生物制藥專業(yè)綜合試驗講解

生物技術(shù)制藥實驗課程實習 講義人表皮生長因子（hEGF）在大腸桿菌中的表達與純化生物與制藥工程學院 制2016年6月2日目錄TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"第一節(jié)引言 2\o"CurrentDocument"表皮生長因子（EGF）概述 2\o"CurrentDocument"表皮生長因子（EGF）的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 2\o"CurrentDocument"EGF的生物學效應及應用 3\o"CurrentDocument"本實驗課程設計的目的與內(nèi)容 4\o"CurrentDocument"第二節(jié)EGF基因的合成與轉(zhuǎn)化表達 5.實驗原理 5.實驗材料與方法 5實驗材料及儀器 5試劑材料及試劑 5\o"CurrentDocument"儀器設備 6實驗方法 6試劑及培養(yǎng)基配制方法 6\o"CurrentDocument"目的基因hEGF的設計與合成 7\o"CurrentDocument"電泳檢測質(zhì)粒DNA 8\o"CurrentDocument"大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備 8\o"CurrentDocument"轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒進感受態(tài)大腸桿菌 BL21（DE3） 9\o"CurrentDocument"檢測轉(zhuǎn)化是否成功 9\o"CurrentDocument"雙酶切并檢測 9\o"CurrentDocument"EGF基因的PCR擴增驗證 9\o"CurrentDocument"目的基因的誘導表達及基因表達產(chǎn)物的 SDS檢測 10\o"CurrentDocument"第三節(jié) EGF表達蛋白的純化與檢測 15實驗原理 15可溶性6xHis重組蛋白純化實驗方法 156xHis重組蛋白包涵體純化與復性 17第一節(jié)引言表皮生長因子（EGF）概述生長因子在人體中的信號傳導部分起著關(guān)鍵的作用，它可通過與細胞表面的蛋白質(zhì)受體結(jié)合，參與細胞的各種生命活動。生長因子可以是維生素，堿基，多肽等。所研究的表皮生長因子（Epidemalgrowthfactor,EGF）,就是一種人機體細胞合成的一種多肽。在生物體內(nèi)，每個細胞的生長狀態(tài)不同，在不同組織中的細胞的表皮生長因子參與生長、增值、死亡等過程。目前，表皮生長因子已得到廣泛應用。在許多公司已經(jīng)開始研發(fā)甚至是生產(chǎn)出EGF,多種疾病的誘發(fā)原因很多，我們可以用EGF來進行詳細的診斷。之后致病的查出原因，給病人減少心理的壓力，帶來一線生機。在經(jīng)過強烈的光刺激后，尤其是激光，人們的眼部會有很大的損傷，最嚴重的就是眼角膜損傷，無法修復。人體在經(jīng)過紫外線的照射下皮膚的損傷以及高溫、蒸氣、火等造成的皮膚大面積與原來的不一樣的皮膚。對于這些傷害，我們可使用含有可促進人體表皮細胞的新陳代謝EGF的藥膏或者是化妝品，使皮膚變得如初［1］。在最早研究表皮生長因子的時候就只是證明是多肽，還沒有命名。是由Cohen在1960年，在提取神經(jīng)生長因子時，意外發(fā)現(xiàn)除此種物質(zhì)以外的一種多肽［2］。多個科學家對其充滿好奇心，在之后的十年內(nèi)，Savage真正的研究清楚，命名此種多肽為表皮生長因子［3］。表皮生長因子（EGF）的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)不同的生物中，表皮生長因子的蛋白一級結(jié)構(gòu)不同。研究表明家族成員一般在多于50個氨基酸，而少于80個氨基酸，與我們所熟悉的胰島素一樣，表皮生長因子是由前體加工成的成熟的多肽，在具有生物活性［4］o如人體中的表皮生長因子是由53個氨基酸組成［5］。整個hEGF分子由兩個結(jié)構(gòu)域組成。