基因工程概論和工具酶課件

基因工程學(xué)

GeneticEngineering醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所張利寧

ZhangLining(張利寧）1978-1983M.DShandongMedicalCollege(Medicine)1983-1986Master’sdegreeShandongMedicalUniversity(Immunology)1986-1995Assistantprofessor，ShandongMedicalUniversity1996-1999

Associateprofessor,ShandongMedicalUniversity1999-2000VisitingScholar,UniversityofKentucky

2001-2005Professor,ShandongUniversity2001-2004Ph.DShandongUniversity(Immunology)2004.4–2005.4Visitingscholar,ColumbiaUniversity2005.5-present

Professor,Director,InstituteofImmunology,SDUE-mail:Immuno@Tel/p>

第一章基因工程的發(fā)展與應(yīng)用

DevelopmentandApplications

ofGeneticEngineering

第一節(jié)基因工程發(fā)展的歷史背景

一、基因工程發(fā)展的關(guān)鍵性理論1．20世紀(jì)40年代，Avery和Griffith報(bào)道了肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化研究，首次證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA。2．20世紀(jì)50年代Watson和Crick提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型，從此為搞清生物遺傳物質(zhì)的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3．20世紀(jì)60年代Crick和Nirenberg等確定了遺傳信息的傳遞方式，即DNA-RNA-蛋白質(zhì)遺傳信息流的中心法則，破譯了氨基酸的64個遺傳密碼，編排了一本震驚世界的密碼字典，由此揭開了生物遺傳的謎底。

DNARNA蛋白質(zhì)

一、基因工程發(fā)展的關(guān)鍵性理論1．20世紀(jì)40年代，Avery和Griffith報(bào)道了肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化研究，首次證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA。2．20世紀(jì)50年代Watson和Crick提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型，從此為搞清生物遺傳物質(zhì)的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3．20世紀(jì)60年代Crick和Nirenberg等確定了遺傳信息的傳遞方式，即DNA-RNA-蛋白質(zhì)遺傳信息流的中心法則，破譯了氨基酸的64個遺傳密碼，編排了一本震驚世界的密碼字典，由此揭開了生物遺傳的謎底。

DNARNA蛋白質(zhì)

二、基因工程的三大技術(shù)發(fā)明

1．限制性內(nèi)切酶的分離與純化1970年Smith和Wilcox首次從嗜血流感桿菌中分離純化了限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease,RE）——HindIII限制性內(nèi)切酶：具有識別特定堿基序列并在特定位置切除外來DNA的酶2．逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)1970年Baltimore和Temin同時各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了中心法則

mRNADNARNAProtein

1972年，美國斯坦福大學(xué)的P.Berg首次實(shí)現(xiàn)DNA重組phageSV401980年獲諾貝爾化學(xué)獎

1973年Cohen和Boyer完成第一個基因工程實(shí)經(jīng)體外重組獲得雜合DNA雜合子轉(zhuǎn)化入大腸桿菌所需元件：限制性內(nèi)切酶連接酶載體受體細(xì)胞第二節(jié)基因工程的發(fā)展與應(yīng)用1982：第一個基因工程胰島素商品化1985：PCR技術(shù)問世（Mullis）1990.10正式啟動人類基因組計(jì)劃1997克隆羊多利誕生（Weilmos）2000.6.26完成人類基因組工作草圖繪制2003年4月完成人類基因組的測序，人類基因組計(jì)劃宣布完成2003年后后基因組時代二、基因工程的應(yīng)用1.基因工程在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用：除草、抗蟲、耐旱、提高農(nóng)作物的質(zhì)量2.基因工程在畜牧業(yè)上的應(yīng)用：提高動物的生長速度3.基因工程在工業(yè)上的應(yīng)用：酶工業(yè)、微生物發(fā)酵工業(yè)、紡織業(yè)4.基因工程在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用臨床治療基礎(chǔ)研究

在分子生物學(xué)研究的應(yīng)用生長、發(fā)育與進(jìn)化

（二）基因診斷基因診斷也叫DNA診斷、分子診斷從分子水平上對疾病進(jìn)行診斷的方法。通過從患者體內(nèi)提取樣本用基因檢測方法來判斷患者是否有基因異常或攜帶病原微生物。1、方法：PCR、RFLP（限制酶片段長度多態(tài)性）、DNA探針、基因序列分析法等2、基因診斷的疾病

