植物組織培養(yǎng)的設(shè)備與使用方法

植物組織培養(yǎng)的設(shè)備與使用方法植物組織培養(yǎng)是在嚴格的無菌條件下培養(yǎng)植物材料。 要達到無菌操作和無菌培養(yǎng)，就需要認為創(chuàng)造無菌的環(huán)境，使用無菌的器具，同時還需要人工控制的溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。無菌環(huán)境和無菌條件的創(chuàng)造需要一定的設(shè)備， 實驗設(shè)備因工作的目的、 具體的任務(wù)和所具有的條件而異。但大多數(shù)采用化學實驗室、微生物實驗室及醫(yī)療上的一些設(shè)備、用具。

器材和圖1組培室分區(qū)布局1實驗室基本組成無菌操作室在植物組織培養(yǎng)中，無菌操作室(cleanchamber)是進行植物材料的分離及培養(yǎng)體轉(zhuǎn)移的一個要場所。由于植物組織培養(yǎng)需長時間的無菌操作， 所以無菌條件的好壞對組織培養(yǎng)成功與否起重要作用。微生物的培養(yǎng)生長時間短，而植物組織培養(yǎng)短的一個月，長的達幾年。所以，防止細菌和霉菌混入是提高工作效率和影響生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。無菌操作室基本要求是：干凈無菌、密閉、光線好。一般安裝滑動門，使空氣不致流動，以防界菌及塵埃的侵入；墻壁光滑平整，地面平坦無逢，便于清潔工作；室內(nèi)安裝紫外燈，以便滅菌，還要有照明裝置及燈座，以備臨時增加設(shè)備之用；室內(nèi)有超凈工作臺、移動式載物臺(醫(yī)用平板推車)、廣口瓶、試管、三角瓶、酒精燈、接種工具等。面積根據(jù)工作性質(zhì)可大可小，小的無菌操作室一般一間 5~7怦即可。接種室內(nèi)主要安放超凈工作臺，分單人使用和雙人同時連續(xù)作業(yè)使用兩種。超凈臺中準備接種的器具，如尖頭小鑷子、彎頭小鑷子、接種針、解剖刀、手術(shù)剪刀等，以及酒精燈、儲存70%酉精浸泡的棉球的廣口瓶等。 如果進行生長點或幼胚等細小結(jié)構(gòu)的分離與接種，還應當在超凈工作臺內(nèi)放置一臺小型的雙目解剖鏡，以便觀察、解剖和分離細小的外植體。小型離心機主要用于分離和收集液體培養(yǎng)中的細胞、單花粉及原生質(zhì)體等，也可用來篩選處于不同發(fā)育階段的胚狀體。無菌室外最好設(shè)置預備室作為緩沖間，以防工作人員進出時帶進雜菌。控溫光照培養(yǎng)箱可以安放在緩沖間內(nèi)。預備室與無菌室之間最好以玻璃相隔，便于觀察和參觀。在預備室可放置工作服、鞋、帽等，也需要裝自來水和紫外燈?；瘜W實驗室組織培養(yǎng)中植物植物材料是生長在人工配制的培養(yǎng)基上，這就需要在化學實驗室預先配制好培養(yǎng)基?；瘜W實驗室一般由以下幾個部分組成：洗滌室主要用于培養(yǎng)容器、玻璃器皿、用具和培養(yǎng)材料的清洗。新購進的玻璃器皿一般先1%較難洗滌的器皿，如吸管等應用洗液進行洗滌。洗滌室需備有工作臺面、上水管和下水管、水池、落水架、電源、干燥箱等。（2）藥品室 用于存放無機鹽、維生素、氨基酸、糖類、瓊脂、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等各種化學藥品。要求室內(nèi)干燥、通風、避免光照。室內(nèi)設(shè)有藥品柜、冰箱等設(shè)備。各類化學試劑安要求分類存放，需要低溫保存的藥劑應置于冰箱保存。有毒藥品應按規(guī)定存放和管理。（3）1/100普通天平（coarsebalanc?1/10000的電子天平（sensitivebalanee）1/1000和1/100000的天平，形成系列。除電源外，應設(shè)有防震固定的臺座。（4）培養(yǎng)基配置室用于配制、分裝培養(yǎng)基以及培養(yǎng)基的暫時存放。室內(nèi)應配有各種試管、三角瓶、燒杯、量筒、吸管、移液器等器具；有平面實驗臺以及安放藥品和器皿的各類藥品柜、器械柜、物品存放架；有水浴鍋、電飯鍋、微波爐、過濾裝置、酸度計、分注器以及貯藏母液的冰箱等。（5）滅菌室用于器皿、器械、封口材料和培養(yǎng)基的消毒滅菌。要求墻壁耐濕、耐高溫。室內(nèi)需要備有高壓蒸汽滅菌裝置、細菌過濾裝置、煤氣灶和電爐等。玻璃器皿和小用具的消毒常采用干熱滅菌法，些用具，采用120C高壓蒸汽滅菌法。

