rna轉(zhuǎn)錄后的加工與修飾

-.z.第二節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄后的加工與修飾不論原核或真核生物的rRNAs都是以更為復(fù)雜的初級轉(zhuǎn)錄本形式被合成的，然后再加工成為成熟的RNA分子。然而絕大多數(shù)原核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯是同時進行的，隨著mRNA開始的DNA上合成，核蛋白體即附著在mRNA上并以其為模板進行蛋白質(zhì)的合成，因此原核細胞的mRNA并無特殊的轉(zhuǎn)錄后加工過程，相反，真核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯在時間和空間上是分天的，剛轉(zhuǎn)錄出來的mRNA是分子很大的前體，即核內(nèi)不均一RNA。hnRNA分子中大約只有10%的部分轉(zhuǎn)變成成熟的mRNA，其余部分將在轉(zhuǎn)錄后的加工過程中被降解掉。（一）mRNA的加工修飾原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為多順反子，即幾個結(jié)構(gòu)基因，利用共同的啟動子和共同終止信號經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，所以此mRNA分子編碼幾種不同的蛋白質(zhì)。例如乳糖操縱子上的Z、Y及A基因，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可翻譯生成三種酶，即半乳糖苷酶，透過酶和乙?；D(zhuǎn)移酶。原核生物中沒有核模，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是連續(xù)進行的，往往轉(zhuǎn)錄還未完成，翻譯已經(jīng)開始了，因此原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA沒有特殊的轉(zhuǎn)錄后加工修飾過程。真核生物轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為單順反子，即一個mRNA分子只為一種蛋白質(zhì)分子編碼。真核生物mRNA的加工修飾，主要包括對5’端和3’端的修飾以及對中間部分進行剪接。1．在5’端加帽成熟的真核生物mRNA，其結(jié)構(gòu)的5’端都有一個m7G-PPNmN結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被稱為甲基鳥苷的帽子。如圖17-9所示。鳥苷通過5’-5’焦磷酸鍵與初級轉(zhuǎn)錄物的5’端相連。當(dāng)鳥苷上第7位碳原子被甲基化形成m7G-PPNmN時，此時形成的帽子被稱為"帽0”，如果附m7G-PPNmN外，這個核糖的第"2”號碳上也甲基化，形成m7G-PPNm，稱為"帽1”，如果5’末端N1和N2中的兩個核糖均甲基化，成為m7G-PPNmPNm2，稱為"帽2”。從真核生物帽子結(jié)構(gòu)形成的復(fù)雜可以看出，生物進化程度越高，其帽子結(jié)構(gòu)越復(fù)雜。圖17-9Post-transcriptionalmodificationofmRNashowingthe7-methylguanosinecapandpoly-Atail.真核生物mRNA5’端帽子結(jié)構(gòu)的重要性在于它是mRNa做為翻譯起始的必要的結(jié)構(gòu)，對核糖體對mRNA的識別提供了信號，這種帽子結(jié)構(gòu)還可能增加mRNA的穩(wěn)定性，保護mRNa免遭5’外切核酸酶的攻擊。2．在3’端加尾大多數(shù)的真核mRNA都有3’端的多聚尾巴（A)，多聚（A)尾巴大約為200bp。多聚（A)屠巴不是由DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄后在核內(nèi)加上去的。受polyA聚合酶催化，該酶能識別，mRNa的游離3’-OH端，并加上約200個A殘基。近年來已知，在大多數(shù)真核基因的3’一端有一個AATAA序列，這個序列是mRNa3’-端加polyA尾的信號。靠核酸酶在此信號下游10-15堿基外切斷磷酸二酯鍵，在polyA聚合酶催化下，在3’-OH上逐一引入100-200個A堿基。關(guān)于polyA尾巴的功能問題盡管經(jīng)過極其廣泛的探索，但還不完全清楚。有人推測polyA可能與mRNA從細胞核轉(zhuǎn)送到細胞質(zhì)有關(guān)，但是相當(dāng)數(shù)量，的沒有polyA屠巴的mRNA如組蛋白mRNA，也照樣通過核膜進入細胞質(zhì)。還有人認為這種結(jié)構(gòu)對真核mRNA的翻譯效率具有*種作用，并能穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)，保持一定的生物半衰期。