細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)3課件

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理細(xì)胞培養(yǎng)：模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在適當(dāng)?shù)臈l件下，使活體組織細(xì)胞在體外環(huán)境存活、生長(zhǎng)增殖，借以觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、衰老等生命現(xiàn)象。

貼壁型細(xì)胞：

必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞。懸浮型細(xì)胞：于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面，見于某些癌細(xì)胞和血液淋巴細(xì)胞。1.培養(yǎng)細(xì)胞的分類：

成纖維細(xì)胞型胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀、火焰狀、漩渦狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌細(xì)胞等等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱之為成纖維細(xì)胞。血管平滑肌細(xì)胞

上皮型細(xì)胞細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜，生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。游走細(xì)胞型在支持物上呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。

多型細(xì)胞型有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)來自血，脾或骨髓在懸浮中生長(zhǎng)良好，細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)觀察不方便懸浮型細(xì)胞特點(diǎn)：懸浮型細(xì)胞2.培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過程

單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程：細(xì)胞周期培養(yǎng)細(xì)胞生命期所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。傳代期：

初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。衰退期：

此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性或惡性性。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系，也稱連續(xù)細(xì)胞系。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。潛伏期：

細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，約24～96小時(shí)或更長(zhǎng)，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅6～24小時(shí)；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。指數(shù)增生期：

是細(xì)胞增生最活躍、活力最旺盛的階段。培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng),細(xì)胞群體均一，是理想的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長(zhǎng)空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。停滯期：

細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺(tái)期。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時(shí)需傳代做分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。壓力蒸汽消毒鍋：濕熱消毒，用途廣。濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用孔徑小于0.22m的濾膜過濾。

超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境。紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒。

無污染(無菌)環(huán)境基質(zhì)(支持物)玻璃基質(zhì)塑料基質(zhì)氣體環(huán)境、溫度、濕度CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-CO2:5%溫度：37oCpH值控制平衡鹽溶液：PBS，Hank’s，D-hank’s(無鈣鎂；離子)等。培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基(如血清)；合成培養(yǎng)基(如市售DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基)。合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基(如血清)。水：新鮮配置的三蒸水或去離子水。液相環(huán)境二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會(huì)導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊和完全可靠。1.無菌操作技術(shù)

培養(yǎng)前準(zhǔn)備

在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。

為了做好培養(yǎng)前準(zhǔn)備工作，宜制定出分門別類的操作卡片，包括操作程序卡片；如“分裝血清”、“原代培養(yǎng)”、“傳代培養(yǎng)”、等等。各卡片上記有需用器材和物品名稱、要求及數(shù)量等，這對(duì)初學(xué)者尤為重要。這樣做的好處是實(shí)驗(yàn)者可按卡片收集所用物品，清點(diǎn)無誤后，把用品放置于操作場(chǎng)地，然后進(jìn)行消毒，可避免操作開始后，因物品不全在往返拿取時(shí)增加污染機(jī)會(huì)。培養(yǎng)室的消毒

無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min?！┎僮饔镁呷缫埔浩?、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。

洗手和著裝

原則上和外科手術(shù)相同。并于開始操作前要用75％酒精消毒手和前臂。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。培養(yǎng)過程中的無菌操作

在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。為便于拿送用品，工作臺(tái)面上的用品要有合理的布局；原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以免打翻東西。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。培養(yǎng)過程中的無菌操作

工作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在末做處理之前，勿過早暴露在空氣中。培養(yǎng)液在末用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口。吸取培養(yǎng)基、PBS、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。工作中不能面向操作野講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。2.基本培養(yǎng)操作技術(shù)

原代培養(yǎng)

用直接從機(jī)體獲得的細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。這種培養(yǎng)過程主要是采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動(dòng)物體內(nèi)取出，經(jīng)酶消化處理，使分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長(zhǎng)和繁殖。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步。動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)過程圖

傳代細(xì)胞培養(yǎng)

離體培養(yǎng)的細(xì)胞群體增殖達(dá)到一定密度時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂速度就會(huì)減慢甚至停止，如不及時(shí)分離傳代培養(yǎng)，細(xì)胞將逐漸衰老死亡。傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化，把細(xì)胞分散成單細(xì)胞再傳代，而懸浮型生長(zhǎng)細(xì)胞則用直接傳代法或離心法傳代?！N壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法與步驟（1）選取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，在超凈工作臺(tái)的酒精燈旁，倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入2～3ml的PBS液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞，以除去懸浮在細(xì)胞表面的碎片。（2）加入1.5mL0.25％胰蛋白酶消化液(玻璃培養(yǎng)瓶)，37℃消化2～3min，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時(shí)，倒去酶液(若消化過度，可不倒去酶液)。（3）用PBS液洗滌1次(可省略)，加入3mL培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其成細(xì)胞懸液。（4）細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以1：2或1：3進(jìn)行分裝(或以適當(dāng)密度接種于培養(yǎng)板進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn))，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，注明代號(hào)、日期，輕輕搖勻，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（5）觀察：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可觀察培養(yǎng)液的顏色及細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。細(xì)胞計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞a.將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。b.將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，注意蓋片下不要有氣泡c.鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按公式計(jì)算：

細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×104注意：鏡下偶見有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度，并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。3.細(xì)胞培養(yǎng)的污染、檢測(cè)與控制

微生物污染空氣、器材、操作、試劑、組織標(biāo)本微生物污染的檢測(cè)細(xì)菌和真菌的污染和檢測(cè)肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法支原體的污染和檢測(cè)造成支原體高污染率的原因：1.支原體大小0.1－0.8um，無細(xì)胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45um）；

2.支原體污染時(shí)，沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化；

3.過去缺乏簡(jiǎn)單、快速且可靠的檢測(cè)方式；

4.細(xì)胞流通間缺乏物品管理，造成實(shí)驗(yàn)室間的相互污染；

5.研究或操作人員忽略污染問題；6.已受污染的細(xì)胞；

7.已受污染的培養(yǎng)基、血清。支原體之檢測(cè)：

相差顯微鏡觀察法、電鏡法Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNA熒光染色法

PCR方法微生物污染的控制抗生素除菌法加溫處理細(xì)胞培養(yǎng)常見問題解答培養(yǎng)液pH值變化太快CO2張力不對(duì)培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊松開瓶蓋1/4圈NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度

細(xì)菌、酵母或真菌污染丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時(shí)pH發(fā)生變化細(xì)菌或真菌污染丟棄培養(yǎng)物抗生素除菌培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁胰蛋白酶消化過度縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度支原體污染分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