HIV抗體檢測技術(shù)簡介 深圳市疾病預(yù)防控制中心艾滋病防治科 王曉輝 2008

HIV抗體檢測技術(shù)簡介

深圳市疾病預(yù)防控制中心艾滋病防治科

王曉輝

2021年4月29日1HIV1+2抗體檢測依據(jù)衛(wèi)生部?關(guān)于頒發(fā)〈全國艾滋病檢測工作標(biāo)準(zhǔn)〉的通知?〔衛(wèi)疾控發(fā)[1998]第28號〕2HIV抗體檢測實驗室種類和分級1.種類：確證實驗室：抗體確證中心、確證實驗室初篩實驗室：初篩中心和初篩實驗室。分級：省級HIV抗體確證中心，在市、縣區(qū)衛(wèi)生防疫站或有關(guān)系統(tǒng)中設(shè)立HIV抗體確證、初篩中心和初篩實驗室。3HIV抗體初篩實驗室任務(wù)作HIV抗體初篩檢測，并提供檢測前、后的咨詢效勞。及時將初檢陽性的標(biāo)本送HIV抗體初篩中心實驗室，再轉(zhuǎn)送確證實驗室確證。作好初檢標(biāo)本登記、實驗記錄，每月5日向當(dāng)?shù)氐腍IV抗體初篩中心實驗室報告HIV抗體檢測情況。4HIV抗體確證實驗室任務(wù)◆承擔(dān)衛(wèi)生部和省衛(wèi)生廳指定區(qū)域HIV抗體確證任務(wù)。◆承擔(dān)局部HIV抗體初篩任務(wù)。◆及時向省級HIV抗體確證中心和同級衛(wèi)生局報告確證的陽性結(jié)果?！舭丛孪蚴IV抗體確證中心報告HIV抗體檢測工作情況。5HIV抗體檢測實驗室必備條件◆人員條件：人數(shù)、職稱、從事血清學(xué)檢驗經(jīng)歷、培訓(xùn)、復(fù)訓(xùn)◆設(shè)備條件◆實驗用房或檢測操作區(qū)間；◆儀器設(shè)備；◆使用高敏感度和特異度的初篩、確證試劑；◆要建立血清庫6HIV抗體檢測實驗室的審批和管理廣東省實行HIV抗體檢測實驗室資格審批制度從事HIV抗體檢測工作人員必須要有上崗合格證未經(jīng)審批的實驗室和人員不得開展HIV抗體檢測工作7HIV抗體檢測實驗室的審評◆省衛(wèi)生廳成立廣東省HIV抗體檢測初篩實驗室資格審評組◆審評組的職責(zé)：對申報HIV抗體檢測初篩實驗室的單位進行現(xiàn)場考核、技術(shù)論證和評價；對HIV抗體檢測初篩實驗室的工作進行技術(shù)指導(dǎo)和考核；為全省HIV抗體檢測工作和實驗室建立及管理提供咨詢和建議◆審評組的常規(guī)組織工作委托廣東省HIV抗體檢測確證中心負責(zé)。8910艾滋病檢測方法一、HIV抗體檢測1.HIV抗體初篩檢測:ELISA法、顆粒凝集法、免疫斑點法、放射免疫法2.HIV抗體確證檢測:免疫印跡法〔WB〕、條帶免疫印跡法〔LIA〕、免疫熒光法〔IFA〕、放射免疫沉淀法〔RIPA〕。二、艾滋病的病原學(xué)診斷1.HIV抗原〔P24〕和逆轉(zhuǎn)錄酶〔RT〕檢測；2.病毒培養(yǎng);3.基因診斷:探針雜交、nt-PCR、HIVRNA定量〔RT-PCR、bDNA、NASBA〕11HIV抗體初篩檢測一、HIV抗體檢測要求:1.實驗室:HIV抗體檢測初篩和確證實驗室須分別經(jīng)省級衛(wèi)生行政部門和衛(wèi)生部考核、審評和批準(zhǔn)前方可從事艾滋病檢測工作:2.檢測場所：符合?全國艾滋病檢測工作標(biāo)準(zhǔn)?的要求；3.人員:經(jīng)國家或省級艾滋病抗體檢測學(xué)習(xí)班培訓(xùn);4.試劑:批批檢合格、進口許可證、生物制品檢定所檢定、在有效期內(nèi)的HIV-1/2混合型試劑；5.