遺傳性疾?。旱刂泻Ｘ氀?、血友病等110種

感染性疾病：乙型肝炎、愛滋病、衣原體等40種

惡性腫瘤：癌基因、抑癌基因的變異

其他疾病（三）基因治療基因治療（genetherapy)：將正常的外源性基因?qū)肷矬w或人體細(xì)胞內(nèi)，以禰補(bǔ)缺失的基因或關(guān)閉或降低異常表達(dá)的基因，達(dá)到治療疾病的目的。1、類型：性細(xì)胞基因治療體細(xì)胞基因治療

2、基因治療發(fā)展的三個階段

從20世紀(jì)80年代至今，基因治療的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段：

（1）第一階段：20世紀(jì)80年代初到80年代末禁錮期

（2）第二階段：1990-1995狂熱期，1990年之后，基因治療進(jìn)入臨床試驗(yàn)，短短數(shù)年之內(nèi)就有上百個臨床方案，帶來了醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的一片狂熱。

（3）第三階段：1995-至今理智期1995年，美國NIH主持了對基因治療臨床試驗(yàn)的初步估計(jì)，使基因治療從狂熱轉(zhuǎn)入理性化的正常軌道。

3、基因治療的應(yīng)用目前已有150多家基因治療公司，已有600多種臨床方案正在研究。截至2002年，全世界已有636個方案進(jìn)入臨床試驗(yàn)，病例數(shù)達(dá)3496例。

（1）治療遺傳性基因疾病1990年，美國國立衛(wèi)生研究所（NIH）首次對一名患有腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥的4歲女孩進(jìn)行了基因治療，由此標(biāo)志著人類基因治療正式開始。

審批：NIH下屬的RAC（RecombiniantDNAadvisoryCommittee）

FDA（Foodanddrugadministration)聯(lián)合審批

目前遺傳病基因治療的主要的研究對象

——————————————————————

疾病缺陷基因——————————————————————免疫學(xué)缺陷腺苷脫氨酶（ADA）血友病AVIII因子BIX因子高脂血癥低密度脂蛋白受體高雪氏病葡萄糖腦苷脂酶地地中海貧血-珠蛋白基因鐮狀細(xì)胞貧血-珠蛋白基因笨丙酮尿癥笨丙氨酸羥化酶肌肉萎縮癥營養(yǎng)因子———————————————————————腺苷脫氨酶缺陷的基因治療第一例：4歲的小女孩1990.7-8得到RAC和FDA的批準(zhǔn)1991.9.14開始進(jìn)行治療前10個半月進(jìn)行了7次恢復(fù)正常的T細(xì)胞占20-25%6個月后每3-5月進(jìn)行1次，臨床癥狀明顯改進(jìn)。T細(xì)胞的半衰期由30-35天增加到3-5月第二例：9歲的女孩

1991.1開始治療獲得成功

（２）惡性腫瘤：惡性腫瘤治療方案居首位，為403個，病例數(shù)2,392例；神經(jīng)、婦科、消化道、肺、皮膚、頭頸部以及造血系統(tǒng)惡性腫瘤基因：

抑癌基因：用P53治療非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞因子：IL-2、TNF治療黑色素細(xì)胞瘤等凋亡分子等（３）HIV感染（４）心血管疾病、代謝病

基因治療必須解決三個關(guān)鍵問題：基因?qū)胂到y(tǒng)基因表達(dá)的可控性更多更好的治療基因(四）基因工程藥物1.基因重組藥物自1982年世界上第一個基因重組藥物“人胰島素”在美國上市至今已有上百種產(chǎn)品問世，另有300多個品種處于臨床試驗(yàn)階段。全世界基因重組藥物的使用以16%的速度增長。IL-2、IFN、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、EPO、TPO、生長激素、胰島素等2.植物基因工程藥物植物基因工程藥物即利用轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)，在植物細(xì)胞中表達(dá)特定基因藥物。在藥物方面，將一些病毒或細(xì)菌的有用基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯等植物中，可大量、低成本地生產(chǎn)出疫苗，或通過直接食用該轉(zhuǎn)基因植物而獲得免疫力，如HBV轉(zhuǎn)植物基因口服疫苗的研制。3.動物基因工程藥物動物基因工程藥物指利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)基因藥物。用于分泌相應(yīng)基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的動物器官（如乳腺）稱為生物反應(yīng)器。如用轉(zhuǎn)基因綿羊生產(chǎn)蛋白質(zhì)酶抑制劑ATT，其產(chǎn)率達(dá)到每升奶35克，可大量生產(chǎn)，用于治療肺氣腫，目前已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。4.基因組藥物基因組藥物是利用反向生物學(xué)原理，沿著從基因序列→蛋白質(zhì)→功能→藥物的途徑研制新藥?；蚪M和后基因組學(xué)提供了龐大的信息資源和結(jié)果，為新藥的開發(fā)提供了優(yōu)化條件，前景廣闊。五、基因工程新方法與新技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用（一）單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphisms,SNP）