殘基1?33,形成N一端結(jié)構(gòu)域；34?53為C一端結(jié)構(gòu)域；成熟hEGF的序列位于單鏈多肽的C一末端附近，由53個氨基酸殘基組成，并且其C一端和N一端分別由Arg/Asp/Arg/His鄰接，故成熟的EGF分子，可以經(jīng)專一性Arg內(nèi)肽酶的作用，從前體釋放［6］。二級結(jié)構(gòu)上存在著反平行B片層結(jié)構(gòu)是EGF骨架的常見結(jié)構(gòu)，N一端和C一端在整個三維結(jié)構(gòu)中不會發(fā)生什么變動，維持此結(jié)構(gòu)的是由三個二硫鍵 [7]（由于6個半胱氨酸的存在），因此分子在一定的條件下生物活性表現(xiàn)頑強”網(wǎng)。我們知道同一種酶在不同的生物中有不同的生物效應，同時不同的酶在不同的生物中會有相同的生物效應，hEGF也會有此種現(xiàn)象。hEGF-B和hEGF-丫是hEGF的兩種形式，在分子結(jié)構(gòu)和同源性中相似度高，在蛋白中一級結(jié)構(gòu)中即使是在 C末端的某個位置上僅僅只有一個Arg的差別，當它們作用于不同細胞中的同一個受體，在生物體中的作用是一樣的[9]。與許多古細菌中的酶一樣如生活在溫泉中古細菌，人體表皮生長因子在 100c煮沸達到30min,仍然能保持結(jié)構(gòu)、活性等穩(wěn)定性；許多蛋白質(zhì)在具有強列的催化效率的酶如胰蛋白酶作用下肽鏈被斷掉，而表皮生長因子耐它的消化 [10]0EGF在狹小的活性微環(huán)境中，由于常見的丙氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸 [11]會提供作用基團，表皮生長因子才能與受體結(jié)合反應。多肽具有 N端和C端，有的在生物活性中不起作用，有的是至少有一段起作用，據(jù)研究表明，表皮生長因子結(jié)構(gòu)的兩端在細胞的生長中都很重要。EGF的生物學效應及應用細胞通過在信號傳導的過程中有多種方式包括直接或間接的接觸。自分泌或旁分泌是hEGF作用的方式，在生物體內(nèi)它亦可以與其他的因子結(jié)合作用于細胞。EGF生物效應很多，如下所述：.來源于人體的不同種組織的上皮細胞為了適應人體的需要， 從基因上賦予它很高分裂效率。EGF在其中起著關(guān)鍵性的作用。首先人體的皮膚表層會產(chǎn)生脫皮現(xiàn)象，證明有大量的細胞死亡。同樣，皮膚的表面受到傷害在愈合的過程會結(jié)痂，新的皮膚又長出來了。EGF在創(chuàng)傷修復中起著功不可沒的作用，在肝臟、腸道、角膜、胃等多種組織創(chuàng)傷的恢復的試驗研究 [12]取得重大的突破，在臨床上已經(jīng)運用于燒傷、燙傷、創(chuàng)傷及外科手術(shù)傷口的愈合，使病人的痛苦少一點。.眼睛是我們重要的部分，眼睛的部分受到傷害特別是眼角膜，是我們最擔心的。在現(xiàn)實生活中，很多病人由于眼角膜的傷害再加上眼角膜的捐獻者少之又少無法得到修復。實驗研究結(jié)果表明，適宜濃度的 hEGF滴眼液，能通過刺激角膜上皮細胞及基質(zhì)成纖維細胞的增生與遷移和促進細胞外基質(zhì)與膠原纖維增生，使損傷修復速度加快，從而輔助修復角膜［13］o.研究表明，多數(shù)月中瘤的發(fā)生、發(fā)展，與EGF之間存在一定的關(guān)系。細胞中存在原癌基因和抑癌基因，癌變可能由于這些基因的突變細胞，使細胞生長不受控制。月中瘤細胞表面的EGF受體屬于多聚體受體，多個EGF的表達之后與受體結(jié)合，使細胞不停的生長，這樣，與胃癌、乳腺瘤、黑色素瘤的惡性程度增加叫.是藥三分毒，我們吃的要中有些藥對人的胃刺激很大。實驗表明：在人的胃潰瘍中受損傷的細胞與保護藥硫酸鋁相結(jié)合，可以使?jié)冇休^高濃度的內(nèi)源性EGF表達，從而促進潰瘍愈合［15］。1.4本實驗課程設計的目的與內(nèi)容.實驗課程設計目的：本實驗課程設計重在學生自己動手設計實驗，老師起輔助指導作用，旨在訓練學生對專業(yè)綜合知識的運用。學生需查閱文獻和數(shù)據(jù)庫來設計與理解設計方案，主要考察學生對基因分子克隆、表達、發(fā)酵和蛋白分離知識的理解與應用，以培養(yǎng)學生的專業(yè)綜合知識應用與實驗動手操作能力。