密度脂蛋白可被氧化修飾，此時8-iso-PGF2a水平升高口為。8-iso-PGF2a主要存在于人的各種組織和體液中，尤其以肺組織中最多囘。8-iso-PGF2a是自由基催化細(xì)胞膜上的花生四烯酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化（非酶促反應(yīng)）后的穩(wěn)定終末產(chǎn)物，盡管不是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，但能夠引起成纖維細(xì)胞的增殖和分化，還能夠靈敏地反映體內(nèi)氧化應(yīng)激水平并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，是評價氧化/抗氧化狀態(tài)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的理想生物指標(biāo)。8-iso-PGF2a的形成可被超氧化物歧化酶和二丁基羥基甲苯所抑制內(nèi)。另外,8-iso-PGF2a自身能促進(jìn)細(xì)胞分裂，趨化單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞粘附于內(nèi)皮細(xì)胞，形成慢性炎癥反應(yīng)和氧化環(huán)境即氧化應(yīng)激。有研究顯示?監(jiān)測血清8-iso-PGF2a水平有助于反應(yīng)哮喘患者體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)?評價病情嚴(yán)重程度［⑸。LPO是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，出現(xiàn)在脂質(zhì)過氧化作用的后期階段?是脂類中不飽和脂肪酸和自由基亞氧化產(chǎn)物對細(xì)胞起破壞作用時產(chǎn)生物的總稱?是細(xì)胞膜損傷的重要因素。脂質(zhì)過氧化可能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)m型前膠原和層黏連蛋白的合成，使細(xì)胞外基質(zhì)沉積增加，促進(jìn)肺間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展［的。HO-l'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO是比較新的評價機(jī)體氧化應(yīng)激的幾個指標(biāo)。在煤エ塵肺的研究中氧化/抗氧化機(jī)制越來越受到重視,但在煤エ塵肺中的效應(yīng)機(jī)制的研究尚處于初始階段，本試驗采用酶聯(lián)免疫吸附法、比色法檢測91例已確診壹期CWP及40例具有相同接塵條件但未發(fā)病的井下接塵對照以及33例正常對照組血清中HO-l'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO的水平;旨在探討壹期CWP患者體內(nèi)HO-l'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO血清水平的變化及相互關(guān)系，為CWP的機(jī)制研究、臨床診斷及抗氧化治療提供新思路。第1章實驗研究樣本收集一般資料本次研究對象來自2012年到2013年開灤職業(yè)病防治院部分住院的壹期CWP患者。選取經(jīng)開灤職業(yè)病防治院按照2009年國家塵肺診斷標(biāo)準(zhǔn)(GBZ-2009)確診患者289例。井下接塵礦エ40例，井上不接塵的健康人33例，分別來自呂家坨礦、唐山礦、林西礦'范各莊礦等各個礦區(qū)。病例資料均詳細(xì)核對并錄入excel表，以方便進(jìn)行查詢和數(shù)據(jù)統(tǒng)計。經(jīng)過精心篩選，實驗最后選取91例壹期CWP患者(CWP組)，其中包括無并發(fā)癥17例，并發(fā)COPD15例，并發(fā)肺氣腫59例，其中從事井下采煤エ22人、掘進(jìn)エ57人、開拓エ10人、瓦斯監(jiān)測エ1人?地質(zhì)測量エ1人，吸煙者54例，飲酒者41例。在問卷調(diào)查表中，記錄肺功能相關(guān)指標(biāo)"包括FEV1(%)'FVC(%)'FEV1/FVC(%)及MVV(%)等。具備與病例組相同接塵條件的40例健康井下接塵礦エ(接塵組)和33例幵灤非接塵井上健康查體工人(正常對照組)。所選對象均為男性，且無肝臟疾病、心腦血管病、糖尿病、腎病史及近期肺部感染史?無免疫系統(tǒng)疾病，未接受過影響免疫功能及內(nèi)分泌功能的治療。病例資料均分批詳細(xì)查閱錄入excel表。三組間臨床資料見表1。表1三組間臨床資料Table1Clinicaldatabetweenthethreegroups組別性別例數(shù)年齡(歲)平均年齡(夕)接塵年限(午)接塵年限(年MQCWP組男9153?6960.09±3.738?3829.008.00接塵組男4053?7059.40±5.577?3731.003.00對照組男335〇?7960.55±9.31——經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，各組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.383■P=0.683)，接塵年限差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-1.726，と0.084)具有可比性。