150C約保持1-3h。培養(yǎng)基、蒸餾水及一在沒有條件的地方，可將上述工作合并在一個房間內(nèi)完成，但設(shè)備的安裝與排列要合理，房間要寬敞、明亮、通風。培養(yǎng)室培養(yǎng)室（cultureroom）是將接種到試管等的培養(yǎng)材料進行培養(yǎng)生長的場所。需配有固定式培養(yǎng)架、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床和搖床、控溫控光設(shè)備，以滿足器官（芽、莖、花藥等） 愈傷組織、細胞和原生質(zhì)體的固體和液體培養(yǎng)的需要。進行固體培養(yǎng)和試管苗大量繁殖時，培養(yǎng)材料通常擺在培養(yǎng)架上，制作培養(yǎng)架應考慮使用方便節(jié)能、充分利用空間以及安全可靠。培養(yǎng)架材料為金屬、鋁合金或木制品。隔板可用玻璃板、木板、纖維板、金屬板等，最好使用玻璃板或鐵絲網(wǎng)，既透光，上層培養(yǎng)物又不受熱。為使用方便，通常設(shè)計為 5-7層，最低一層離地面高約 50cm,以上每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架高約1.7-2.3m。一般在每層上方裝置日光燈以供補充光照，培養(yǎng)架長度通常根據(jù)日光燈的長度設(shè)計。寬度可根據(jù)工作情況而定，一般裝

2支日光燈，寬40-50cm。最好使用專門為組織培養(yǎng)設(shè)計的節(jié)能冷光源,其光譜與日光相近且省電。每日照明時間根據(jù)培養(yǎng)物的特性不同而有所區(qū)別，一般為

10-16h，最好用自動計時器控制光照時間。培養(yǎng)室要保持一定的溫度條件，大多數(shù)情況保持在

20-27C,要求室內(nèi)溫度均勻一致。室內(nèi)濕度也要求恒定。為防止培養(yǎng)基的干燥和菌類污染,相對濕度保持在

70%-80%為好。溫濕度的保持可用空調(diào)機或調(diào)濕機通過繼電器、石英定時開關(guān)鐘、控溫儀等來控制。大多數(shù)恒溫培養(yǎng),應根據(jù)要求預先調(diào)節(jié)好。溫度變動太大,易使培養(yǎng)材料遭受菌類污染。培養(yǎng)室應保持整潔。有條件的可裝置細菌過濾裝置。如需進行液體培養(yǎng),還應根據(jù)培養(yǎng)的種類放置搖床、轉(zhuǎn)床等各種培養(yǎng)裝置。轉(zhuǎn)床上的培養(yǎng)瓶不同的轉(zhuǎn)動,瓶內(nèi)培養(yǎng)物交替地處于液相和氣相,保證了良好的通氣條件,有利于培養(yǎng)物的生長。此應有暗培養(yǎng)的設(shè)備,如柜子或無光培養(yǎng)箱。