保密:初篩檢測的陽性結(jié)果不是最終結(jié)果,必須經(jīng)確證試驗由HIV抗體確證實驗室出具陽性報告才具有法律效應(yīng),且須由衛(wèi)生行政部門選擇適當(dāng)方式和時間通知其本人及其家屬,不得向無關(guān)人員透露有關(guān)情況,感染者檔案以機密形式專人負責(zé)管理;126.標(biāo)本運送和保存:及時別離血清(漿)、無變質(zhì)、無污染、無溶血。7.天氣炎熱、路途較遠時應(yīng)低溫用帶蓋不易破損容器專人運送，8.并詳細填寫送檢單；城區(qū)24小時、農(nóng)村48小時內(nèi)送確證實驗室9.并及時報轄區(qū)衛(wèi)生防疫站。13HIV抗體檢測HIV感染后的“窗口期〞〔Windowperiod〕：指從HIV感染后到用現(xiàn)有方法能檢出HIV病原體〔HIV抗原或核酸〕和/或抗體前的這段時間。血清陽轉(zhuǎn)〔Seroconversion〕：隨著感染的過程進展，HIV抗體濃度或滴度隨之增多，血清HIV抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性，這個過程稱之。個體差異、檢測方法的種類和試劑的敏感性是影響“窗口期〞長短主要因素。通常情況下，病毒別離培養(yǎng)和PCR法檢測HIVRNA的“窗口期〞約為7天左右；檢測P24抗原的“窗口期〞約為14-21天；檢測抗體的“窗口期〞約為31-60天。盡量縮短“窗口期〞，提高檢測方法的靈敏度對于HIV感染的早期診斷，特別是在獻血員的篩查，防止病毒傳播方面具有重要意義。目前許多試劑生產(chǎn)商已成功研制開發(fā)出能同時檢出HIV抗原和抗體第四代診斷試劑，并開始進行商業(yè)化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。14哪種情況下需要進行HIV檢查1、有高危行為者：如不平安性行為、賣淫嫖娼、吸毒者；2、不平安受血或血制品使用史者，接受器官移植手術(shù)者；3、HIV感染者/AIDS病人密切接觸者及經(jīng)常接觸這類患者的醫(yī)護人員或?qū)嶒炇夜ぷ魅藛T；4、有以下臨床病癥或體癥者：〔1〕反復(fù)而持續(xù)性的低熱、腹瀉；〔2〕不明原因的體重下降；〔3〕浸潤性宮頸癌〔年輕女性〕；〔4〕中青年出現(xiàn)嚴(yán)重皰疹病毒感染，且治療效果不佳；〔5〕局部或全身性念珠菌、真菌感染〔口腔、腸道、呼吸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外陰或陰道等〕、CMV感染等；〔6〕弓形體腦病、隱球菌性腦膜炎、年輕人不明原因失明、失憶、智力障礙等；〔7〕嚴(yán)重進展迅速的結(jié)核桿菌感染；〔8〕反復(fù)發(fā)作的肺部炎癥、PCP等。〔9〕皮膚癌、卡波氏肉瘤、淋巴瘤、嚴(yán)重毛囊炎等。15常用的HIV抗體初篩檢測方法一、顆粒凝集法原理：將可溶性HIV抗原吸附或偶聯(lián)至無關(guān)載體顆粒上，使之成為致敏載體顆粒，與待檢標(biāo)本中HIV抗體結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。HIV抗原通常為完整病毒裂解產(chǎn)物、基因重組或合成多肽抗原成分，常用的無關(guān)載體為RH–O型人紅細胞和動物〔綿羊、兔、雞等〕紅細胞、活性炭或硅酸鋁顆粒、聚丙乙烯乳膠顆粒、明膠顆粒等。16PA定性試驗C對照顆粒S致敏顆粒M陰性顆粒17PA定量試驗C對照顆粒S致敏顆粒M陰性顆粒1819顆粒凝集法的特點和適用范圍1.操作簡便，快速，通常在1-2小時時間報告結(jié)果，適于大規(guī)模普查。2.整個實驗在18-25℃室溫下完成，無需洗滌和任何儀器特別適合于基層衛(wèi)生單位、野外或緊急情況的HIV抗體檢測。3.價格低廉。4.特異性，敏感性較好。20快速試劑和PA的應(yīng)用偏遠地區(qū)急診臨床〔高危〕職業(yè)暴露臨產(chǎn)21二、酶聯(lián)免疫吸附試驗