3.mRNA前體（hnRNA）的拼接原核生物的結(jié)構(gòu)基因是連續(xù)編碼序列，而真核生物基因往往是斷裂基因，即編碼一個蛋白質(zhì)分子的核苷酸序列被多個插入片斷所隔開，一個真核生物結(jié)構(gòu)基因中內(nèi)含子的數(shù)量，往往與這個基因的大小有關(guān)，例如胰島素是一個很小的蛋白質(zhì)，它結(jié)構(gòu)基因只有兩個內(nèi)含子，而有些很大的蛋白質(zhì)，它的結(jié)構(gòu)基因中可以有幾十個內(nèi)含子。經(jīng)過復(fù)雜的過程后，切去內(nèi)元，將有編碼意義的核苷酸片段（E*tron外元也叫外顯子）連接起來（圖17-10）。圖17-10Primarypolymerase11transcriptofaeukaryotegeneshowing(a)intronsaftercappingandadditionofpolyAtail.(b)E*cisionofintronstoformthematuremRNAiscalledsplicing.真核生物的結(jié)構(gòu)的基因中具有可表達活性的外顯子，也含有無表達活性的內(nèi)含子，但內(nèi)含子序列下是無意義的，越來越多的實驗證明有許多基因中的內(nèi)含子參與基因表達調(diào)控，在轉(zhuǎn)錄時，外顯子及內(nèi)含子均轉(zhuǎn)錄到hnRNA中。在細胞核中hnRNA進行剪接作用，首先在核酸內(nèi)切酶作用下剪切掉內(nèi)含子；然后在連接酶作用下，將外顯子各部分連接起來，而變?yōu)槌墒斓膍RNA，這就是剪接作用，也有少數(shù)基因的hnRNA不需進行剪接作用，例如α-干擾素基因，圖17-11以卵清蛋白基因為例，介紹一個典型的轉(zhuǎn)錄及加工過程。圖17-11卵清蛋白基因轉(zhuǎn)錄及加工過程圖中外顯示以1、2、3、4……表示，內(nèi)含子以A、B、C、D…表示mRNA的拼接，需要在拼接部位有供拼接識別的保守性強的一致順序，通過對100多種真核細胞基因的分析，發(fā)現(xiàn)外元和內(nèi)元拼接部位部分堿基順序有一定的規(guī)律（見表17-4）。表17－4含有內(nèi)元的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物其拼接處的堿基順序基因區(qū)域E*onIntronE*on卵清蛋白內(nèi)元2UAAGGUGA～～～～～～～ACAGGUUG卵清蛋白內(nèi)元3UCAGGUAC～～～～～～～UCAGUCUGβ-珠蛋白內(nèi)元1GCAGGUUG～～～～～～～UCAGGCUGβ-珠蛋白內(nèi)元2CAGGGUGA～～～～～～～ACAGUCUCIgλ內(nèi)含子1UCAGGUCA～～～～～～～GCAGGGGCSV40病毒早期T抗原UAAGGUAA～～～～～～～UUAGAUUC表中劃線的堿基對拼接識別有重要作用，如將兔的β-珠蛋白的拼接部位的GT改為AT后，拼接反應(yīng)即受到影響。mRNA前體拼機制圖17-12TheRNAsplicingmechanism.RNAsplicingiscatalyzedbyaspliceosomeformedfromtheassemblyofU1,U2,U5,andsnRNPs(shownasgreencircles)plusothercomponents(notshown).Afterassemblyofthespliceosome,thereactionoccuresintwospeps:instep1thebranch-pointAnucleotideintheintronsequence,whichislocatedcolsetothe3'splicesite,attacksthe5'splicesiteandcleavesit;thecut5'endoftheintronsequencetherebybecomescovalentlylinkedtothisAnucleotide,formingthebranchednucleotideshowninFigure8-55.Instep2the3'-OHendofthefirste*onsequence,whichwascreatedinthefirststep,addstothebeginningoftheseconde*onsequence,cleqvingtheRNAmoleculeatthe3'splicesite;thetwoe*onsequencesaretherebyjoinedtoeachotherandtheintronsequenceisreleasedadaribosone.ThesesplicingreactionsoccurimthenucleusandgengeratemRNamoleculesfromprimaryRNAtranscripts(mRNAprecursormolecules).mRNA拼接反應(yīng)需要有核內(nèi)小分子RNA參與它們與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物稱為小核糖核蛋白顆粒，SnRNA分別被命名為U1,U2,U3,U4,U5,和U6RNA。SnRNA中的U2RNA由與內(nèi)元右端拼接部位附近的UACUAA順序高度互補，形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由特定的酶來識別切除該環(huán)狀結(jié)構(gòu)，完成拼接過程，如圖17-12所示。