2.實驗課程設計內(nèi)容：以表皮生長因子(EGF)為例，讓學生從基因的設計入手，合成出完整的EGF基因，然后表達并純化出該EGF蛋白。主要內(nèi)容簡述如下：(1)通過NCBI數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站設計出完整的EGF基因，并設計出引物；(2)pET-28a衍生質(zhì)粒為載體、將EGF基因轉(zhuǎn)化如大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌中,并通過雙酶切和PCR挑選驗證轉(zhuǎn)化子；(3)誘導重組大腸桿菌表達hEGF蛋白；(4)經(jīng)超聲破碎提取、SDS電泳檢測(5)采用鍥柱純化，進而獲取hEGF蛋白純品。

第二節(jié)EGF基因的合成與轉(zhuǎn)化表達1.實驗原理人源表皮生長因子（hEGF）來源大致有三個方向：一是來源于人體代謝物的提??；二是來源于化學合成；三是來源于基因工程生產(chǎn)技術(shù)，這也是近些年來可以大量生產(chǎn)獲得hEGF的方法。前兩種方式得到的產(chǎn)品都只有很低的純度，并不能在實際應用中發(fā)揮很大的價值o0目前已知的研究中，hEGF基因在大腸桿菌、枯草芽抱桿菌和酵母以及動植物等宿主系統(tǒng)中已經(jīng)成功克隆表達。以pET等衍生質(zhì)粒為載體、以BL21（DE3）為表達宿主菌的表達系統(tǒng)是發(fā)展較成熟的大腸桿菌表達系統(tǒng)之一 ，它采用T7強啟動子，在IPTG誘導下，啟動外源基因的高轉(zhuǎn)錄。pET載體有pET32a（力母液、PET-28a菌種、E.coliDE3菌種、酒精、含質(zhì)粒載體的PET-28a菌液、小型質(zhì)粒快速提取試齊I」盒（離心柱型）、Goldview、BIOWESTAGAROSE、loadingbuffer（6的、HindmDNAMarker、TAE電泳緩沖液（1X）、0.1mol/LCaCl2溶液、ZdeI酶（10U/4及其10XBuffer、Xhol酶（10U/。及其BufferD10X、GenClean柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、5U/lTaqDNA聚合酶、PCR緩沖液（10X,含Mgcl2）、dNTP混合物、上游引物、下游引物、無菌雙蒸水、1mol/l的異內(nèi)基硫代半乳糖甘（TPTG）、PBS（1X）、SDS蛋白凝膠配制試劑盒：30%Acr-Bis（29:1）、1.5MTris-Hcl,pH8.8、10%SDS、10%過硫酸?。ˋP）溶液、TEMED、1MTris-Hcl,pH6.8;2>±樣緩沖液、1XTris-甘氨酸電泳緩沖液、考馬斯亮藍染色液、脫色液I（45%甲醇：10%乙酸：45%蒸儲水）、脫色液II（5%甲醇：7%乙酸：88%蒸儲水），雙蒸水和pET28a和pET28a（力等系列。下圖1為PET28a質(zhì)粒載體的物理圖譜。MlH)MiOEIIBff-I4ndIlir^3)盾8Ml￡i?EiMinHI41M)□eiiliB?3-處所RpulltK2l|M)J--KM143331BUII4QIRSq-A.I442^\_-Spll110HMhehteh-國工卬MlH)MiOEIIBff-I4ndIlir^3)盾8Ml￡i?EiMinHI41M)□eiiliB?3-處所RpulltK2l|M)J--KM143331BUII4QIRSq-A.I442^\_-Spll110HMhehteh-國工卬H?聯(lián)制*///cClfiiJI:、IUlH3-|I1前EM'€?fr7印？r\￡]pB.vaflII1A.UMpaHiAMiJI]貨■孫二3SSSICMJTi--廣BUILU11hmi-- .工SpWC0￥，-..BernnJTEilllg的10||)下■ReiIi2?hi叱mH凹i圖1PET28a質(zhì)粒載體2.