SNP是人群中的一種單堿基差異，在人群或其他動物種群中的遺傳變異中占有很高的比重。據(jù)估計(jì)在人類基因組上，平均每1kb就有一個SNP存在，SNP能充分反映個體間的遺傳差異。意義：SNP與疾病敏感性SNP與對環(huán)境的反應(yīng)性SNP與個體化治療SNP與藥物的敏感性

二）生物芯片技術(shù)：基因和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

(micro-array)各種不同的cDNA點(diǎn)在一個芯片上從正常組織和病變組織中抽提總RNA用不同的顏色的熒光素標(biāo)記RNA標(biāo)記的RNA與芯片上的DNA雜交用計(jì)算機(jī)分析(三）轉(zhuǎn)基因或基因敲除動物基本原理：基因同源重組MarioR.Capecchi，美國MartinJ.Evans，英國OliverSmithies，美國2007年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎獲得者

他們的貢獻(xiàn)因?yàn)樗麄冊谑褂门咛ジ杉?xì)胞改造活體內(nèi)特定基因的“基因靶向或基因打靶”技術(shù)等方面做出的突破性貢獻(xiàn)。

Thisyear'sNobelLaureateshavemadeaseriesofground-breakingdiscoveriesconcerningembryonicstemcellsandDNArecombinationinmammals.

Theirdiscoveriesledtothecreationofanimmenselypowerfultechnologyreferredtoasgenetargetinginmice.Itisnowbeingappliedtovirtuallyallareasofbiomedicine–frombasicresearchtothedevelopmentofnewtherapiesGenetargetingisoftenusedtoinactivatesinglegenes.Suchgene"knockout"experimentshaveelucidatedtherolesofnumerousgenesinembryonicdevelopment,adultphysiology,aginganddisease.Todate,morethantenthousandmousegenes(approximatelyhalfofthegenesinthemammaliangenome)havebeenknockedout.Ongoinginternationaleffortswillmake"knockoutmice"forallgenesavailablewithinthenearfuture.

組織特異性基因敲除第三節(jié)人類基因組計(jì)劃與后基因組時代

一、人類基因組計(jì)劃二、模式生物的基因組計(jì)劃

三、人類后基因組計(jì)劃

四、后基因組時代新的分支學(xué)科

1．功能基因組學(xué)2．結(jié)構(gòu)基因組學(xué)3.生物信息學(xué)4．比較基因組學(xué)5.蛋白質(zhì)組學(xué)6.整體生物學(xué)7.藥物基因組學(xué)第二章基因基本過程和研究策略基因工程的目的基因克隆(geneclonging)基因表達(dá)(geneexpression)-原核基因表達(dá)

-真核基因表達(dá)

-無細(xì)胞表達(dá)----通過體外重組技術(shù),將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當(dāng)載體，并導(dǎo)入受體細(xì)胞，擴(kuò)增形成大量子代分子的過程。

基因克隆(genecloning）

基因表達(dá)（geneexpression）

通過體外重組技術(shù),將某一目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當(dāng)載體，并導(dǎo)入受體細(xì)胞，使目的基因在受體細(xì)胞表達(dá)。即用基因工程方法獲得有功能的異源蛋白質(zhì)。基因克隆的技術(shù)路線