〔Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA〕簡介：酶聯(lián)免疫吸附試驗簡稱酶標(biāo)法，是根據(jù)酶免疫測定原理開展的一種技術(shù)，目前已廣泛用于各種抗原和抗體的檢測，也是最常用的HIV抗體檢測方法。近年來隨著生物技術(shù)的不斷開展，眾多試劑生產(chǎn)商對檢測方法的多個環(huán)節(jié)從技術(shù)上進行改進和完善，目前已推出第四代HIV抗體ELISA檢測試劑，但其根本方法分三類：間接法、雙抗原夾心法和抗原競爭法。22HIV抗體測定

HIV抗體試劑盒進展代次 抗原 方法 檢測時間 1 全病毒 間接 >2個月 2 重組或多肽 間接 3-4周 3 重組+多肽 夾心 4-7天 4 抗原+抗體 夾心 抗原5pg23HIV抗體測定

特點第一代 全病毒 HIV-1型第二代 重組/蛋白/多肽 聯(lián)合HIV-2型 敏感度同第一代，特異度提高第三代 重組/蛋白/多肽間接法改為直接法 除IgG外能檢出早期IgM,縮短窗口期24第四代HIV抗體試劑的特點抗原抗體聯(lián)合檢測不能取代血液單個抗原的篩查〔前者抗原檢測范圍20-100pg/ml，后者3.5-15pg/ml〕，增加假陰性在急性感染期單一P24測定較第四代試劑檢出早1-2天第四代試劑在HIV-1非B亞型、O型和HIV-2的敏感度差異較大由于參加檢測抗原的抗-24抗體可減少單一第三代HIV抗體試劑的敏感度可能會增加非特異性反響的危險性〔第三代假陽性率0.2%增至0.3%-0.8%〕在檢測程序上凡第四代陽性，要進行抗原的證實試驗核酸測定比抗體提前11天1998年BernardWebur首先評估了第四代試劑平均減少4天窗口期25酶聯(lián)免疫吸附試驗影響因素1.反響溫度：ELISA實驗一般在35~40度，在一定范圍內(nèi)，提高溫度可以加快抗原抗體的結(jié)合率。2.反響時間：在ELISA測定中，抗原或抗體被包被在固相的外表，抗原抗體反響只能在固相外表附近進行，遠離固相外表的物質(zhì)要靠濃度差的改變緩慢地參與反響，所以在37度條件下需要1~2小時才能到達反響平衡，在操作時一定要使各步反響到達足夠的時間。3.樣本參加量：加樣量太少使敏感性下降和產(chǎn)生誤差；加大樣本量在一定范圍內(nèi)可提高敏感性，但有可能使特異性下降。要注意檢查加樣器的精確度。4.酶穩(wěn)定性：酶結(jié)合物在凍干或濃縮狀態(tài)下可以在較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋后滴度下降較快。試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用。5.交叉反響性：加樣或分血過程中血樣的交叉污染可導(dǎo)致假陽性反響。6.“灰區(qū)〞反響:將OD值在Cut-Off±10%范圍內(nèi)的樣本稱之。此類樣本應(yīng)該高度重視并進行復(fù)檢，以便于發(fā)現(xiàn)早期感染者。