絲狀真菌基因組DNA的提取

打開ClustalX軟件（對序列進(jìn)行比對），點(diǎn)擊''文件〃一''載入序列〃；點(diǎn)擊''比對”一''輸出格式選項(xiàng)〃J'phylip格式〃前打勾；點(diǎn)擊''比對〃一''完全比對〃；比對完成后，關(guān)閉程序，并將生成的帶.phy后綴的文件拷貝至phylip軟件包的、'exe"文件夾下。打開seqboot軟件，按照路徑輸入所拷貝的、'.phy"文件，回車輸入、'r",回車一輸入1000,回車一輸入、'y",回車一輸入、5",回車一出現(xiàn)'pressentertoquit"字樣時(shí)，回車，退出程序，完成seqboot（上圖中的J選項(xiàng)代表評估方法,默認(rèn)為bootstrap法進(jìn)行評估,可更改選項(xiàng);R選項(xiàng)默認(rèn)多少次，輸入1000表示共進(jìn)行1000次的republicate）。自動(dòng)生成文件''outfile"，可用記事本打開。將剛剛生成的outfile文件更名為infile1，打開dnadist軟件（采用鄰位相連算法構(gòu)建進(jìn)化樹，如采用其他算法，則用其他軟件），按照路徑輸入文件名infile1，回車輸入t,回車一輸入20,回車一輸入m,回車一輸入d,回車一輸入1000,回車一輸入y,回車一等待……等待……等待……時(shí)間長度視序列多寡長短及重復(fù)數(shù)多寡而不等，直到出現(xiàn)''pressentertoquit"字樣時(shí)，回車，退出程序（D選項(xiàng)為距離模式，默認(rèn)為F84；T選項(xiàng)為點(diǎn)突變的''轉(zhuǎn)換/顛換比率〃，通常在15?30之間；M選項(xiàng)采用和原來一樣的重復(fù)數(shù)；輸入d,采用datasets）。自動(dòng)生成文件outfile。將outfile重命名為infile2,打開neighnor軟件（采用鄰位算法），按照路徑輸入infile2,回車輸入選項(xiàng)m,回車一輸入1000,回車一輸入奇數(shù)5,回車一輸入y,回車一等待……一定時(shí)間后出現(xiàn)''pressentertoquit字樣時(shí)，回車，退出程序。生成兩個(gè)文件outfile和outtree。Outfile是分析結(jié)果的輸出報(bào)告，可用記事本打開，outtree可用treeview打開。8.將outfile更名為outfile1,outtree文件更名為intree1，打開consense軟件，按照路徑輸入intree1,回車9.輸入y,回車一等待......一定時(shí)間后出現(xiàn)''pressentertoquit"字樣時(shí)，回車，退出程序。生成兩個(gè)新文件outfile和outtree。Outtree就是最終結(jié)果，可用treeview軟件打開觀看絲狀真菌基因組DNA的提?。–TAB法）—取幼嫩的菌絲體，用液氮研成粉末，每0.8g裝入10mL的離心管中；一預(yù)熱1.5XCTAB到95°C,加2mL到裝有菌絲粉末的離心管中，混勻；一立即置于65C水浴30min,每分鐘，上下顛倒1次；一12000g離心5分鐘；一 吸取上清液，加等體積的氯仿，上下顛倒數(shù)次；12000 g離心 5分鐘；一 吸取上清液，加等體積的酚，上下顛倒數(shù)次；12000g 離心5 分鐘；一 吸取上清液，加等體積的氯仿，上下顛倒數(shù)次；12000 g離心 5分鐘；一取上清，加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的10MNH4Ac，混勻，室溫放置10min；一12000g離心10分鐘，去上清，用75%乙醇洗沉淀，自然干燥；一加100uL的TE或無菌水。樓主，我也是做真菌轉(zhuǎn)化的，有好的東西一起分享哈O（G_G）O~中文有很多呀，微生物學(xué)報(bào)，菌物學(xué)報(bào)，微生物通報(bào)等！