實驗材料與方法實驗材料及儀器試劑材料及試劑瓊脂粉、NaCl、蛋白月東、酵母浸粉、1mol/LNaOH溶液、雙蒸水、10mg/mlKana2.1.2儀器設備試管、量筒、天平、藥匙、稱量紙、培養(yǎng)皿、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫生化培養(yǎng)箱、涂棒、接種環(huán)、酒精燈、pH試紙、記號筆、麻純、棉花、報紙、銀子、滴管、10ml移液管、恒溫搖床、Eppendorf管、微量移液器、槍頭、高速離心機、電泳儀、電泳槽、水平凝膠電泳槽和梳子以及其制膠模塊、250ml錐形瓶、微波爐、凝膠成像系統(tǒng)、分光光度計、制冰機、冰盒、恒溫水浴鍋、超凈工作臺、水漂、0.2mlPCR微量管、雙面微量離心管架、PCR儀、紫外檢測儀、脫色搖床、臺式冷凍離心機、垂直電泳槽及配套的玻璃和密封條、梳子、1.5ml微量離心管、搪瓷盤2.2實驗方法試劑及培養(yǎng)基配制方法.卡那霉素母液（10mg/mL）的配制：稱取10mg卡那霉素溶解于1ml無菌水中，然后采用無菌過濾器過濾后分裝于 Eppendorf小管中。.培養(yǎng)基的配制LB培養(yǎng)基:配方（固體培養(yǎng)基加瓊脂粉）1000ml 150ml蛋白陳10g1.5g酵母浸粉5g0.75gNaCl10g1.5g瓊脂粉18g2.7g(2)去離子水950mL142.5mL含卡那霉素(Kana)LB固體培養(yǎng)基：將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60C左右，加入Kana儲存液，使終濃度為50聞/ml,搖勻后鋪板。(3)含Kana的LB液體培養(yǎng)基：每15mLLB液體培養(yǎng)基分裝至試管中，高壓滅菌后冷卻至60C左右，加入Kana母液，使終濃度為50聞/ml)目的基因hEGF的設計與合成hEGF的cDNA序列自NCBI上查閱文獻得到其編號(NM_001963.2)[21],在NCBI的數(shù)據(jù)庫中查獲其序列為：5'-aatagtgactctgaatgtcccctgtcccacgatgggtactgcctccatgatggtgtgtgcatgtataTtgaagcattggacaagtatgcatgcaactgtgttgttggcracatcggggagcgatgtcagtaccgagacctgaagtggtgggaactgcgc-3J根據(jù)其序列和限制性酶切位點XhoI和NdeI引入其上下游引物分別為：F:5'-AGTGACTCTCAATGTCCC-3';R:5'-TTCCCACCACTTCAGGTCTC-3'。委托上海捷瑞生物工程有限責任公司合成目的基因hEGF序列，并將其插入到質(zhì)粒載體PET28a的限制性酶切位點XhoI和NdeI之間。公司將含有目的基因序列的重組質(zhì)粒PET28a-hEGF保存在穿刺菌細胞XL10中寄回。提取重組質(zhì)粒(1)在滅菌后的無菌操作臺中，取15ml分裝至試管中的、滅菌后的LB液體培養(yǎng)基，加入卡那霉素母液150山，保證它在培養(yǎng)基中為50聞/mL。(2)將含目的基因的重組質(zhì)粒的穿刺菌 XL10接種無菌LB培養(yǎng)基(含50(J/mL卡那霉素)，37C搖床過夜培養(yǎng)(不能超過15h)。(3)取收取的2ml的菌液于2mlEp管中，用于提取質(zhì)粒。(4)提取質(zhì)粒，按質(zhì)粒小量制備試劑盒操作說明書操作。電泳檢測質(zhì)粒DNA(1)稱取0.3g瓊脂粉BIOWESTAGAROSE,放入三角瓶中，加入30mlTAE電泳緩沖液(1X),制成1%的膠，在微波爐中燒開。(2)待徹底熔化后，停止加熱。(3)取出三角瓶，自然冷卻至不燙手，加入1.7&oldview染液。(4)插入梳子后緩緩倒入膠液，至模具的矮邊緣即可，平放等待徹底凝固。(5)在電泳槽里加滿1>TAE緩沖液，調(diào)電壓至140V(10V/cm)。(6)膠全凝固后，小心拔出梳子，放入電泳槽中，凝膠要沒入緩沖液中。⑺在塑料片上，點5d(6X)loadingbuffer,再加入1d上述質(zhì)粒DNA提取產(chǎn)物，混合均勻。(8)在凝膠上選擇相鄰的加樣孔，用吸液頭分別將管中的樣品和 DNAMarker加入凝膠的加樣孔中。(9)打開電源，樣品以藍色的橫帶泳動，電泳約30min。