綠茶多糖的制備及其含量測定

綠茶多糖的制備及其含量測定【摘要】目的建立一種穩(wěn)定、簡便的綠茶多糖含量測定方法。方法采用精制綠茶多糖測得綠茶多糖對葡萄糖的換算因子后,樣品經(jīng)除雜處理后,用苯酚－硫酸法測定綠茶中多糖的含量。結(jié)果用此方法測定多糖的標準曲線,其相關系數(shù)為0.9997,平均回收率為99.62%,相對標準偏向為1.94%。結(jié)論該方法所需儀器簡單，操作方便,顯色穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，合適于綠茶及其制品的多糖含量的常規(guī)檢測?！娟P鍵詞】綠茶多糖提取苯酚－硫酸法PreparatinandDeterinatinfPlysaharidefrGreenTeaAbstrat:bjetiveTdevelpastableandsipleethdteasuretheplysaharideinGreenTea.ethdsAfterthenversineffiientfplysaharidefrGreenTeatgluseasbtained,thententfplysaharideaseasuredbyphenl-sulfuriaidethd.ResultsTherrelatineffiientfstandardurveas0.9997,thereveryrateas99.62%andRSDas1.94%.nlusinTheethdisnvenient,stableandaurate,hihanbeusedfrntentdeterinatinfplysaharidefrGreenTeaasellasit'srelatedprduts.Keyrds:GreenTea;Plysaharide;Extratin;Phenl-sulturiaidethd綠茶是歷史最早的茶類，又稱不發(fā)酵茶，以適宜茶樹新梢為原料，經(jīng)殺青、揉捻、枯燥等典型工藝過程制成。其干茶色澤和沖泡后的茶湯、葉底以綠色為主調(diào)，綠茶也因此得名。最新科學研究結(jié)果說明，綠茶中主要化學組成為咖啡因、茶多酚、茶多糖等，咖啡因是一種興奮劑,具有較好的鎮(zhèn)痛作用，咖啡因也是一種和緩的利尿劑,藥用上的咖啡因是頭痛鎮(zhèn)痛的一個組分,它可與麥角胺的酒石酸鹽結(jié)合起來治療偏頭痛［1］；茶多酚是一種新型的天然食品抗氧化劑,與抗壞血酸配合時,其抗氧化性能優(yōu)良，茶多酚也具有高效的抗癌、抗衰老、降血脂等一系列的藥理功能［2］；茶多糖具有降血糖、降血脂、降血壓及減慢心率、耐缺氧的作用，同時茶多糖在抗凝血、防血栓形成、保護血象和增強人體非特異性免疫功能方面均有明顯效果［3］，因此從綠茶中提取的多糖成分在開發(fā)降糖新藥和功能性食品方面有著廣闊的前景。綠茶多糖的含量測定對于提取原料的選擇及提取工藝的評價具有重要意義。本研究用精制綠茶多糖測得綠茶多糖對葡萄糖的換算因子，然后將經(jīng)95％乙醇浸泡處理后的綠茶用水提取多糖，采用苯酚－硫酸法測定其含量?，F(xiàn)報道如下。1材料與方法1.1材料核酸蛋白分析儀〔DU-640〕，Bekan公司；電熱恒溫水槽〔DK-8D型〕，上海森信實驗儀器；臺式冷凍離心機〔D-78532Tuttlingen,universal132R〕德國；Alphal-2型真空凍干機，德國hrist公司；自動收樣器，美國haters公司等;葡萄糖、苯酚〔分析純重蒸餾試劑〕、濃硫酸、95％乙醇、三氯甲烷、正丁醇、丙酮、乙醚、活性炭、聚酰胺吸附樹脂等，以上試劑均為分析純。白沙綠茶〔來自于海南白沙農(nóng)場〕。1.2方法1.2.1精制綠茶多糖的制備取枯燥綠茶20g，粉碎，過50目篩，用95％乙醇浸泡1d后，殘渣曬干，熱水浸提3次，過濾，合并濾液，加熱濃縮至總體積的1/4，將濃縮液離心，上清液中參加三倍體積的95％乙醇沉淀，4℃冷凍過夜，離心，殘渣用乙醚－丙酮－無水乙醇溶劑系統(tǒng)反復洗滌，然后將殘渣真空低溫枯燥得到綠茶多糖粗品。綠茶多糖粗品加水溶解，用Sevag法去蛋白［4］，然后將去蛋白多糖溶液上聚酰胺吸附樹脂，用蒸餾水洗脫，洗脫至洗脫液參加95%乙醇無沉淀為止。將洗脫液濃縮至一定體積，得精制綠茶多糖提取液。精制多糖提取液參加活性碳(固液比為1∶10)90℃脫色約2h，趁熱過濾，濾液濃縮至一定體積后，再用蒸餾水透析2d，低溫冷凍枯燥得精制綠茶多糖。稱重，計算得率，備用。1.2.26％苯酚溶液配制臨用前用80%苯酚溶液〔取重蒸餾苯酚80g加蒸餾水20g溶解，搖勻置棕色瓶，4℃保存〕加蒸餾水稀釋配制而成。1.2.3標準葡萄糖溶液的配制精細量取105℃枯燥至恒重的標準葡萄糖1000g,置于1000l量瓶中加水至刻度，配成1g/l的葡萄糖母體溶液，然后稀釋20倍，得到要用的50μg/l的葡萄糖標準溶液。1.2.4吸收波長選擇精細量取50μg/l標準葡萄糖溶液1l,置20l具塞試管中,依次參加6%苯酚溶液1.0l，濃硫酸5.0l,靜置10in后搖勻,室溫放置20in,以蒸餾水同法操作為空白對照，在波長400～600n之間進展掃描,確定最大吸收波長487n。