高三一輪復習基因工程-基因工程的工具及操作程序課件

專題1基因工程生物選修三現(xiàn)代生物技術專題科學家的奇思妙想！能發(fā)光的水母能否讓熱帶魚也能發(fā)光?設想不能發(fā)光的熱帶斑馬魚這些奇思妙想怎樣來實現(xiàn)？基因工程(geneengineering)按照人們意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里表達，定向地改造生物的遺傳性狀。基因拼接技術或DNA重組技術原理：基因重組目的基因受體細胞限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶載體切縫運基因工程三大工具DNA重組技術的基本工具“分子手術刀”—限制性核酸內(nèi)切酶切：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。(又稱限制酶)原核生物特點：專一性一種限制酶只能識別特定的核苷酸序列(6個核苷酸)，并在特定的切點上切割DNA分子。如：EcoRⅠ，SmaⅠ,HindⅢ等切點位點：核苷酸間的磷酸二酯鍵限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ)作用過程常見限制酶的識別序列回文序列中心對稱（中軸線）限制酶切割結果黏性末端(切割點在中軸線兩側)平末端(切割點在中軸線上)CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG

黏性末端限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ）作用過程“分子縫合針”—DNA連接酶縫：恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，將互補配對的兩個DNA片段的末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子?？p合位點：生成磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶黏性末端黏性末端和平末端DNA連接酶G

AA

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GGC

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G用同種限制酶切割DNA連接酶連接的是DNA骨架上的缺口，不是堿基間的氫鍵“分子運輸車”—載體運：將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細胞中去，并且攜帶目的基因在受體細胞中進行自我復制或者整合到染色體DNA上隨其同步復制。種類：質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒等載體必須同時滿足三個要求：①具有一到多個限制酶的酶切位點,供目的基因插入其中;②具有復制原點，能進行自我復制或者整合到染色體DNA隨其進行同步復制。③具有標記基因,鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細胞篩選出來。(四環(huán)素抗性基因，氨芐青霉素抗性基因，熒光蛋白基因等)質(zhì)粒：存在于許多細菌和酵母菌等生物中,是獨立于細胞染色體(擬核)外裸露的能夠自主復制的小型環(huán)狀DNA分子.用作載體的質(zhì)粒一般經(jīng)過人工改造過的?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?.目的基因的檢測與鑒定2.基因表達載體的構建1.目的基因的獲取3.將目的基因?qū)胧荏w細胞基因工程的基本操作程序1.目的基因的獲取①從基因文庫中獲取目的基因受體菌染色體基因載體受體菌中包含某生物全部的基因，這樣的文庫成為基因組文庫受體菌中包含某生物一部分的基因，這樣的文庫成為部分基因文庫(cDNA文庫)基因文庫DNA啟動子終止子非編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄的過程逆轉(zhuǎn)錄的過程DNA聚合酶真核生物的基因結構作用：起始轉(zhuǎn)錄作用：終止轉(zhuǎn)錄cDNA基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較怎樣從基因文庫中得到我們所需要的目的基因呢？根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)的特性來獲取目的基因。1.目的基因的獲?、诶肞CR技術擴增目的基因PCR：多聚酶鏈式反應(polymerasechainreaction)生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。DNA復制PCR擴增原理：DNA復制反應體系：模板、引物、四種游離的脫氧核苷酸、TaqDNA聚合酶、酶促反應所需的離子等。前提：目的基因上有一段已知的核苷酸序列引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3`端開始連接脫氧核苷酸。PCR擴增儀PCR擴增的過程：基因擴增以指數(shù)形式增長（2n）n為PCR的循環(huán)次數(shù)(30)含有目的基因的DNA片段進行PCR擴增，在第三輪才出現(xiàn)只含目的基因的DNA片段。變性→復性→延伸1.目的基因的獲取③人工合成目的基因逆轉(zhuǎn)錄法：提取生物體內(nèi)mRNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得DNA?；瘜W合成法：基因比較小，核苷酸序列已知。DNA合成儀。DNA合成儀目的基因的獲取人工合成法從基因文庫中獲取利用PCR擴增(有一段已知目的基因的核苷酸序列)化學合成法(基因的核苷酸序列已知)逆轉(zhuǎn)錄法小結2.基因表達載體的構建①基因表達載體的組成元件注意：目的基因位于啟動子與終止子之間，方向：啟動子→目的基因→終止子插入目的基因時，注意不要破壞其他元件的完整性基因工程的核心標記基因目的基因①目的基因；②復制原點；③標記基因(鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來)；④啟動子(位于基因首端，RNA聚合酶識別和結合的部位，起始轉(zhuǎn)錄)；⑤終止子(位于基因尾端，終止轉(zhuǎn)錄)。目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。起始密碼子和終止密碼子②基因表達載體的構建過程載體(質(zhì)粒)DNA分子(目的基因)基因表達載體(重組質(zhì)粒)同種限制酶切割DNA連接酶連接特殊？注意：切割目的基因和載體可用同種限制酶也可用不同種限制酶，保證產(chǎn)生相同黏性末端；切割目的基因和載體可用1種限制酶也可用2種限制酶，一般選擇2種限制酶進行切割。防止目的基因和載體自身環(huán)化和隨意連接練習1：限制酶MunⅠ和EcoRⅠ的識別序列及切割位點分別是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如圖表示四種質(zhì)粒和目的基因，其中，箭頭所指部位為酶的識別位點，質(zhì)粒的陰影部分表示標記基因。適于作該目的基因運載體的質(zhì)粒是（）練習2：下面是質(zhì)粒的示意圖，其中ori為復制必需的序列，ampr為氨芐青霉素抗性基因，tetr為四環(huán)素抗性基因，箭頭表示限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點．若要得到一個能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長而不能在氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長的含重組質(zhì)粒的細胞，應選擇合適的酶切位點是（）A． B．C． D．氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因思考討論，將圖2中的目的基因插入到圖1載體中，有幾種方案？有人將此質(zhì)粒載體用EcoRⅠ酶切后，與用EcoRⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接導入大腸桿菌。則大腸桿菌中可能出現(xiàn)幾種結果？4，大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。怎樣設計實驗來區(qū)分這些大腸桿菌？含氨芐青霉素的培養(yǎng)基；含四環(huán)素的培養(yǎng)基。練習3：3鏈接高考(2016全國卷Ⅰ)某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質(zhì)粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}：（1）質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有