(10)當藍色泳動到凝膠邊緣1cm時，關(guān)掉電源。取出模具和凝膠放入成像系統(tǒng)中，觀察結(jié)果圖，并保存。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(1)宿主菌的培養(yǎng)挑取新活化的E.coliBL21(DE3)單菌落，接種于4mlLB液體培養(yǎng)基中,37C下恒溫發(fā)酵培養(yǎng)12小時左右，直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液1ml接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37C搖床培養(yǎng)3?4小時至OD590=0.4?0.5左右。(2)制備感受態(tài)細胞(CaCl2法)I、將發(fā)酵后的菌液轉(zhuǎn)入2mL預冷、無菌的離心管中，冰置10分鐘4c5000rmp離心10分鐘。H、棄去上清，用預冷的0.1mol/L的CaCl2溶液1ml輕輕懸浮細胞，冰置30分鐘后,4C,5000rmp,10分鐘離心。田、棄去上清，加入1ml預冷0.1mol/L的CaCl2溶液,輕輕懸浮細胞，冰上放置30分鐘。IV、在離心機中4c下5000rmp離心10分鐘，保留沉淀，200仙L預冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重新懸浮，無菌操作臺中將其分裝成 100艮L的小份，在冰上放置2小時以上，便可直接用作宿主菌的轉(zhuǎn)化實驗。轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒進感受態(tài)大腸桿菌 BL21(DE3)I、在超凈工作臺上，取上述感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)菌液，加入PET28a質(zhì)粒DNA溶液5仙l輕輕搖勻，置于冰上放30分鐘.H、在42c水浴鍋中熱擊90s迅速在冰上冷卻5分鐘。田、往試管中加入1mlLB液體培養(yǎng)基(不含kan),37c搖床發(fā)酵1小時。IV、將上述菌液搖勻后取100pL涂布于含Kan的固體LB平板上，正面朝上上放置半小時到一個小時待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37C條件恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24小時。設置對照：以相同體積的無菌雙蒸水代替質(zhì)粒樣品溶液，其它操作與上述相同。此對照正常情況下應無菌落出現(xiàn)。檢測轉(zhuǎn)化是否成功提取轉(zhuǎn)化后大腸桿菌的質(zhì)粒并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測： 參見前面質(zhì)粒提取以及瓊脂糖凝膠電泳檢測的方法。將兩次提取的質(zhì)粒在同一塊凝膠中電泳，對比其電泳條帶。雙酶切弁檢測(1)先準備一個冰盒并放入一定量的冰塊。從-20C冰柜中取出限制性內(nèi)切酶，立即插入冰塊中。(2)用20d的反應體系進行雙酶切： 無菌雙蒸水14小10XHBuffer2l、pBSA1pl質(zhì)粒1M混勻，限制性內(nèi)切酶XhoI、NdeI各1d。(3)混勻離心管使管中的溶液。在離心機中5000rpm離心30秒。取出后插到水漂的孔中，37.C水浴酶切2h0(4)酶切后取酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(方法參照上述)，制1.5%的瓊脂糖凝膠，電泳以確認切下的片斷是否為自己想要的片斷。EGF基因的PCR擴增驗證取無菌的0.2mlPCR管，置于冰中，在其中添加如下成分如表3:表3PCR反應體系TOC\o"1-5"\h\z無菌水 17pl10XPCR緩沖液（含Mgcl2 2.5jldNTP混合物 2pl上游引物 1M下游引物 1M待擴增DNA模板 1MTaqDNA聚合酶（5U/ ”） 0.50終體積 25M混勻后，稍作離心（如果利用非熱蓋型PCR儀器，應添加30d石蠟油于反應管中，防止樣品水分的蒸發(fā)）[17]o將反應管放入PCR儀，按下列條件設定反應程序，進行PCR反應，如表4:表4PCR反應過程94c預變性5min變性94C30s丁退火55C30s>循環(huán)25次延伸72C30s-最后在72C保溫10minPCR反應結(jié)束后，取5-10d反應液做電泳檢測，鑒定PCR反應產(chǎn)物是否存在，及其大小。