葉綠素的提取、分離、理化性質(zhì)及含量測定課件

葉綠體色素的提取、分離、理化性質(zhì)鑒定及含量測定

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模悍治鲂@中兩種植物材料葉綠體色素的差異內(nèi)容：①葉綠素a和b含量差異；②綠色素與黃色素的含量差異色素提取分離的原理;葉綠素測定的方法及其原理；綠色素與黃色素的純化原理及步驟；葉綠素的理化性質(zhì)的鑒定方法實(shí)驗(yàn)原理

Thermosynechococcuselongatus(藍(lán)細(xì)菌)PSIPSII光合色素的脂溶性-----酒精、丙酮等有機(jī)溶劑提取Chl是雙羧酸的酯---皂化反應(yīng)---葉綠素與類胡蘿卜素分離Chl的取代反應(yīng)：卟啉環(huán)中的Mg2+可被H2+、Cu2+、Zn2+取代光學(xué)特性：ChlaChlb有兩個強(qiáng)吸收峰----含量測定時選擇葉綠素特有的紅光吸收峰波長；第二單線態(tài)10-12S第一單線態(tài)10-9S基態(tài)能量三線態(tài)10-3~10-2S分子內(nèi)能量傳遞傳向反應(yīng)中心吸收430nm光吸收670nm光680nm熒光熱能熱能熱能磷光Chl的熒光和磷光現(xiàn)象----反射光中能觀察到呈紅色的熒光；葉綠素化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，光容易受強(qiáng)光的破壞葉綠素a和b含量的測定方法—分光光度法根據(jù)Lambert-Beer定律：OD1=Ca·ka1+Cb·kb1（1）OD2=Ca·ka2+Cb·kb2

（2）

Ca=12.7OD663-2.69OD645（3）Cb=22.9OD645-4.68OD663（4）CT=Ca+Cb=8.02OD663+20.21OD645

（5）

Ck=4.7OD440-0.27Ca+b實(shí)驗(yàn)材料和器材實(shí)驗(yàn)材料：（兩組組合，每組做一種植物材料，最后兩組結(jié)果放在一起分析）器材：721型分光光度計(jì)、電子天平、量筒、研缽、剪刀、漏斗、濾紙、移液管（1mL）、試管及試管架、洗耳球、酒精燈等。試劑：丙酮、80%丙酮、醋酸酮、5%鹽酸、碳酸鈣、石英砂等實(shí)驗(yàn)步驟取20ml色素提取液加到盛有20ml乙醚的分液漏斗中，搖動綠色素與黃色素的分離沿漏斗邊緣加入30ml蒸餾水，輕輕搖動分液漏斗，靜止10分鐘，溶液即分為兩層。棄去下層水相；再用蒸餾水沖洗乙醚溶液1次，棄去下層水相。加入8ml30％KOH甲醇過飽和溶液，用力搖動分液漏斗5分鐘以上，皂化要徹底，直至顏色變?yōu)樽睾稚?/p>

靜置約10min加蒸餾水約10ml，搖動后靜置分離，則得到黃色素層和綠色素層

分別收集并保存于試管中

5觀察色素溶液的吸收光譜

(1)調(diào)節(jié)分光計(jì)，觀察電燈光的光譜；(2)觀察色素丙酮提取液，用丙酮將溶液稀釋1倍比較之；(3)觀察黃色素乙醚溶液，用乙醚將溶液稀釋1倍比較之；(4)觀察皂化葉綠素甲醇溶液，用甲醇將溶液稀釋1倍比較之；（今天選擇做）(5)觀察銅代葉綠素溶液。（今天選擇做）實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟葉綠素a和b的測定鮮葉0.5g，加丙酮5ml及少許碳酸鈣和石英砂，勻漿，將勻漿轉(zhuǎn)入量筒中，并用適量80%丙酮洗滌研缽，用80%丙酮定容至10ml

吸取2.5ml加入有10ml80%丙酮的量筒中，過濾，濾液備用取上述色素提取液4ml，以80%丙酮為對照，分別測定663nm、645nm和440nm處的光密度值。

按公式（3）、（4）、（5）分別計(jì)算色素提取液中葉綠素a、葉綠素b、及葉綠素a+b的濃度，類胡蘿卜素濃度。再根據(jù)稀釋倍數(shù)分別計(jì)算每g鮮重葉片中色素的含量。

注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中注意安全，石油醚、丙酮等試劑要遠(yuǎn)離火源。尤其注意做銅代反應(yīng)時避免傷人。研磨過程中丙酮要少量多次加入，以免研