動物細胞融合和單克隆抗體課件-高二下學期生物人教版選修3

1．闡明動物細胞融合的概念。2．說出植物體細胞雜交和動物細胞融合的區(qū)別。3．闡明單克隆抗體制備的基本流程。4．分析單克隆抗體制備過程中兩次篩選所使用的方法和達到的目的。5．關注藥物供給的“靶向”技術。學習目標1．概念：動物細胞融合也稱細胞雜交，是指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的過程。

融合后形成的具有兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞，稱為雜交細胞。3．原理：細胞膜的流動性2．結果：與植物原生質體融合的方法相同物理方法：動物細胞沒有細胞壁，可以直接誘導融合。離心、振動、電激化學法：聚乙二醇（PEG）法生物方法：滅活病毒誘導法——動物細胞融合特有4．動物細胞融合的方法思考：19世紀30年代，科學家曾在肺結核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細胞。如何解釋這一現(xiàn)象？病人體內病毒等誘導多個體細胞融合形成了多核細胞。肺結核病人病理切片原理是什么？01原理

病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞相互凝集，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。教材P52“生物技術資料卡”滅活：是指用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結構。

人細胞小鼠細胞細胞融合雜交細胞37℃40min紅色熒光染料標記的膜蛋白綠色熒光染料標記的膜蛋白用熒光染料標記某種物質，利用其熒光特性，來反應研究對象的相關信息。熒光標記技術1970年弗雷和埃迪登(Frye和Edidin)人鼠細胞雜交實驗：注意說明動物細胞融合與受精作用的區(qū)別（1）受精作用：是在同種生物之間進行的，精子與卵細胞的融合不需要任何誘導劑，受精卵內具備同種生物的兩個親本的遺傳物質。（2）動物細胞融合可在不同物種間進行，由于物種間存在生殖隔離，所以自然條件下不能融合成雜交細胞，必須有誘導劑才能融合。形成的雜交細胞具備兩個親本細胞的遺傳物質，從而體現(xiàn)兩個親本的遺傳特性。4．誘導方式物理法：離心、振動、電激化學法：聚乙二醇（PEG)生物法：滅活的病毒突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交成為可能。（種間、屬間、科間、動植物之間）5．意義：成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。特別是利用雜交瘤技術制造單克隆抗體6．應用：動物細胞融合技術與植物體細胞雜交技術的比較植物體細胞雜交動物細胞融合原理細胞融合前的處理方法誘導細胞融合的方法細胞融合成功的標志主要用途意義細胞膜具有一定的流動性、植物細胞的全能性細胞膜具有一定的流動性用果膠酶和纖維素酶去除細胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細胞分散成單個細胞物理法：離心、振動、電激；化學法：聚乙二醇（PEG）物理法和化學法滅活病毒誘導法再生出細胞壁細胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實現(xiàn)遠緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能新聞1：“血清/漿療法”是否可以治療新冠？國家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》中，增加了“恢復期血漿治療”，并建議適用于病情進展較快、重型和危重型患者?！把瀵煼ā痹恚寒敳≡w入侵人體時，免疫系統(tǒng)會產生抗體，將抗體鎖在敵人身上，將其標記為被破壞。恢復后，這些抗體會在人的血液中循環(huán)流通數(shù)月至數(shù)年。從理論上講，將其中一些抗體轉移給具有相同病毒的其他人可以幫助他們的身體抵抗它?；蛘?，將這些抗體提供給健康的人，例如前線的醫(yī)護人員，可能會為感染提供一些臨時保護。新聞2：抗疫新招！玻利維亞開發(fā)驢血漿抗新冠血清玻利維亞《時代報》5月19日報道，玻利維亞國家衛(wèi)生實驗室正在三頭驢身上進行實驗，其產生的血清對新冠病毒的有效性估計“比人類血漿生成的血清至少高50倍”。動物血漿產生的血清與人類的不同，因為動物血清是經過多次“感染-免疫”過程產生的，而人類血漿產生的血清僅經過了一次免疫過程，所以動物產生的血清比人類的要“更濃縮”，抗病毒效果也會更強。提出問題：驢血漿抗體治療方法有沒有局限性呢？