有的實驗要求暗培養(yǎng),因此外,為避免蟲類侵染,培養(yǎng)室應杜絕栽培植物。培養(yǎng)室附近也應盡量避免放置盆花等植物。細胞學觀察室用于觀察、記錄培養(yǎng)材料的生長情況及結(jié)果。室內(nèi)要有固定的水磨石或瓷磚臺板,以放置顯微鏡、解剖鏡、倒置顯微鏡及照相設(shè)備等儀器。馴化移栽室用于試管苗的移栽。通常在溫室或塑料大棚內(nèi)進行。室內(nèi)備有彌霧裝置、遮蔭網(wǎng)、移植床等設(shè)施；缽、盆、移植盤等移植容器；草炭、蛭石、沙子等移植基質(zhì)。試管苗移植一般要求溫室溫度在15C-35C,相對濕度70鳩上。超凈工作臺使用無菌操作應在超凈工作臺中進行。超凈工作臺內(nèi)在都裝有一個小電動機，它帶動風扇0.3口的顆粒濾掉，然后這種不帶真菌和細菌的超凈氣流吹過臺面上的整個工作區(qū)域。 由高效過濾器吹出來的空氣的速度大約是(27±3)m/min，所有的污染物都會被這種超凈氣流吹跑。只要超凈工作臺不停的運轉(zhuǎn)，在臺面上即可保持一個完全無菌的環(huán)境，而且這種氣流不會吹滅在臺面上使用的精燈。為了延長過濾器的使用壽命，超凈工作臺不要安放在塵埃多的地方，需定期檢查超凈工作臺臺面10min的東西也不宜太多，特別注意不要把物件堆得太高，以免擋住氣流。在使用超凈工作臺時應注意安全，當臺面上的酒精燈已經(jīng)點燃以后，千萬不要再噴灑酒精消毒臺面，否則很易引起火災。無菌操作的步驟將植物組織塊放入一個廣口玻璃瓶中，加入含有幾滴活化劑的濃度適當?shù)南疽?，時搖動玻璃瓶。消毒結(jié)束后，打開瓶蓋，將消毒液倒出，注入適量的無菌蒸餾水(經(jīng)高壓滅菌后)，再蓋上蓋，搖動數(shù)次，將水倒掉，如此重復3-4次。將材料取出，放在一個已經(jīng)滅過菌的培養(yǎng)皿中。在對植物材料進行消毒處理的同時，對所要使用的器械進行消毒，先在 90%酒精中蘸一下取出，在酒精燈火焰上消毒，然后放在器械架上冷卻備用。所有操作器械在每次使用后均需要再用火焰消毒一次。使用消過毒的器械(如解剖刀、解剖針、打孔器、剪刀等)從已經(jīng)過表面消毒的材料切取適當?shù)耐庵搀w。如果需要用解剖鏡，應事先用進行消毒。

70%酒精棉擦拭顯微鏡臺表面打開培養(yǎng)容器，將外植體接種到培養(yǎng)基上。如果使用的是玻璃培養(yǎng)容器，把瓶口置酒精燈火焰上烘烤數(shù)秒鐘，然后迅速用瓶蓋或封口膜封嚴。高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法高壓滅菌鍋是一個能夠耐壓同時可以密閉的金屬鍋，有立式與臥式兩種。熱源可以用蒸汽、煤氣爐、電爐等。滅菌器上裝有溫度計和壓力表， 還有排氣口，它的作用是在密閉之前，利用蒸汽將鍋內(nèi)的冷空氣排盡。此外在滅菌鍋上還裝有安全活塞，如果壓力超過一定限度，活塞的閥門即能自動打開，放出多余的蒸汽。1)打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)或從加水口處加水?？垮伇?，以免冷凝水順壁流入物品中。加蓋旋緊螺旋，是鍋密閉。打開放氣閥，加熱，自開始產(chǎn)生蒸汽后約 3min再關(guān)緊放氣閥，此時蒸汽已將鍋內(nèi)的冷空氣由排氣孔排出，讓溫度隨蒸汽壓力增高而上升。待壓力逐漸上升至所需壓1.034*105Pa20min之逐漸下降。滅菌后，待壓力降為0時，開蓋，取出滅菌物品。在壓力未完全下降時，切勿打開鍋蓋。37C24h從鍋內(nèi)取出趁熱擺成斜面。PH計操作程序接上電源，打開機