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享廷頓蛋白結(jié)合蛋白1對胰島p細胞胰島素分泌和L型鈣通道Cav1.2胞內(nèi)運輸?shù)挠绊懞嗤㈩D蛋白結(jié)合蛋白1(huntingtin-associatedprotein1,HAP1) 是最早發(fā)現(xiàn)的能與亨廷頓病(Huntington'sdisease,HD)基因產(chǎn)物亨廷頓蛋白(huntingtin,Htt)相互結(jié)合的蛋白質(zhì)。HAP1具有HAP1A和HAP1B兩種剪接體，既在神經(jīng)元中表達，也在分泌含氮激素激內(nèi)分泌細胞中表達。在神經(jīng)元內(nèi),HAP1參與細胞器和分子的運輸、膜受體轉(zhuǎn)運與再循環(huán)。 HAP1可通過與驅(qū)動蛋白(kinesin)輕鏈(KLC)和重鏈(KHC)、驅(qū)動蛋白家族運動蛋白5(KIF5)、動力蛋白激活蛋白復(fù)合物的亞單位P150Glued等微管相關(guān)運動蛋白相互作用，參與或調(diào)控神經(jīng)元內(nèi)囊泡、神經(jīng)營養(yǎng)因子、受體等基于微管的運輸。HAP1的胞內(nèi)運輸功能受自身磷酸化程度的影響，HAP1A羧基末端PKA磷酸化位點(T598)的磷酸化能顯著減少其與P150Glued和KLC的結(jié)合，抑制其參與的胞內(nèi)運輸活動，去磷酸化后則相反。HAP何能通過神經(jīng)元內(nèi)物質(zhì)運輸對神經(jīng)元的生長發(fā)育、存活、遞質(zhì)釋放起調(diào)節(jié)作用。在大鼠、小鼠胰島內(nèi)，HAP1選擇性表達于分泌胰島素的P細胞內(nèi)：MIN6.NIT-1、INS-1等胰島P細胞瘤細胞系也表達HAP1抑制MIN6和NIT-1細胞的HAP俵達能顯著抑制其胰島素的分泌；胰島P細胞HAP1選擇性敲除的小鼠，其糖耐量能力下降，葡萄糖刺激后的胰島素分泌減少。由此表明，HAP1與胰島P細胞胰島素的分泌有關(guān)。電位門控鈣通道(voltagegatedcalciumchennel,Cav)參與調(diào)控葡萄糖刺激引起的胰島P細胞胰島素的分泌，葡萄糖濃度的升高可促進P細胞對葡萄糖的攝入和代謝，增加ATP-ADM轉(zhuǎn)化和抑制K+1道活性，使細胞膜去極化并由此使Cav開放，大量鈣離子內(nèi)流最終引發(fā)胰島素的分泌。P細胞主要表達 Cav1.2和Cav1.3兩種亞型的L型鈣通道，其中Cav1.2在P細胞胰島素的分泌中發(fā)揮重要作用。Cav與多種離子通道一樣，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進行合成組裝后，以膜小泡的形式進入高爾基復(fù)合體進一步修飾加工形成囊泡，然后轉(zhuǎn)運至細胞膜，表達在細胞膜的特定區(qū)域。Cav的細胞膜表達量決定.Ca2+內(nèi)流的大小與動力學(xué)。HAP1是否通過影響鈣通道的胞內(nèi)運輸、細胞膜表達而影響胰島素的分泌，日前未見報道。有關(guān)調(diào)節(jié)鈣通道膜表達的機制研究表明，腫瘤抑制因子eIF3e（eukaryotictranslationinitiationfactor3subunitE）通過與Cav1.2的結(jié)合，調(diào)控神經(jīng)細胞和胰島P細胞內(nèi)Cavl.2的雙向運輸，即從胞質(zhì)向細胞膜的轉(zhuǎn)運（膜表達）和從細胞膜向胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運（內(nèi)在化’internalization），從而維持胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)。elF3e對Cav1.2通道蛋白的轉(zhuǎn)運和膜表達的調(diào)節(jié)作用提示HAP1可能通過與elF3e蛋白相互作用，調(diào)節(jié)胰島P細胞內(nèi)鈣通道的運輸，進而影響胰島素的分泌。本研究在進一步證實HAP1影響胰島p細胞胰島素分泌的基礎(chǔ)上，觀察了HAP1表達水平對？細胞Cav1.2活性、外鈣內(nèi)流、Cav1.2膜表達的影響，并分析了P細胞內(nèi)HAP1和eIF3e之間的相互作用。、HAP1促進胰島p細胞胰島素的分泌為了進一步證明HAP1對胰島p細胞胰島素分泌的調(diào)節(jié)作用，對HAP1基因敲除小鼠血漿胰島素含量和沉默HAP1對大鼠胰島p細胞瘤細胞INS-1細胞胰島素分泌能力的影響進行了檢測。