自學教材P52－P53，回答下列問題：1．傳統(tǒng)方法生產抗體的缺點？2．什么是單克隆抗體？3．課后查閱資料人體編碼蛋白質的基因大約有25000個，那為什么體內產生的抗體能多達百萬種以上？抗體的傳統(tǒng)生產方法：從血清中分離抗體該法制備抗體的缺點：

產量低、純度低，且抗體的特異性差。多種漿細胞動物體內多種抗體抗原1、為什么產量低？2、為什么純度低？3、為什么特異性差？血清中有多種抗體因為血清中有多種抗體，會攻擊多種抗原漿細胞數(shù)量有限（高度分化、分裂能力弱）讀下面一段資料，找出單克隆抗體的概念人們發(fā)現(xiàn)，在動物發(fā)生免疫反應的過程中，體內的B細胞可以產生多達百萬種以上的特異性抗體，但是每個B細胞只分泌一種特異性抗體。因此，要想獲得大量的單一抗體，必須克隆單一的B細胞，形成細胞群。單克隆抗體的概念單克隆抗體：單個B細胞克隆形成的細胞群產生的化學性質單一、特異性強的抗體。提示1：對B細胞進行細胞培養(yǎng)可行嗎？提示2：我們所學的哪種細胞是可以無限增殖的？問題：如何大量生產單克隆抗體？請嘗試設計一個方案。提示3：有什么方法能使B細胞產生抗體的能力和骨髓瘤細胞無限增殖能力同時具備呢？雜交瘤細胞單克隆抗體

既能產生特異性抗體，又能大量繁殖的細胞骨髓瘤細胞能無限增殖

+一個漿細胞只分泌一種特異性抗體設計方案?米爾斯坦科勒BB、B瘤、瘤瘤（B、瘤）（一選）選擇性培養(yǎng)基：只有雜交瘤細胞才能存活獲得產生相應抗體的B細胞（二選）：選能產生所需專一抗體的雜交瘤細胞√體外培養(yǎng)小鼠腹腔內培養(yǎng)雜交瘤細胞特點：既能產生特異性抗體，又能大量增殖。如何篩選出培養(yǎng)液中的雜交瘤細胞？①細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。②人淋巴細胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細胞中只有D途徑，沒有S途徑，可是能不斷分裂增殖。你想到篩選雜交瘤細胞的方案了么？淋巴細胞骨髓瘤細胞雜交瘤細胞S途徑D途徑D途徑S途徑D途徑合成DNA合成DNA合成DNA不能無限增殖能無限增殖能無限增殖經過選擇性培養(yǎng)基篩選的雜交瘤細胞群進行克隆是否就得到產生純度高的抗體？還需怎么辦？1．單克隆抗體的制備問題思考1．單克隆抗體的制備