圖17-13MechanimofmRNasplicing.Notethat,forclarity,theprocessisshownintwostages;energyisnotrequiredfortheprocesssincetransesterificationreactionsareinvolved.真核生物mRNA前體在剪接過程中，還可以形成套索樣的結(jié)構(gòu)，在內(nèi)含子序列中常有一個分支部位的腺苷酸殘基，它的2’-OH可以自動攻擊內(nèi)含子5’端與外顯子1連接的磷酸二酯鍵，切開了外噗子1，而腺苷酸原來已有3’，5’--磷酸二酯鍵相連的兩個相鄰的核苷酸殘基，加上此3’，5’-磷酸二酯鍵連接后，在腺苷酸處出現(xiàn)了一個套索，已被切下的外顯子1的3’-OH攻擊內(nèi)含子3’末端與外顯子2之間的3’，5’-磷酸二酯鍵，鍵斷裂后，內(nèi)含子以套索的形式被節(jié)下來，此時外顯子1和外顯子2可以連接起來（圖17-13）。不論拼接過程如何，拼接必須極為精確，否則會導(dǎo)致遺傳信息傳遞障礙，合成的蛋白質(zhì)可能喪失其正常的功能。我國南方廣大地區(qū)是β-地中海貧血的高發(fā)區(qū)，這是由于β-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制所引起的一種血紅蛋白病。實驗表明β-珠蛋白基因元1中核苷酸的點突變改變了正常拼接部位的堿基順序，結(jié)果造成錯誤部位的拼接。加工成熟的mRNA雖能翻譯，但產(chǎn)物不是正常的β-珠蛋白，結(jié)果引起血紅蛋白級結(jié)構(gòu)和功能的改變。（二）rRNA轉(zhuǎn)錄后加工原核生物rRNA轉(zhuǎn)錄后加工，包括以下幾方面：①rRNA前體被大腸桿菌RNaseⅢ,RNaseE等剪切成一定鏈長的rRNA分子；②rRNA在修飾酶催化下進行堿基修飾；③rRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體的大、小亞基（見圖17-14）圖17-14大腸桿菌rRNA前體的加工真核生物rRNA前體比原核生物大，哺乳動物的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為45s，低等真核生物的rRNA前體為38s，真核生物5sRNA前體獨立于其他三種rRNA的基因轉(zhuǎn)錄（圖17-15)。圖17-15真核生物rRNA前體的加工真核生物rRNA前體中含有插入順序，rRNA前體要形成成熟的rRNA，需要經(jīng)過拼接反應(yīng)。例如，四膜蟲的rRNA前體的拼接是一種無酶催化的自動拼接過程。四膜蟲基因組內(nèi)，26srRNA編碼的區(qū)域內(nèi)有413bp的插入順序。該插放序列可以不消耗能量從rRNA前體中被除掉。用SDS煮沸和用蛋白酶外理等破壞酶活性辦法，都不能破壞拼接活性，但反應(yīng)中Mg2+和鳥嘌呤核苷酸是必在的。用32P-GTP進行追蹤實驗表明，起始過程是GTP在插入順序5’端發(fā)生親核反應(yīng)，同時GMP與5’端切點的切除段形成磷酸二酯鍵并使原RNA斷開。第二步是5’切點的外元3’-OH與3’切點的外元5’-P共價連接，獲得成熟的rRNA，被切除部分最后環(huán)化，形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，同時從5’端去掉一個15核苷酸啐片。剩余部分連接成399核苷酸的環(huán)狀產(chǎn)物，再經(jīng)過幾步，最后切下一個19個核苷酸的線性內(nèi)含子序列即L-19，它具有催化活性，上面的剪接作用，是由內(nèi)含子本身的催化性質(zhì)決定的（圖17-16）。圖17-16四膜蟲rRNA前體的自我剪接這種rRNA的自身剪接反應(yīng)給人們一個提示：即RNA分子也有酶的催化活性。這向酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)這一傳統(tǒng)概念提出了挑戰(zhàn)。這種有酶催化活性的RNA分子命名為Ribozyme。T.Cech和S.Altman各自分別發(fā)現(xiàn)RNA具有催化作用，他們的發(fā)現(xiàn)對于了解生命進行過程有重要意義。很可能在原始生命中，RNA所催化的斷裂一連接反應(yīng)是最早出現(xiàn)的催化過程。為此，他們共同獲得了1989年Nobel化學(xué)獎。從大多數(shù)Ribozymw的結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)一些特征，例如：錘頭狀結(jié)構(gòu)的RNA分子有13個保守的核苷酸序列，如果它們中的堿基改變會使這種催化活性失去作用。根據(jù)這種特片，科學(xué)家們在體外沒計并人工合成這種RNA分子，用于抗腫瘤及抗病毒的實驗中（圖17-17）。圖17-17錘頭結(jié)構(gòu)模式圖（三）tRNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾原核生物和