電泳確認后，PCR產(chǎn)物即可用于下一步操作或冰箱保存。目的基因的誘導表達及基因表達產(chǎn)物的 SDS檢測目的基因的誘導表達重組菌的擴增：接種轉(zhuǎn)化了pET-28a-hEGF的EcoliDE3于含Kana（50g/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37C,200rpm,振蕩培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)接100L過夜培養(yǎng)物，于100mL的LB液體培養(yǎng)基，于37C,200rpm,振蕩培養(yǎng)至OD600值在0.7-1.0。從中取出1.0ml菌液，離心，棄去上清，40LPBS懸浮，備用于后面SDS電泳操作。重組菌外源基因的誘導表達：向擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入1000L0.1mol/LIPTG（至終濃度1mmol/L）,于37c振蕩培養(yǎng)3-4h。蛋白樣品的抽提：將誘導后菌液，4.0C,5000rpm/min,離心10min,棄去上清。將所得的菌體沉淀，用PBS溶液懸浮，并轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，向管中繼續(xù)加入PBS至適宜采用超聲破碎儀破碎為止，大約5ml。用移液器吹打，充分懸浮細胞后，將離心管放到盛有的冰塊的燒杯中。清洗并擦拭超聲破碎儀的金屬桿，然后將超聲破碎儀的金屬桿插入到離心管中，調(diào)整好位置，關(guān)上超聲破碎儀的門，打開電源，設置程序，開始對細菌經(jīng)行超聲破碎［17］。破碎設置：功率400W左右；工作2s；間隔8s；破碎時間10min。破碎處理后的細菌細胞，10000rpm/min離心10min。取出離心管，吸取上清液至新的離心管中，止匕即為所抽提的蛋白樣品，可用于后續(xù)操作［17］。把離心的沉淀用40山PBS懸浮，亦備用于后續(xù)SDS電泳操作。SDS電泳檢測.分別將未誘導前的菌體懸液、誘導破碎后的菌體上清和誘導破碎后的沉淀懸浮液分別和一部分過柱純化洗脫好的蛋白與 5>±樣緩沖液按4:1混勻于微量離心管中。.將上述四個微量離心管插入水漂，沸水中煮 5min。然后立即插入冰中。樣品冷卻到室溫，5000rmp離心5min。.按要求組裝電泳裝置，并驗漏。.配制分離膠及濃縮膠：根據(jù)目的蛋白的分子量大小，選擇合適的凝膠濃度。不同濃度的SDS分離膠的最佳分離范圍，如表5:SDS分離膠，如表6:配制12%分離膠，按順序和量（注意體積單位?。┤∠铝腥芤?，在50ml的小燒杯中混合（注意Tris為pH8.8）。蛋白質(zhì)分子量范圍（KD）適宜的凝膠濃度（%）TOC\o"1-5"\h\z>100 830-100 1010-30 12<10 15表5SDS分離膠的最佳分離范圍體系組成 體積雙蒸水 3.330%Acr-Bis(29:1)(ml) 4.01.5MTris-Hcl,pH8.8(ml) 2.510%SDS(ml) 0.110%過硫酸俊(AP)溶液(ml) 0.1TEMED(山) 4總體積(山) 10表6SDS分離膠反應體系體系組成 體積TOC\o"1-5"\h\z雙蒸水 230%Acr-Bis(29:1)(ml) 0.51.0MTris-Hcl,pH6.8(ml) 0.510%SDS(山) 4010%過硫酸俊(AP)溶液(山) 30TEMED(山) 4總體積(山) 3表7SDS濃縮膠體系加完試劑后，拿起燒杯輕輕晃動底部，將溶液混勻后，立即用1000小移液器，緩緩把膠液注入玻璃夾縫，每次余部分膠液于槍頭內(nèi)，以免產(chǎn)生氣泡。