1)2009年國家塵肺病診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)(GBZ70-2009)診斷原則:依據(jù)可靠的生產(chǎn)性粉塵接觸史，以技術(shù)質(zhì)量合格的X射線后前位胸片表現(xiàn)為主要依據(jù)，聯(lián)合現(xiàn)場職業(yè)衛(wèi)生學(xué)、塵肺流行病學(xué)考察材料和健康監(jiān)護(hù)資料?參考臨床表現(xiàn)和實驗室檢查?排除其余的肺部類似疾病后?對照塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)片小陰影總體密集度至少達(dá)到1級?分布范圍最少達(dá)到兩個肺區(qū)，方可做出塵肺病的診斷。X射線胸片表現(xiàn)分期:壹期塵肺:有總體密集度1級的小陰影，至少達(dá)到兩個肺區(qū)的分布范圍。貳期塵肺:有總體密集度2級的小陰影，超過4個肺區(qū)的分布范圍;或有總體密集度3級的小陰影，超過4個肺區(qū)的分布范圍。叁期塵肺有下列三種表現(xiàn)之一者:（1）有大陰影出現(xiàn)，其長徑不小于20mm，短徑不小于10mm；（2）有總體密集度3級的小陰影，超過4個肺區(qū)的分布范圍，并有小陰影聚（3）有總體密集度3級的小陰影，超過4個肺區(qū)的分布范圍，并有大陰影。標(biāo)本的采集與處理患者于凌晨8-10時空腹抽取肘靜脈血4ml，室溫狀態(tài)下靜置1小時?放在低溫離心機(jī)中，以3000轉(zhuǎn)/分，離心!0分鐘，取血清放入EP管中，儲存在-20℃的冰箱中保存，待測。主要檢測指標(biāo)）人血清中HO-1濃度）人血清中Nrf2濃度）人血清中ATOC濃度）人血清中8-iso-PGF2a濃度）人血清中LPO濃度1.1.4所需儀器及設(shè)備）酶標(biāo)儀 美國StatFax-2100）洗板機(jī) 美國StatFax-2600）37℃水浴箱 北京SHH.W21）漩渦振蕩器 姜堰XK96-B5）離心機(jī) 北京）冰柜 海爾BD388A）冰箱 海爾）微量可調(diào)加樣器 芬蘭）722分光光度計）量筒、燒杯）玻璃棒）定時器）一次性吸頭）蒸儲水）比色杯）吸水紙）試管18）計算器主要試劑HO-1酶聯(lián)免疫試劑盒、Nrf2酶聯(lián)免疫試劑盒、T-AOC比色法試劑盒、8-iso-PGF2a酶聯(lián)免疫試劑盒和LPO比色法試劑盒均購自南京建成生物研究所實驗操作方法1）HO-1的測定（1）原理應(yīng)用EL1SA方法測定標(biāo)本中人HO-1水平。向預(yù)先包被了人HO-1單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入HO-1-溫育;溫育后加入生物素標(biāo)記的抗HO-1抗體?再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合?形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物AヽB■產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中人HO-1的濃度呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人HO-!濃度。（2）試劑］準(zhǔn)備①5號標(biāo)準(zhǔn)品:將1203的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到120ul原倍標(biāo)準(zhǔn)品（48ng/ml），配制成24ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品②4號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到!20ul 5號標(biāo)準(zhǔn)品（24ng/ml）?配制成12ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品③3號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到120ul成6ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品④2號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到120ul成3ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品⑤1號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到120ul4號標(biāo)準(zhǔn)品(12ng/ml)?配制3號標(biāo)準(zhǔn)品(6ng/ml),配制2號標(biāo)準(zhǔn)品(3ng/ml)?配制成1.5ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品⑥洗滌液稀釋:將濃縮稀釋液20ml用蒸禰水580ml稀釋30倍后，備用(3)檢測①將所需試劑盒和待測樣品平衡至室溫。②確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目。③1孔設(shè)為空白對照孔,2-6孔分別設(shè)為1-5號標(biāo)準(zhǔn)品孔，6孔以后設(shè)為待測樣品孔。于2-6孔中分別加入對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品50ul于待測樣品孔中加入待測樣品40ul,然后加抗-HO-1抗體10ul于待測樣品孔?