目的基因克隆載體體外重組重組子（雜合DNA）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞篩選陽性克隆大量擴(kuò)增，獲得子代DNA目的基因在細(xì)胞中表達(dá)的技術(shù)路線目的基因表達(dá)載體體外重組重組子（重組表達(dá)載體）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞(原核細(xì)胞和真核細(xì)胞)篩選、鑒定陽性克隆大量擴(kuò)增，表達(dá)外源蛋白基因工程的基本步驟一、獲得目的DNA二、選擇載體三、DNA重組四、將重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞五、陽性重組子的篩選、鑒定六、克隆基因的擴(kuò)增或目的蛋白的表達(dá)基因工程過程示意圖①從細(xì)胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因/使其表達(dá)③③基因工程的基本過程及研究策略1、目的基因的制備2、載體DNA選擇及其改造3、體外DNA重組4、重組DNA的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染5、重組體的篩選鑒定與克隆擴(kuò)增6、目的DNA在受體細(xì)胞中的表達(dá)

一、目的基因的獲得1、直接分離2、構(gòu)建基因組文庫3、構(gòu)建cDNA文庫4、PCR5、人工合成6、差異顯示1、直接分離DNA—適用于克隆微生物的基因組基因組：某生物細(xì)胞內(nèi)所含有的全套基因基因庫：含有某生物細(xì)胞內(nèi)全套基因的一組基因組文庫克隆2、構(gòu)建基因組文庫，篩選目的基因基因組文庫(genelibrary)：將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，進(jìn)行克隆。這些存在于所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫，它包含了該生物的所有基因。構(gòu)建流程抽提基因組DNA鳥槍法制備DNA片段DNA片段與載體重組轉(zhuǎn)化宿主菌篩選目的基因（核酸探針法、免疫結(jié)合法）

3、構(gòu)建cDNA文庫，篩選目的基因

cDNA文庫(complementaryDNAlibrary)以組織細(xì)胞中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆擴(kuò)增。這些在重組體內(nèi)的cDNA的集合即cDNA文庫。cDNA文庫僅包含正在表達(dá)的基因不同物種、不同組織的cDNA文庫不相同基因總量少，易篩選

4、PCR擴(kuò)增目的基因片段適用于克隆序列清楚的基因以基因組DNA為模板，直接進(jìn)行

PCR擴(kuò)增較難多采用以mRNA為模板的RT-PCR法RT-PCR

5、人工合成較短的DNA6、差異顯示法(differentialdisplay,DD)—篩選差異表達(dá)的基因

二、載體的選擇（一）克隆載體:（二）表達(dá)載體克隆載體克隆載體表達(dá)載體表達(dá)載體三、體外DNA重組基因克隆的核心-----體外重組(Recombination):人工將一段目的DNA插入一個載體的過程。

四、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞1、定義：外源DNA導(dǎo)入的細(xì)胞，是重組體擴(kuò)增的場所。轉(zhuǎn)化（transformation）：在一定條件下，將質(zhì)?；蛞再|(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入受體菌的過程。轉(zhuǎn)染（transfection)：在一定條件下，將噬菌體、病毒或以噬菌體、病毒為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入受體菌的過程轉(zhuǎn)化子：又稱工程菌，即接受了重組DNA的受體菌。2、對受體細(xì)胞的要求：易于接納外源DNA無特異的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶載體復(fù)制、擴(kuò)增不受阻與載體有互補(bǔ)性感受態(tài)菌：是指細(xì)胞處于最適攝取和容忍外源DNA的狀態(tài)重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法：1、氯化鈣法2.電轉(zhuǎn)化法3.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法4.病毒介導(dǎo)五、重組子的篩選及鑒定1、篩選：平板法（抗生素、藍(lán)白斑）菌落原位雜交（InSituHybridizationofClone）2、鑒定：（1）PCR（2）酶切：長度和方向鑒定

（3)測序

六、目的基因的擴(kuò)增或表達(dá)目的基因的克隆擴(kuò)增目的基因在適當(dāng)體系中的表達(dá)克隆擴(kuò)增克?。褐负邢嗤珼NA插入序列重組體的無性繁殖系?！訢NA重組技術(shù)，使特定基因或DNA在受體細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增的過程。氯霉素法擴(kuò)增：將適量氯霉素加入培養(yǎng)基，使受體細(xì)胞染色體復(fù)制終止，而質(zhì)粒復(fù)制繼續(xù)，拷貝增加，提高質(zhì)粒收獲率