※知識拓展：如何進行雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)及抗體檢測？融合后的細胞經選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細胞就是雜交瘤細胞。但這些雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。陽性孔多孔板專一抗體陽性檢驗有限稀釋法通過適當?shù)南♂屵_到分離單個細胞進行培養(yǎng)的目的。（1）取出陽性孔培養(yǎng)液將其稀釋到每毫升10個細胞。（2）如果在多孔板中每孔加0．1毫升，使每孔內落入一個細胞。（3）根據(jù)檢測的陽性結果再次進行克隆化。項目第一次篩選第二次篩選（需要多次篩選）篩選原因方法篩選結果誘導融合后得到多種雜交細胞，還有未融合細胞等用特定的選擇性培養(yǎng)基進行篩選：未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜種細胞才能生長。篩選出融合的雜種細胞選擇培養(yǎng)獲得的雜交瘤細胞中有能產生其他抗體的細胞。用96孔板培養(yǎng)，在每個孔中盡量接種一個雜交瘤細胞的情況下進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經過多次篩選得到足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細胞。篩選出分泌所需抗體的雜交瘤細胞項目腹腔培養(yǎng)體外培養(yǎng)優(yōu)點缺點易于控制培養(yǎng)條件（如無需提供無菌環(huán)境等），操作簡單，成本較低規(guī)模小，產量少可大規(guī)模培養(yǎng)，大量生產需要人為控制培養(yǎng)條件，成本相對較高相關技術和原理：動物細胞融合、動物細胞培養(yǎng)；細胞膜的流動性、細胞增殖2．單克隆抗體的應用單克隆抗體最主要的優(yōu)點：特異性強，靈敏度高，并能大量制備。由于單克隆抗體純度高、特異性強，所以能準確地識別各種______物質的細微差異，并跟一定抗原發(fā)生_____________，因此，單克隆抗體在診斷的應用上，具有準確、高效、簡易、快速的優(yōu)點。作為診斷試劑抗原特異性結合抗（人絨毛膜促性腺激素）單克隆抗體

在受精后不久，胎盤滋養(yǎng)層細胞就會分泌人絨毛膜促性腺激素(HCG)，是由受孕婦女體內胎盤產生的一種糖蛋白類激素，在孕婦的尿液中大量存在。而在非妊娠婦女尿液中幾乎不含有。

正常的性成熟女性每個月都會排卵，最佳受精時間為排卵后24-36小時。在女性的月經周期中，尿液中的促黃體生成素（SH）會在排卵前24小時左右出現(xiàn)高峰值。據(jù)此可推測，排卵試紙起核心作用的物質是_____________________________?？勾冱S體生成素單克隆抗體2．單克隆抗體的應用作為診斷試劑用于治療疾病和運載藥物2．單克隆抗體的應用優(yōu)點：位置準確、療效高、副作用小如果把抗癌細胞的單克隆抗體跟放射性同位素、化學藥物或細胞毒素相結合，制成“____________”，注入體內，借助單克隆抗體的______作用，能將藥物定向帶到癌細胞所在位置，在原位殺死癌細胞。生物導彈導向2．單克隆抗體的應用2．單克隆抗體的應用2017年全球銷售額前五的單抗藥物商品名中文名稱公司適應癥2017年銷售額(億美元）Humria阿達木單抗Abbbie自身免疫性疾病184．21rituxan利妥昔單抗Roche白血病等73．88Herceptin曲妥珠單抗Roche乳腺癌等多種癌癥70．14Avastin貝伐珠單抗Roche結腸癌等多種癌癥66．88Remicade英夫利昔單抗J&J/MSD自身免疫性疾病63．152018諾貝爾生理學或醫(yī)學獎公布：讓治愈癌癥成為現(xiàn)實美國免疫學家詹姆斯·艾利森（JamesPAlison）日本免疫學家本庶佑（TasukuHonjo）Tc細胞PD-1PD-L1Tc細胞PD-1PD-L1癌細胞癌細胞細胞膜具有流動性物理法：離心、振動、電激化學法：聚乙二醇（PEG)生物法：滅活的病毒形成雜交細胞突破了遠緣雜交不親和的障礙制備單克隆抗體單克隆抗體雜交細胞雜交瘤細胞雜交瘤細胞群分泌特異抗體的雜交瘤細胞篩選二體外或體內培養(yǎng)篩選一

誘導融合提取動物細胞融合技術動物細胞培養(yǎng)技術單克隆抗體的制備既能大量繁殖又能產生專一抗體特異性強靈敏度高可大量制備骨髓瘤細胞已免疫的B淋巴細胞注射抗原請用箭頭把以下代表單克隆抗體制備過程步驟的圖解的字母按正確順序連接起來。