再向標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣品孔中分別加入鏈酶親和素-HRP50U1。蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻?37℃溫育60分鐘。④小心揭掉封板膜，洗板機(jī)將酶標(biāo)板用制備好的稀釋洗滌液洗滌5次，吸水紙上拍干。⑤每孔(包括空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣品孔)先加入顯色劑A 50ul-再加入顯色劑B50ul，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。⑥然后再向每孔加入終止液50ul以終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色)。⑦10分鐘之內(nèi)，于450nm波長處依次測量各孔的吸光度值(OD值)。(4)結(jié)果計算依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程?再依據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。2)Nrf2的測定(1)原理同HO-1原理(2)試劑準(zhǔn)備①5號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到120ul原倍標(biāo)準(zhǔn)品(16ng/ml)?配制成8ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品②4號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到120ul 5號標(biāo)準(zhǔn)品(8ng/ml)?配制成4ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品第1章實驗研究-7-③3號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul③3號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到120ul成2ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品④2號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到120ul成lng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品⑤1號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到120ul成0.5ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品4號標(biāo)準(zhǔn)品(4ng/ml)1配制3號標(biāo)準(zhǔn)品(2ng/ml),配制2號標(biāo)準(zhǔn)品(lng/ml)?配制⑥洗滌液稀釋:將濃縮稀釋液20ml用蒸儲水580ml稀釋30倍后，備用(3)檢測①將所需試劑盒和待測樣品平衡至室溫。②確定本次檢測所需要的已經(jīng)包被好抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目。③1孔設(shè)為空白對照孔,2-6孔分別設(shè)為1-5號標(biāo)準(zhǔn)品孔，6孔以后設(shè)為待測樣品孔。于2-6孔中分別加入對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品50ul于待測樣品孔中加入待測樣品40ul,然后加抗-Nrf2抗體10ul于待測樣品孔?再向標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣品孔中分別加入鏈酶親和素一HRP50ul。蓋上封板膜?輕輕振蕩使之混勻,37て溫育60分鐘。④小心揭掉封板膜，洗板機(jī)將酶標(biāo)板用制備好的稀釋洗滌液洗滌5次，吸水紙上拍干。⑤每孔(包含空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣品孔)先加入顯色劑A 50ul-再加入顯色劑B50ub輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。⑥每孔加入終止液50ul以終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色)。⑦10分鐘之內(nèi)，于450nm波長處依次測量各孔的吸光度值(OD值)。(4)結(jié)果計算依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程-再依據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。3)T-AOC的測定(1)原理機(jī)體中有很多抗氧化物質(zhì),能使Fe?+還原成Fe2;后者可與菲琳類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，經(jīng)過比色可測出其抗氧化能力的高低。(2)試齊リ準(zhǔn)備①試劑二應(yīng)用液配制:兩支粉劑加240ml蒸儲水充分溶解②試劑三應(yīng)用液:3m)貯備液用稀釋液57ml以1:19稀釋③混合試劑的配制:將試劑ー120ml，試劑二240ml?試劑三60ml混合配制(3)檢測①將所需試劑盒和待測樣品平衡至室溫。