然后在上界面用200L移液器輕輕地沿玻璃壁均勻地加蒸儲水，從左到右，以免造成膠面不平整，兩液面的交界處呈波浪形，然后靜置30min。倒出蒸儲水，并倒置玻璃裝置，盡可能把水倒盡，然后用濾紙吸去殘留的水。（2）SDS濃縮膠：見表7。配制5%分離膠，按順序和量（注意體積單位?。┤∠铝腥芤海谝粋€50ml的小燒杯中混勻（注意Tris為pH6.8）。加完后，拿起燒杯輕輕晃動，將溶液混勻后，立刻用1000人移液器緩緩注入玻璃夾縫中，液面與玻璃上邊緣齊平。然后再慢慢插入梳子，靜置約20min。5.小心地垂直拔出梳子，用蒸儲水沖洗加樣孔2次，然后用濾紙吸干。電泳槽的上部倒?jié)M電泳緩沖液（約250ml,淹沒過加樣槽的液面），電泳槽的下部倒入一半電泳緩沖液（約180ml）“9】。.選取形態(tài)好的加樣孔，在一張空白紙上做好對應的標記，用微量移液器在靠邊緣的一個加樣槽中加入5L蛋白Marker,其它槽中加入30L自己制作的樣品。.接好電極，將電壓調(diào)至80V,待澳酚藍移到分離膠后，再調(diào)電壓至120V,電泳約2h0期間注意觀察電泳槽上部的電泳液是否有泄漏（泄漏導致液面下降，電流中斷）。當澳酚藍移到距底部<0.5cniM,切斷電源。8.在一個大的培養(yǎng)皿里，準備適量的考馬斯亮藍染液。 9.倒掉電泳槽中的電泳液，取下玻璃板,用刀片輕輕撬開，用刀片沿分離膠與濃縮膠的交接處，將分離膠切下，并在分離膠的左上角切掉一小角，以標記樣品順序1191o然后用水稍微沖一下玻璃板，戴手套用梳子小心地把分離膠從玻璃板上剝離到培養(yǎng)皿中，蓋上蓋，在脫色搖床上染色45min。10.染色后，將染液回收，以備重復使用。在培養(yǎng)皿中加脫色液I,搖床上脫色45min。倒掉脫色液I,更換為脫色液H，搖床上脫色45min<更換新的脫色液脫色搖床上脫色過夜，至大部分藍色褪盡。 11.觀察脫色后電泳膠中的藍色帶紋。對照、尋找異常粗的帶紋，并比較其分子量，判斷是否為預期目的基因的產(chǎn)物。第三節(jié)EGF表達蛋白的純化與檢測 鍥離子金屬螯合親和層析實驗原理金屬螯合親和層析(ImmobilizedMetal-ionAffinityChromatography),其純化原理是：組氨酸(His)的側(cè)鏈帶有1個咪晚基團，咪晚基團pKa值在6左右，在pH>7的條件下，咪晚基團帶負電，容易與Ni2+離子結(jié)合，尤其是帶有6個組氨酸(6xHis)標簽的重組蛋白對Ni2+離子具有極好的親和力。通過介質(zhì)固定Ni離子能夠選擇性地純化含有多個組氨酸的蛋白以及多肽；吸附在Ni2+離子上的蛋白可以使用咪唾進行競爭洗脫分離。常用于Ni2+離子金屬螯合親和層析的介質(zhì)為NTA(Nitilotriaceticacid)。鍥離子有六個螯合價位，NTA螯合了四價，剩余兩價與蛋白質(zhì)上的組氨酸結(jié)合(如下圖所示)?？扇苄?xHis重組蛋白純化實驗方法緩沖液配制（使用0.45小睡器過濾）.緩沖液A（平衡緩沖液）：1L20mMNa2HPO4.2H2O 3.56g500mMNaCl 29.2g20mMImidazole 2.04g用HCl（6M）調(diào)節(jié)pH至7.4,定容至1L。.緩沖液B（洗脫緩沖液）：0.5L20mMNa2HPO4.2H2O 1.78g500mMNaCl 14.6g500mMImidazole 17.02g用HCl（6M）調(diào)節(jié)pH至7.4,定容至0.5L。樣品制備.菌體收集：5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體，棄上精液；.菌體重懸：加入10-20ml的緩沖液A（每升培養(yǎng)液約加15ml）,通過震蕩充分懸浮細胞；.超聲波破碎：將細胞混懸液置于一個合適的小燒杯（也可用其它合適的器皿）中，在冰上超聲波破碎（約500W,破2s停2s,總時長15分鐘）；.菌體破碎后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集上精液（棄沉淀），使用0.45仙m濾器過濾后用于鍥柱純化（取10'樣品用千之后的SDS檢測）。Ni-NTA預裝柱純化6xHis重組蛋白.取一根Ni-NTA預裝柱（1ml）,分別用10ml三蒸水和10ml緩沖液A洗滌柱子，流速為1-2ml/min；.將過濾好的細胞上精液以0.5ml/min流速上樣到鍥柱中（期間，取10口穿柱液樣品用于之后的SDS檢測）;.用15ml緩沖液A洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min；.用5ml緩沖液B洗脫重組蛋白，流速1ml/min,1ml/管收集洗脫液（將每個收集管編管并每管取10I樣品用干之后的SDS檢測）；