26HIV抗體初篩檢測的局限性1.陽性反響樣本不能確證，需用本法和其它方法復(fù)檢，如仍為陽性，需確證試劑進一步確證。2.陰性結(jié)果不能排除HIV感染：HIV感染后血清陽轉(zhuǎn)前的“窗口期〞，HIV抗體檢測為陰性，晚期艾滋病患者某些抗體〔如P24等〕可能檢測不到。此外反響中抗體量過多，抗原抗體比例不適而不能形成特定的結(jié)合，而出現(xiàn)凝集抑制。3.可能出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果：了解試劑供給商因其使用抗原和包被方法技術(shù)存在一定差異。4.不能診斷<18月齡新生兒的母嬰垂直感染。27初篩檢測中值得注意的幾個問題(1)1、初篩檢測的陽性結(jié)果不是最終結(jié)論，不能通知受檢者到本人及其他人員，陽性樣本需用該試劑和另一種試劑復(fù)檢，如仍為陽性，應(yīng)及時送HIV抗體確證試驗室用確證試驗檢測；2、初篩檢測的宗旨是要盡可能檢出所有的陽性樣本，因此應(yīng)選用敏感性高的符合國家要求的高質(zhì)量試劑，且必須為HIV-1/2混合型，最好能同時檢測HIV-1O亞群。使用不符合規(guī)定的試劑可能導(dǎo)致錯誤結(jié)果和法律糾紛，甚至造成嚴(yán)重后果；3、各單位可根據(jù)不同目的、檢測對象、人群流行率、本錢-效益比、實驗室設(shè)備、和技術(shù)水平等選擇不同初篩實驗方法。如血站對獻血員進行篩選時，應(yīng)選擇高敏感性試劑，盡可能防止任何情況的漏檢，從而保證血液平安；28初篩檢測中值得注意的幾個問題(2)4、交叉反響性或假陽性反響：研究說明，某些病毒〔如CMV，EBV病毒等〕、寄生蟲〔如瘧原蟲等〕、MHC抗原等的局部抗原性物質(zhì)和某些自身免疫病患者〔如系統(tǒng)性紅班狼瘡和風(fēng)濕病〕體內(nèi)的自身抗體與HIV的某些抗原決定簇有交叉反響性，在初篩檢測時可能導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象。此種情況下，樣本OD值與臨界值〔CUTOFF〕的比值〔S/CO〕通常為1-1.2,也即所謂的“灰色區(qū)〞內(nèi)，對這種結(jié)果除應(yīng)考慮早期感染、HIV-2或HIV-1“O〞亞型感染、真弱陽性等可能性外，還應(yīng)注意假陽性，以及實驗操作過程中的技術(shù)誤差和和檢測設(shè)備的工作性能等；5、不同廠家及同一廠家生產(chǎn)的不同批次試劑的敏感性和特異性可能存在一定差異，各實驗室最好應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控血清對新購試劑及在每次檢測時進行質(zhì)量控制和質(zhì)量評價，以確保檢測工作結(jié)果的準(zhǔn)確可靠性；6、實驗室的平安：HIV實驗室應(yīng)嚴(yán)格規(guī)定要求進行操作。29初篩檢測中值得注意的幾個問題(3)7、HIV-1與HIV-2之間的交叉反響性；8、針對HIV感染的不同時期選用不同的檢測方法：病毒載量、nt-PCR：HIV感染1周后；病毒別離、P24抗原、RT酶檢測：HIV感染2周后；HIV抗體檢測：HIV感染6~8周后。9、HIV抗體的檢測反響強度與HIV感染的概率：許多HIV抗體檢測方法既是一種定性實驗，也是一種半定量實驗。ELISA方法可根據(jù)OD值的強度確定抗體量的多少。反響性越強的血清，含有HIV抗體的可能性越大，S/CO值>6的樣本絕大局部為陽性。