②測定管中加入待測樣品!00ul然后加入混合試劑3.5ml于對照管和測定管1|1〇③漩渦混勻器充分混勻，37て水浴30分鐘。④分別向?qū)φ展芎蜏y定管中加入lOOul試劑四，然后再向?qū)φ展苤屑尤氪郎y樣品lOOul。⑤充分混勻放置10分鐘?蒸儲水調(diào)零，520nm波長?光徑1cm?測定各管吸光度值。(4)結(jié)果ヨ尸ハヒ+測定OD值對照OD值 反應(yīng)液總量?セOifilHTざ7モ至雙"立卅,ハ息抗理化龍カ=+30^x桿ロロ測試刖稀釋倍數(shù)(1)0.01取樣量0.014)8-iso-PGF2a的測定(1)原理同HO-1(2)試劑!準(zhǔn)備①5號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到120ul原倍標(biāo)準(zhǔn)品(240pg/ml)?配制成120ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品②4號標(biāo)準(zhǔn)品:將②4號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到120ul配制成60ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品③3號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到120ul制成30ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品④2號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到120ul制成15ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品⑤1號標(biāo)準(zhǔn)品:將120ul的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入到120ul制成7.5ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品5號標(biāo)準(zhǔn)品(120ng/ml)14號標(biāo)準(zhǔn)品(60ng/ml)?配3號標(biāo)準(zhǔn)品(30ng/ml)?配2號標(biāo)準(zhǔn)品(15ng/ml)?配⑥洗滌液稀釋:將濃縮稀釋液20ml用蒸儲水580ml稀釋30倍后?備用(3)檢測①將所需試劑盒和待測樣品平衡至室溫。②確定本次檢測所需要的已包被好抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目。③1孔設(shè)為空白對照孔-2-6孔分別設(shè)為1-5號標(biāo)準(zhǔn)品孔，6孔以后設(shè)為待測樣品孔。于2-6孔中分別加入對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品50ul?于待測樣品孔中加入待測樣品40ul,然后加-9-抗ー8-iso-PGF2a抗體10ul于待測樣品孔，再向標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣品孔中分別加入鏈酶親和素一HRP 50ul。蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60分鐘。④小心揭掉封板膜，洗板機(jī)將酶標(biāo)板用制備好的稀釋洗滌液洗滌5次,吸水紙上拍干。⑤每孔(包含空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣品孔)先加入顯色劑A50ul-再加入顯色劑B50ul-輕輕震蕩混勻，37て避光顯色10分鐘。⑥每孔加入終止液50ul以終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色)。⑦10分鐘以內(nèi)，于450nm波長處依次測量各孔的吸光度值(OD值)。(4)結(jié)果計算依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程-再依據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。5)LPO的測定(1)原理LPO在45て反應(yīng)60分鐘的條件下，一分子LPO和兩分子的顯色試劑反應(yīng)，產(chǎn)生ー種穩(wěn)定的生色團(tuán)，在586nm下有最大吸收峰。通過作標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，或通過公式計算可得到檢測物中LPO的含量。(2)試劑準(zhǔn)備①5號標(biāo)準(zhǔn)品:即原倍標(biāo)準(zhǔn)品(lOumol/1)②4號標(biāo)準(zhǔn)品:將500ul的乙醇加入到500ul原倍標(biāo)準(zhǔn)品(10umol/l)?配制成5umol/l的標(biāo)準(zhǔn)品③3號標(biāo)準(zhǔn)品:將400ul的乙醇加入到100ul原倍標(biāo)準(zhǔn)品(lOumol/1)配制成2umol/l的標(biāo)準(zhǔn)品④2號標(biāo)準(zhǔn)品:將9003的乙醇加入到100ul原倍標(biāo)準(zhǔn)品(10umol/l)，配制成lumol/1的標(biāo)準(zhǔn)品⑤1號標(biāo)準(zhǔn)品:將500ul的乙醇加入到500ul 2號標(biāo)準(zhǔn)品(lumol/1),配制成0.5umol/l的標(biāo)準(zhǔn)品⑥試劑ー應(yīng)用液的配制:30ml貯備液與10ml稀釋液混合，備用(3)檢測①將所需試劑盒和待測樣品平衡至室溫。②確定本次檢測所需的96孔板的板孔數(shù)目。將1孔設(shè)為空白孔,2-6孔設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)孔?6孔以后為測定孔。③向空白管中加入200ul無水乙醇?標(biāo)準(zhǔn)管中加入1-5號標(biāo)準(zhǔn)品200ul，測定管中河北聯(lián)合大學(xué)碩士學(xué)位論文