（答出兩點即可）。而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有

。能自我復制、具有標記基因

啟動子終止子

鏈接高考(2016全國卷Ⅰ)某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質(zhì)粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問題：（2）如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞不能區(qū)分的，其原因是

；并且

和

的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是

。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有

的固體培養(yǎng)基。二者均不含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不能生長

含有質(zhì)粒載體含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長四環(huán)素

鏈接高考(2016全國卷Ⅰ)某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質(zhì)粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}：

（3）基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自于

。受體細胞

3.將目的基因?qū)胧荏w細胞常見的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化：將目的基因?qū)胧荏w細胞并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。微生物細胞植物細胞動物細胞受體細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法感受態(tài)細胞法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法侵染農(nóng)桿菌植物當植物受到損傷時傷口處細胞分泌大量酚類物質(zhì)，吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞進行侵染適用范圍：雙子葉植物和裸子植物Ti質(zhì)粒T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)：可轉(zhuǎn)移到植物細胞并整合到植物細胞染色體的DNA上隨植物染色體DNA上復制和表達T-DNATi質(zhì)粒植物組織培養(yǎng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法此方法經(jīng)濟有效基因槍法適用范圍：單子葉植物原理：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面(鎢粉粒子，金粉粒子等)的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達。(又叫微彈轟擊法)此方法成本較高胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊花粉管通道法花粉管通道法適用范圍：開花植物原理：植物授粉后，花粉形成的花粉管通道還未愈合前，減去柱頭，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。我國科學家獨創(chuàng)此方法簡單經(jīng)濟抗蟲棉顯微注射法過程：目的基因表達載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵（早期胚胎培養(yǎng)）→新性狀動物顯微注射儀超級小鼠基因表達載體顯微注射法感受態(tài)細胞法操作過程：1.用Ca2+處理微生物細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，處于這種狀態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞。2.將構建好的表達載體DNA