.用5ml緩沖液A再次洗滌柱子.用5ml三蒸水洗滌柱子；.用2ml20%乙醇洗滌柱子，封閉，以備下次使用。注：此方法是通用的方法，但是未必能得到較好的純化效果，可選擇使用咪唾濃度梯度進行洗脫（如分別含有50mM,100mM,300mM,500mM咪唾的緩沖液B）或者使用？KTA蛋白純化系統(tǒng)進行更為精確的梯度洗脫。SDS檢測純化效果配制10-15%的SDS對上述收集的樣品進行檢測；根據(jù)檢測結(jié)果，將重組蛋白純度和濃度較高的收集管中的樣品標記保存。6xHis重組蛋白包涵體純化與復性某些重組蛋白在表達的過程中由于缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵（一級結(jié)構(gòu)正確，高級結(jié)構(gòu)錯誤），從而水不溶性且致密地集聚在細胞內(nèi)，這種形式稱為包涵體（InclusionBodies,IB）。包涵體主要含有重組蛋白，但同時含有一些細菌成分，如核糖體元件、 RNA聚合酶、外膜蛋白、質(zhì)粒DNA、以及脂體、脂多糖等。較強的變性劑如尿素（8M）、鹽酸月瓜（GdnHCl6M）通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種次級鍵， 使多肽伸展而溶于水中。如果重組蛋白是以包涵體的形式表達，則將包涵體變性溶解后（加入>=6M鹽酸月瓜或>=8M尿素）進行鍥離子金屬螯合親和純化。此純化過程與可溶性6xHis重組蛋白的純化方法相同，只是在緩沖液A和B中都加入同樣濃度的變性劑（6M鹽酸月瓜或8M尿素）。要得到有活性的重組蛋白，必須對純化得到的變性重組蛋白進行復性，但復性過程的收率往往很低。一般說來，蛋白質(zhì)的復性效率在20%左右。包涵體的純化通常包括包涵體的分離、洗滌、溶解、鍥柱親和純化以及蛋白質(zhì)復性等步驟（注：也可在變復性之后進行親和純化）。緩沖液配制（使用0.45小屣器過濾）①.包涵體洗滌緩沖液:100ml20mMNa20mMNa2HPO4.2H2O0.356g500mMNaCl500mMNaClTOC\o"1-5"\h\z2M尿素 12g1mMEDTA 0.03gTritonX-100（2%） 2ml用HCl（6M）調(diào)節(jié)pH至7.4,定容至100ml。②.變性緩沖液A（平衡緩沖液，也作為包涵體溶解緩沖液）：100ml20mMNa2HPO4.2H2O 0.356g500mMNaCl 2.92 g20mMImidazole 0.2 g8M尿素 48g用HCl（6M）調(diào)節(jié)pH至7.4,定容至100ml③.變性緩沖液B（洗脫緩沖液）：50ml20mMNa2HPO42H2O 0.178g500mMNaCl 1.46g500mMImidazole 1.7g8M尿素 24g用HCl（6M）調(diào)節(jié)pH至7.4,定容至50ml。包涵體的分離、洗滌、溶解.菌體收集：5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集細胞，棄上清；.菌體重懸：加入10-20ml的包涵體洗滌緩沖液（每升培養(yǎng)液約加15ml）,通過震蕩充分懸浮細胞；.超聲波破碎：將細胞混懸液置于一個合適的小燒杯（也可用其它器皿）中，在冰上超聲波破碎（約500W,破2s停2s,總時長15分鐘）；.菌體破碎后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集沉淀（棄上清液，沉淀為包涵體）；.包涵體的洗滌：加入10-20ml的包涵體洗滌緩沖液震蕩重懸包涵體，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集沉淀（棄上