-10-加入200ul待測樣本。④每管（包括空白管，標(biāo)準(zhǔn)管和測定管）中加入650ul試劑ー應(yīng)用液?蓋上蓋?充分混勻。⑤每管中加入試劑二150ul。蓋上蓋充分混勻，45て孵育60分鐘,4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清液200ul加入到96孔板中，586nm波長，測定各孔OD值。（4）結(jié)果計算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程-再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。統(tǒng)計學(xué)分析運用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示,兩均數(shù)比較采用t檢驗;偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）、四分位數(shù)間距（Q）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，多組間兩兩比較Nemenyi檢驗，Mann-WhitneyU檢驗用于兩組間的比較?采用Spearman方法進(jìn)行相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。質(zhì)量控制1）嚴(yán)格按操作規(guī)程統(tǒng)ー采集、儲存標(biāo)本。2）所選研究對象嚴(yán)格按照2009年國家塵肺病診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)（GBZ70-2009）并經(jīng)錢營職業(yè)病醫(yī)院確診后，進(jìn)行分類、分期。3）選取無黃疸、溶血和脂血的標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)ー測定。4）所有試劑及標(biāo)本使用前均平衡至室溫，用前搖勻。5）試驗前檢查和調(diào)試儀器，使之狀態(tài)良好，運轉(zhuǎn)正常，并嚴(yán)格按照說明操作。6）加樣器每次加不同的標(biāo)品時需要更換吸嘴?吸取及加樣時，保證垂直地吸取及加入微孔板，避免觸碰孔的上部邊緣?以避免交叉污染。7）使用分光光度計時，不檢測的情況下，將試樣室蓋子打開;拿取比色杯時，只能觸碰毛玻璃面，不能碰光學(xué)表面;比色杯外壁附著的液體用軟的吸水紙吸干，避免擦拭，以免損傷光學(xué)表面;檢測完一個樣本后，應(yīng)將比色杯用蒸儲水沖洗干凈，以免影響檢測結(jié)果。結(jié)果壹期CWP組、接塵對照及正常對照組血清中H0-1'Nrf2ヽT-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化三組間的Kruskal-WallisH檢驗結(jié)果顯示?Nrf2ヽT-AOC和LPO各組間有統(tǒng)計學(xué)差異(?=8.809、34.075、55.462-P=0.012'0.000、0.000)，而HO-1和8-iso-PGF2a無明顯差異(/=2.657、2.705，P=0.265、0.259)。Nemenyi檢驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，壹期CWP組LPO含量明顯升高(ズ=34.813?P=0.000)，Nrf2和T-AOC有升高趨勢(ノ=1.004'4.645-P=0.605'0.098)-HO-1和8-iso-PGF2a有降低趨勢,但均無明顯差異;與接塵組比較，血清T-AOC含量明顯降低?差異有統(tǒng)計學(xué)意義(？=21.029-P=0.000)-Nrf2和LPO含量降低(7=5.720'4.415?P=0.057'0.110)■HO-I和8-iso-PGF2a含量也降低?但均無明顯差異。接塵組與正常對照組相比，Nrf2、T-AOC和LPO含量明顯升高(7.812'30.931'51.064-P=0.020'0.000'0.000)而HO-1和8-iso-PGF2a也升咼，但變化不明顯,見表2，圖1。表2壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化Tabei2ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswith

stageICWP,— - 8-iso-PGF2a組別例數(shù)HO-l(ng/ml)Nrf2(ng/ml)T-AOC(u/ml) LPO(umol/l)(pg/ml)MQMQMQMQMQCWP組943.434.193.08*29.8254.886.243.77.接塵組4012.2416.693.896.24*8.764.75,44.9681.109.609.02*正常對照組338.3013.581.523.032.225.8639.8065.160.731.13X2值 2.657 8.809 34.075 2.705 55.462產(chǎn)值 0.265 0.012 0.000 0.259 0.000注:與接塵組比較■*P<0.05?尸<0.01?與正常對照組比較」尸<0,05■P<0.01不同接塵年限壹期CWP患者血清中HO-1、Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化接塵年限~25年、25~30年和30年~3組Kruskal-WallisH檢驗結(jié)果顯示-壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2ヽT-AOC'8-iso-PGF2a和しPO濃度均無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(？=2.024'3.769'1.216'1.671'2.530-P=0.363'0.152'0.544'0.434、0.282)-見表3，圖2。表3不同接塵年限壹期CWP患者血清中HO-1'Nrf2'T-AOC-8-iso-PGF2a和LPO含量變

化Tabei3ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstageICWPindustexposureyears組別例數(shù)HO-l(ng/ml)8-iso-PGF2aNrf2(ng/ml)T-AOC(u/ml)LPO(umol/l)(pg/ml)MQMQMQMQMQ~25年26 7.8416.292.176.165.004.4732.2084.796.153.4825?30年 26 9.7616.991.916.074.132.4435.5283.915.055.8730年?39 7.686.231.662.364.193.2026.1340.446.494.53x2值 2.0243.7691.2161.6712.530P值 0.3630.1520.5440.4340.282壹期CWP并發(fā)肺部疾病組與單純壹期CWP組血清中HO-1'Nrf2ヽT-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化壹期CWP并發(fā)肺部疾病組與單純壹期CWP組Kruskal-WallisH檢驗結(jié)果顯示，HO-1、Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO血清含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(メ=1.940'1.864'4.356'1.290'3.498-P=0.379'0.394'0.113'0.525'0,174)?見表4、圖3。表4壹期CWP并發(fā)肺部疾病組與單純壹期CWP組血清中HO-1'Nrf2、T-AOC'8-iso-

PGF2a和LPO含量變化Tabei4ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswith

stageICWPwithcomplication例8-iso-PGF2a組別數(shù)HO-l(ng/ml)Nrf2(ng/ml)T-AOC(u/ml)(pg/ml)LPO(umol/l)MQMQMQMQMQCWP并發(fā)慢性阻塞性肺疾病組156.756.921.422.844.195.1821.7938.766.303.22表4(續(xù))組別例數(shù)HO-l(ngZml)Nrf2(ng/ml)T-AOC(u/ml)8-iso-PGF2a(pg/ml)LPO(umol/l)MQMQMQMQMQCWP并發(fā)肺氣腫組598.854.693.7035.6861.067.103.81單純CWP組92.313.702.2827.1138.395.495.26X2值1.9401.8644.3561.2903.498「值0.3790.3940.1130.5250.174壹期CWP吸煙與非吸煙患者血清中H0-1、Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化壹期CWP吸煙與非吸煙患者兩組之間進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗，結(jié)果顯示，兩組CWP患者血清中HO-1'NH2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量無顯著性差異(Z=-0.990'-1.216'-0.315'-1.333、-0.969-P=0.322'0.224、0.753'0.182'0,332)?見表5、圖4。表5壹期CWP吸煙患者血清中HO-1'Nrf2ヽT-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量變化Tabei5ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2cxandLPOinsmokingpatientswithstageICWP組別例HO-l(ng/ml)Nrf2(ng/ml)T-AOC(uZml)8-iso-PGF2aLPO(umol/l)數(shù)(pg/ml)M QM QM QM QM Q吸煙組547.54 6.691.66 2.754.32 3.4226.2345.996.186.10非吸煙組3710.5513.242.48 4.274.07 2.7141.4670.246.303.19Z值-0.990-1.216?0.315-1.333-0.969「值0.3220.2240.7530.1820.332壹期CWP飲酒與非飲酒患者血清HO-1、Nrf2'T-AOC、8-iso-PG