30HIV抗體確證檢測HIV抗體確證是目前國際上通用的對樣品中血清學(xué)檢測HIV抗體陽性結(jié)果的最終評價。它是應(yīng)用高特異性試劑來證實和判斷HIV抗體初篩陽性反響是由于真的HIV-1和/或HIV-2感染引起，還是由于非特異性交叉反響或與HIV感染無關(guān)的其它因素所致。根據(jù)國家衛(wèi)生部規(guī)定，HIV抗體陽性報告必須由衛(wèi)生部認證并取得資格的HIV抗體確證實驗室出具才有法律效應(yīng)。常用的HIV抗體確證實驗方法有免疫印跡法〔WesternBlot，WB〕，條帶免疫印跡法〔StripImmunoblotAssay或LinearImmunoblotAssay，SIA或LIA〕，免疫熒光法〔ImmunofluorescenceAssay，IFA〕和放射免疫沉淀法〔RadioimmunopreciptationAssay，RIPA〕。其中以WB法最常用，而后二種在我國極少使用，在此不作詳細介紹。31免疫印跡實驗〔WB〕原理：HIV-1純培養(yǎng)物經(jīng)滅活和裂解處理后在SDS凝膠上電泳，不同分子量的HIV-1抗原在凝膠中的泳動速率不同而被別離。通過電轉(zhuǎn)移等方法將凝膠中的抗原轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上〔如為HIV-1/2混合型試劑還需在硝酸纖維素膜上的適當(dāng)位置噴涂基因重組或合成的HIV-2抗原多肽〕，含HIV抗原的條膜與適當(dāng)比例稀釋的待檢血清〔漿〕樣品共同孵育，如樣品中含有HIV-1和/或HIV-2特異性抗體那么與條膜上一定位置的相應(yīng)HIV抗原分子結(jié)合，在膜上形成HIV抗原-HIV抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)，參加酶標(biāo)記抗人免疫球蛋白，形成HIV-抗原-HIV抗體-酶標(biāo)記抗人免疫球蛋白復(fù)合物，再次洗滌后參加反響，在HIV抗體與相應(yīng)HIV抗原分子結(jié)合位置處出現(xiàn)肉眼可見的呈色條帶。32HIV抗體確證實驗結(jié)果評價〔1〕陽性：至少一條env帶(gp41、gp120、gp160)和一條pol帶〔p65、p51,p32〕。至少一條env帶和一條gag帶〔p55、p24、p18〕。至少一條env帶和一條gag帶和一條pol帶。至少兩條env帶。陰性：無上述反響條帶可疑：只有g(shù)ag帶和pol帶，無env帶

33HIV抗體確證實驗結(jié)果評價〔2〕HIV抗體不確定〔或可疑〕結(jié)果的評價：在某些情況下，有些初篩陽性或陰性樣品的HIV抗體確證實驗可出現(xiàn)不典型的HIV抗體反響性條帶圖譜，既不能確定為陽性也不能確定為陰性，稱為HIV抗體不確定〔Indeterminant〕或可疑陽性。該現(xiàn)象的出現(xiàn)頻率通常取決于所分析的人群類型和/或選擇用于免疫印跡實驗人群的篩選方法。此時應(yīng)每3個月追蹤隨訪一次，共2次，如為陰性或仍為不確定結(jié)果，那么按陰性結(jié)果報告；如出現(xiàn)陽轉(zhuǎn)，那么按陽性結(jié)果報告。34HIV抗體確證實驗結(jié)果評價〔3〕可能導(dǎo)致HIV抗體不確定結(jié)果出現(xiàn)的原因：①HIV早期感染，此時可能僅出現(xiàn)一條env帶，或p24、p31、p55帶；②非特異反響，如在高丙球