1．關于動物細胞融合與植物體細胞雜交技術的比較，下列敘述合理的是(

)A．均可使用PEG、電激或滅活病毒誘導細胞融合B．兩者都可以跨越種屬間的生殖隔離C．兩者都可以體現(xiàn)細胞的全能性D．在適宜條件下，均可發(fā)育成完整個體B2．科學家以乙肝病毒的核衣殼蛋白為抗原，制備出了單克隆抗體。下列相關敘述正確的是（）A．利用該單克隆抗體可以診斷是否感染乙肝病毒B．體外培養(yǎng)單個B淋巴細胞可以獲得針對乙肝病毒的單克隆抗體C．將等量B淋巴細胞和骨髓瘤細胞混合，經誘導后融合的細胞即為雜交瘤細胞D．將純化的核衣殼蛋白反復注射到小鼠體內，從小鼠血清中分離出的抗體為單克隆抗體A3．20世紀30年代，科學家們相繼在肺結核，天花，水痘，麻疹等疾病患者的病理組織中觀察到多核細胞，這些多核細胞可能的來源是（）A．體細胞在有絲分裂過程中，染色體完成了復制，紡錘體的形成受到損壞，導致細胞不能分裂成兩個子細胞而形成多核細胞B．體細胞在有絲分裂過程中，體內的有關病毒阻礙了細胞的分裂過程，導致細胞不能一次形成兩個子細胞而形成多核細胞C．患者的體細胞在病毒誘導下，由兩個或多個細胞核直接融合形成了多核細胞D．患者體內的病毒直接誘導多個體細胞的細胞融合而形成多核細胞D4．(2019江蘇改編)如圖為雜交瘤細胞制備示意圖。骨髓瘤細胞由于缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT－)，在HAT篩選培養(yǎng)液中不能正常合成DNA，無法生長。下列敘述錯誤的是A．可用滅活的仙臺病毒誘導細胞融合B．兩兩融合的細胞都能在HAT培養(yǎng)液中生長C．雜交瘤細胞需進一步篩選才能用于生產D．細胞膜的流動性是細胞融合的基礎√D、SDDD、SD、S5．Graves病(GD)可導致甲狀腺功能亢進。研究發(fā)現(xiàn)，GD患者甲狀腺細胞表面表達大量細胞間黏附分子1(ICAM－1)，導致甲狀腺腫大?？蒲腥藛T通過制備單克隆抗體，對治療GD進行了嘗試。(1)用ICAM－1作為抗原間隔多次免疫若干只小鼠，幾周后取這些免疫小鼠的血清，分別加入多孔培養(yǎng)板的不同孔中，多孔培養(yǎng)板中需加入____________以檢測這些小鼠產生的抗體。依據(jù)反應結果，選出抗原—抗體反應最____________(填“強”或“弱”)的培養(yǎng)孔所對應的小鼠M。ICAM－1強(2)取小鼠M的脾臟細胞制成細胞懸液，與實驗用骨髓瘤細胞進行融合，用選擇培養(yǎng)基篩選得到具有______________能力的細胞。核酸合成有兩個途徑，物質A可以阻斷其中的全合成途徑(如圖)。正常細胞內含有補救合成途徑所必需的轉化酶和激酶，制備單克隆抗體時選用的骨髓瘤細胞中缺乏轉化酶?？捎眉尤際、A、T三種物質的“HAT培養(yǎng)基”篩選出特定的雜交瘤細胞。無限增殖DS融合前將部分培養(yǎng)細胞置于含HAT的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一段時間后培養(yǎng)基中____________(填“有”或“無”)骨髓瘤細胞生長，說明培養(yǎng)基符合實驗要求。雜交瘤細胞可以在HAT培養(yǎng)基上大量增殖的原因是__________________________________。(3)將獲得的上述細胞在多孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)，用ICAM－1檢測，從中選擇_____________的雜交瘤細胞，將其植入小鼠腹腔中進行克隆培養(yǎng)，一段時間后從小鼠腹水中提取實驗用抗體。無雜交瘤細胞可以進行補救合成途徑大量產生抗ICAM－1抗體D途徑S途徑6．（2014新課標Ⅰ卷）某研究者用抗原（A）分別免疫3只同種小鼠（X、Y和Z），每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后測定各小鼠血清抗體的效價（能檢測出抗原抗體反應的血清最大稀釋倍數(shù)），結果如圖所示。若要制備雜交瘤細胞，需取免疫后小鼠的B淋巴細胞（染色體數(shù)目為40條），并將該細胞與體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細胞（染色體數(shù)目為60條）按一定比例加入試管中，再加入聚乙二醇誘導細胞融合，經篩選培養(yǎng)及抗體檢測，得到不斷分泌抗A抗體的雜交瘤細胞?；卮鹣铝袉栴}：①制備融合所需的B淋巴細胞時，所用免疫小鼠的血清抗體效價需達到16000以上，則小鼠最少需要經過_______次免疫后才能有符合要求的。達到要求的X、Y、Z這3只免疫小鼠中，最適合用于制備B淋巴細胞的是__________小鼠，理由是__________________________。4YY小鼠的血清抗體效價最高②細胞融合實驗完成后，融合體系中除含有未融合的細胞和雜交瘤細胞外，可能還有_______________________________________________________________，體系中出現(xiàn)多種類型細胞的原因是_____________________________________。③雜交瘤細胞中有_____個細胞核，染色體數(shù)目最多是_______條。④未融合的B淋巴細胞經過多次傳代培養(yǎng)后都不能存活，原因是___________________。B淋巴細胞相互融合形成的細胞、骨髓瘤細胞相互融且融合率達不到100%合形成的細胞細胞融合是隨機的，1100不能無限增殖7．(2020全國Ⅰ卷)為研制抗病毒A的單克隆抗體，某同學以小鼠甲為實驗材料設計了以下實驗流程。回答下列問題：(1)上述實驗前必須給小鼠甲注射病毒A，該處理的目的是_____________________________________________________。誘導小鼠甲產生能夠分泌抗病毒A抗體的B淋巴細胞《一輪復習講義》P365(3)為了得到能產生抗病毒A的單克隆抗體的雜交瘤細胞，需要進行篩選。圖中篩選1所采用的培養(yǎng)基屬于____________，使用該培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)的結果是_______________________。圖中篩選2含多次篩選，篩選所依據(jù)的基本原理是___________________________。(2)寫出以小鼠甲的脾臟為材料制備單細胞懸液的主要實驗步驟：___________________________________________________________________________________________。