1.2.5標準曲線制備［5］分別精細汲取50μg/l標準葡萄糖溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8l置具塞的試管中，各以水補至2.0l,依次參加6%苯酚溶液1.0l，濃硫酸5.0l,靜置10in后搖勻,室溫放置20in,以2.0l蒸餾水同法操作為空白對照,在487n波長處測定吸光度，以多糖濃度為橫坐標〔μg/l〕，光密度為縱坐標，繪制曲線，得回歸方程為：Y=0.0154X+0.0038,r=0.9997。1.2.6換算因素確定精細稱取枯燥至恒重的精制綠茶多糖約5g，置25l容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得綠茶多糖儲藏液。精細汲取該溶液2l，按“1.2.5〞項下的方法測定吸光度，以2.0l蒸餾水同法操作為空白對照。由回歸方程求出此綠茶多糖儲藏液中葡萄糖濃度，并計算其中葡萄糖含量。按下式計算換算因子：f=/·D〔為稱取精制綠茶多糖的重量(μg)，為綠茶多糖儲藏液中葡萄糖的濃度〔μg/l〕，D為精制綠茶多糖的稀釋倍數(shù)〕。1.2.7綠茶樣品中多糖含量測定樣品溶液制備：取樣品綠茶1g，精細稱定，粉碎，過50目篩，用95％乙醇浸泡1d后，殘渣曬干，熱水浸提3次，過濾，合并濾液，待冷后轉(zhuǎn)移于1000l容量瓶，加蒸餾水稀釋至刻度作供試品溶液。樣品中綠茶多糖含量測定：精細汲取所得樣品溶液2.0l于具塞試管中，按“1.2.5〞項下的方法測定吸光度，由回歸方程計算供試液中葡萄糖含量，按下式計算各樣品中多糖的含量。多糖含量=Df/×100％。式中：為樣品溶液中葡萄糖的含量，D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)，f為換算因子，為樣品重量。1.2.8穩(wěn)定性實驗精細量取樣品溶液2.0l，按“1.2.5〞項下的方法測定吸光度，每隔30in測1次，連續(xù)3h考察其穩(wěn)定性。1.2.9重現(xiàn)性實驗精細稱取同批綠茶樣品5份各1g，按“1.2.7〞項下的方法同時制取5份樣品溶液。精細汲取樣品溶液2.0l，分別置于10l具塞刻度試管中，按“1.2.5〞項下的方法測定吸光度，計算多糖的含量。1.2.10回收率實驗取綠茶樣品6份，每份約0.5g，精細稱定，精細參加精制多糖20g，然后按“1.2.7〞樣品液的制備和“1.2.5〞標準曲線項下方法測定吸光度，根據(jù)“1.2.9〞的結(jié)果該批綠茶中多糖的平均含量為3.48%，計算回收率。2結(jié)果2.1精制綠茶多糖的得率20g枯燥的綠茶按“1.2.1〞方法制得精制綠茶多糖0.51g，得率為2.55%。2.2換算因子f=1.26。2.3穩(wěn)定性實驗樣品溶液在3h內(nèi)顯色穩(wěn)定，結(jié)果見表1。RSD=1.31%〔n=7〕。表1綠茶多糖含量測定穩(wěn)定性實驗結(jié)果〔略〕2.4重現(xiàn)性實驗以同批綠茶為樣品測定多糖的含量，檢驗此測定方法的重現(xiàn)性，結(jié)果見表2。RSD=1.69%(n=5)。2.5回收率實驗精細汲取含量的綠茶5份，測定加樣回收率，結(jié)果見表2。表2多糖重現(xiàn)性實驗〔略〕3結(jié)論苯酚-硫酸比色法測定多糖含量是由Dubis等［6，7］提出的。其原理是：多糖或寡糖被濃硫酸在適當高溫下水解，產(chǎn)生單糖，并迅速脫水成糠醛衍生物，該衍生物在強酸條件下與苯酚起顯色反響，生成橙黃色物質(zhì)，在波長490n左右處和一定濃度范圍內(nèi)，其吸光度A值與糖濃度呈線性關系，從而可用比色法測定其含量。本法簡單，顯色穩(wěn)定，靈敏度高，重現(xiàn)性好。表3多糖加樣回收率實驗〔略〕利用精制綠茶多糖測定并計算換算因子，再利用換算因子計算綠茶多糖含量，可有效消除用葡萄糖標準曲線計算多糖含量而帶來的誤差。加樣回收率實驗的結(jié)果說明，采用此方法測定綠茶多糖含量，平均回收率高達〔99.62±1.93〕%，RSD=1.94%。我國是茶葉消費大國,特別是綠茶占了相當大的比例,但目前中低檔綠茶嚴重滯銷，因此，深化開展綠茶多糖的研究有著重大的意義,不僅有利于茶葉資源的充分利用,而且對預防疾并促進安康都有積極作用，隨著綠茶研究的不斷深化，從綠茶中提取的多糖有望成為一些疾病的重要治療藥品和功能食品。【參考文獻】［1］關崇新.茶葉中咖啡因含量的測定［J］.鞍山師范學院學報,2001,3(3):45.［2］Nutraner.綠茶是一種抗氧化劑［J］.國外醫(yī)學中醫(yī)中藥分冊,2001,23(3):191.［3］嚴鴻德，汪東風，王澤農(nóng)，等.茶葉深加工技術［］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1998：81.［4］齊慧玲，魏紹云，王繼倫.等.Sevag法去除白及多糖中蛋白的研究［J］.天津化工，2000，3：20.［5］張惟杰.復合多糖生化研究技術［］.上海：上海科學技術出