放射免疫分析顯示，HAP1基因敲除小鼠血漿中胰島素含量明顯降低； 全細胞膜片鉗膜電容檢測顯示，與野生型和轉(zhuǎn)染表達對照質(zhì)粒的INS-1細胞比較，在轉(zhuǎn)染表達HAP1-SiRNA勺INS-1細胞中，無論是即刻釋放庫（immediatelyreleasablepool,IRP)分泌還是快速釋放庫(rapidiyreleasablepool,RRP)分泌均明顯降低；pHluorin是一種pH敏感熒光蛋白，將囊泡標(biāo)記蛋白VAMP2-pHluorin的表達質(zhì)粒與HAP1-SiRNA質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染INS-1細胞后，利用共聚焦活細胞動態(tài)成像技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，沉默HAP1表達后,INS-1細胞胰島素的囊泡分泌事件次數(shù)、分泌持續(xù)時間和分泌事件強度等均明顯減少。以上結(jié)果進一步證實了HAP1對胰島P細胞的胰島素分泌具有促進作用，抑制HAP1的表達可抑制胰島素的分泌。二、沉默HAP1導(dǎo)致P細胞L型鈣電流減小和外鈣內(nèi)流減少鈣離子內(nèi)流可引發(fā)和調(diào)控胰島素的分泌。為了探討HAP1是否通過影響胰島P細胞L型鈣通道和鈣離子內(nèi)流而影響胰島素的分泌，繼而檢測了沉默HAP1對INS-1細胞L型鈣電流和鈣離子內(nèi)流的影響。采用膜片鉗全細胞電壓鉗檢測技術(shù)，利用鋇離子替代鈣離子，記錄INS-1細胞L型鈣電流。INS-1細胞分別瞬轉(zhuǎn)HAP1沉默質(zhì)粒和對照質(zhì)粒，48h后分別記錄兩實驗組細胞L型鈣電流的變化。結(jié)果顯示,HAP1低表達后,INS-1細胞L型鈣電流明顯減小。進一步應(yīng)用Fura-2定量測定胞內(nèi)鈣技術(shù)檢測INS-1細胞胞內(nèi)鈣離子濃度顯示，高K+刺激條件下，野生型或轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的INS-1細胞內(nèi)鈣離子濃度迅速出現(xiàn)大幅度的上升，而轉(zhuǎn)染表達HAP1-SiRNA勺INS-1細胞在高K+刺激后只表現(xiàn)出一個小幅度的鈣離子濃度的提高。由此證明,HAP1可通過調(diào)節(jié)胰島P細胞L型鈣通道而影響其介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流，從而影響胰島素的分泌。三、沉默HAP1減少Cavl.2通道的膜表達鈣通道膜表達量是影響鈣電流和鈣離子濃度大小的因素之一。沉默HAP1后INS-1細胞的L型鈣電流和外鈣內(nèi)流都明顯下降提示，HAP1可能影響胰島P細胞L型鈣通道的膜表達。離子通道膜表達的多少一方面與其總的表達水平有關(guān)，另一方面與其從胞質(zhì)向膜上轉(zhuǎn)運有關(guān)。我們首先觀察了沉默HAP1對INS-1細胞Cav1.2的mRNA表達水平的影響。兩組INS-1細胞分別轉(zhuǎn)染HAP1沉默質(zhì)粒和對照質(zhì)粒，48h后用RT-PCF方法進行檢測,發(fā)現(xiàn)對照組和沉默組Cavl.2的mRN表達水平?jīng)]有明顯差異，由此證明HAP1對P細胞Cav1.2的表達無影響。為了探討HAP1是否通過影響鈣通道從胞質(zhì)向細胞膜的轉(zhuǎn)運而影響其膜表達，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)分析了HAP1對INS-1細胞Cavl.2通道囊泡膜轉(zhuǎn)運和膜表達的影響。將胞內(nèi)N末端連接有YFR胞外n區(qū)的S5和H5環(huán)處連接一個HA肽段的L型鈣通道融合蛋白YFP-Cav1.2-HA表達質(zhì)粒及其輔助亞基（P1b+a2S表達質(zhì)粒與HAP1-SiRNA￡粒或?qū)φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染INS-1細胞后，在不用TritonX-100處理條件下用HA抗體進行免疫熒光標(biāo)記顯示，沉默HAP1可顯著降低INS-1細胞膜上HA免疫熒光強度，表明HAP1參與了Cav1.2鈣通道蛋白的從胞質(zhì)向細胞膜的運輸。四、HAP1和elF3e兩個蛋白之間的相互作用為了探討HAP1通過對P細胞內(nèi)Cav1.2胞內(nèi)運輸具有調(diào)控作用的eIF3e影響p細胞內(nèi)Cav1.2膜表達的可能性，對HAP1與eIF3e之間的相互作用進行了分析。對INS-1細胞內(nèi)源性HAP1和eIF3e的免疫熒光雙標(biāo)檢測顯示,兩種蛋白在胞質(zhì)內(nèi)的定位分布完全相同。在HEK293細胞和INS-1細胞中，共轉(zhuǎn)染表達的eIF3e-CFP和HAP1A-YF除少量呈彌散分布外，大多呈現(xiàn)顆粒狀分布，并在顆粒中共定