取小鼠甲脾臟剪碎，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理使其分散成單個細胞，加入培養(yǎng)液制成單細胞懸液選擇培養(yǎng)基只有雜交瘤細胞能夠生存抗原與抗體的反應具有特異性8．“生物導彈”是免疫導向藥物的形象稱呼，由單克隆抗體與藥物結合而成，單克隆抗體的制備過程如圖所示。(1)若只考慮細胞兩兩融合，B過程會獲得

種類型的細胞。經特定選擇培養(yǎng)基篩選后，

和融合的

的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。

3具有同種核未融合的親本細胞(2)圖示過程生產出的單克隆抗體不能直接用于人體，理由是

。

(3)“生物導彈”中單克隆抗體的作用是

。

(4)除“生物導彈”外，請說出單克隆抗體在臨床上的其他應用(答出兩點)。

小鼠形成的抗體對人體來說是抗原，存在著排異反應將藥物定向運到靶細胞作為診斷試劑；單克隆抗體自身也能用于治療疾病。通過改造基因，將小鼠抗體上結合抗原的區(qū)域（即可變區(qū)）“嫁接”到人的抗體（即恒定區(qū)）上，經過這樣改造的抗體誘發(fā)免疫反應的強度就會減低很多?？贵w的人源化改造多克隆抗體單克隆抗體基因工程抗體蛋白質工程生產抗體CHO細胞科學家從某些無限增殖細胞的細胞質中分離出無限增殖調控基因（prG），可將prG基因導入能產生抗體的漿細胞中，導入prG基因的漿細胞具有的特點是