外源基因的表達(dá)基因表達(dá)包括：轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工、分離、純化實(shí)現(xiàn)：DNARNA蛋白基因工程表達(dá)系統(tǒng)分原核、真核細(xì)胞和無細(xì)胞體系三類原核：大腸桿菌系統(tǒng)枯草桿菌系統(tǒng)真核：低等真核細(xì)胞系統(tǒng)（真菌）昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)無細(xì)胞體系

無細(xì)胞體系偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)的體外無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與基于細(xì)胞的蛋白表達(dá)系統(tǒng)相比較，無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)具有節(jié)約時間、提高具有功能的、可溶的、全長蛋白的總體產(chǎn)量該系統(tǒng)包含兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物或麥胚提取物，并帶有T7、T3或SP6RNA聚合酶，這些系統(tǒng)使基于DNA的蛋白合成成為現(xiàn)實(shí)

TNT?兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)以質(zhì)粒為模板，在一個試管內(nèi)完成轉(zhuǎn)錄和翻譯；TNT?PCRDNA快速系統(tǒng)對于PCR模板效果良好

表達(dá)產(chǎn)物的檢測：

1、特異性鑒定：熒光抗體法免疫沉淀法免疫印跡法ELISA2、生物學(xué)活性鑒定

六、目的基因的擴(kuò)增或表達(dá)第三章基因工程工具酶一、限制性內(nèi)切酶二、T4DNA連接酶三、逆轉(zhuǎn)錄酶四、核酸酶S1五、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶六、大腸桿菌DNA聚合酶

一、限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease,RE)能識別和切割特定ＤＮＡ序列的酶。是某些微生物具有的能切除和降解無關(guān)外來ＤＮＡ、抵抗外源性ＤＮＡ入侵的防御機(jī)制（一）限制性內(nèi)切酶的命名原則屬名的第一個字母（大寫）種名的前兩個字母（小寫）變種或品系的第一個字母（大寫）同一種微生物產(chǎn)生的幾種酶，按發(fā)現(xiàn)順序用羅馬數(shù)字表示

EcoRI、EcoRV、（二）限制性內(nèi)切酶的分類I型：無固定切點(diǎn)復(fù)合酶（內(nèi)切酶、甲基化酶、ATP酶、DNA解旋酶四種活性）在DNA鏈上的識別序列與切割位點(diǎn)不同（一般在離識別位點(diǎn)1kb到幾個kb的部位隨機(jī)切割）DNA無固定切點(diǎn)，不產(chǎn)生特異性DNA片段II型：識別序列與酶切點(diǎn)在DNA鏈同一特定位置識別與切割DNA鏈上特異核苷酸序列產(chǎn)生特異性DNA片段分子量小，僅需Mg++作為催化反應(yīng)的輔因子在基因工程中發(fā)揮重要作用III型：切點(diǎn)在識別序列之外復(fù)合酶（內(nèi)切酶、甲基化酶）在DNA鏈上的識別序列與切割位點(diǎn)不同切點(diǎn)在識別序列的一側(cè)一定距離的核苷酸位置

有特異的切點(diǎn)I、III型酶在基因工程中的價(jià)值不大（三）II型酶的識別與切割順序1、識別特定的序列：一般4-6個2、識別序列具有180的旋轉(zhuǎn)對稱性(回文結(jié)構(gòu)）3、對雙連DNA（dsDNA）的兩條連同時切割，可產(chǎn)生兩種不同末端1）齊平末端2）粘末端：3’粘性末端5’粘性末端以某一對核苷酸為軸，其左右同數(shù)目的核苷酸彼此呈堿基互補(bǔ)，若按同方向閱讀，其順序相同。5`—GTATCCGGATAC—3`3`—CATAGGCCTATG—5`回文結(jié)構(gòu)

平齊末端（flushend）

酶切點(diǎn)在識別序列的對稱軸上如：SmaⅠ-ATCGAT--ATCGAT-

-TAGCTA--TAGCTA–粘末端（Cohesiveend）概念:雙鏈DNA經(jīng)Ⅱ型RE酶切后，雙股DNA斷端分別形成一小段互補(bǔ)的核苷酸單股序列稱之粘性末端。粘末端特