英文的有：Mycotaxon（0.5左右）、studiesinmycology（9.03左右）詳見如下：/sci2010/smallclass/真菌學(xué).htmlITS區(qū)域，內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)間，是一段比較保守的區(qū)域，長度一般為700~800bp。一般PCR得到的ITS區(qū)域，測得序列在NCBI上BLAST后一般可以確定到屬一級，但是一般應(yīng)輔助以形態(tài)學(xué)鑒定才較為可靠。用不用載體取決于你的實(shí)驗(yàn)室得到純化后的真菌遺傳指針信息然后送交測序公司即可（但是像上海生工這樣的公司會(huì)要求你的DNA的濃度為OD260/OD280到1.8至2.0而且要你提供引物如果是經(jīng)典的比如18S等的則不要否則經(jīng)常會(huì)測不出信號如果實(shí)驗(yàn)室錢多那就送到TaKaRa日本人的服務(wù)很全面而且質(zhì)量可靠但是價(jià)錢奇貴）如果你們實(shí)驗(yàn)室做載體連接比較多那就連個(gè)載體再送出去測序同樣也要提供引物但這樣的話可能會(huì)便宜一點(diǎn)但是這樣就將測序的一部分風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)嫁到你自己的因素上了所以這完全取決于你的選擇了祝你好運(yùn)不用連接，讓測序公司電泳回收，直接把PCR產(chǎn)物送測，省時(shí)省力省錢，四天后能得到結(jié)果。這樣的帖子這幾天有三張，加上以前的就更多了，樓主發(fā)帖之前先站內(nèi)搜索一下就明白了，省力得多。不過樓主是昨天才加入的新人，以后會(huì)學(xué)會(huì)這招的。因?yàn)镻CR可能有非特異性擴(kuò)增，造成除了目的條帶之外還有干擾條帶產(chǎn)生，他們都是用同一對引物擴(kuò)增得來的，所以在測定序列的時(shí)候會(huì)在同一個(gè)堿基的位置上出現(xiàn)兩個(gè)堿基反應(yīng)同等強(qiáng)度，不知道正確的序列中應(yīng)該是其中的哪一個(gè)，所以為了保證產(chǎn)物純度，最保險(xiǎn)的方法就是將PCR產(chǎn)物跑電泳，回收預(yù)計(jì)大小的條帶。我以前是在有雜帶時(shí)就會(huì)回收才送測，現(xiàn)在是寫明目的條帶在哪里，直接將PCR產(chǎn)物送測，讓他們回收?；ㄙM(fèi)是稍微多一點(diǎn)，但我的樣品有二十幾個(gè)，一個(gè)人回收要很久，公司人多，這樣我得到結(jié)果就快得多。問一下，我想構(gòu)建16srRNA基因文庫。DNA提取、PCR擴(kuò)增（引物27f，1492r，產(chǎn)生片段約1500bp）純化都沒有問題，連接載體pMDT19，連接后轉(zhuǎn)化、涂布平板有單克隆出來，但做菌落PCR時(shí)最多只有200bp的結(jié)果出來，是什么原因呢？構(gòu)建另外一個(gè)目的基因克隆文庫，同樣的操作步驟，只是另外一對引物擴(kuò)增出的是500bp產(chǎn)物，克隆后菌落pcr能夠成功。我們實(shí)驗(yàn)室自行篩選了一株纖維素產(chǎn)生菌，經(jīng)過高靜水壓誘變后得到了一株纖維素產(chǎn)量極高的突變株（纖維素產(chǎn)量是出發(fā)株的3倍多，也是目前資料報(bào)道中最高產(chǎn)的）。我把突變株的形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)和系統(tǒng)發(fā)育都做了，根據(jù)結(jié)果對菌株做了分類鑒定。應(yīng)老師要求，我將材料整理出來寫成文章，沒想到投了許多期刊，都以“研究內(nèi)容不在本刊收錄范圍，建議另投他刊〃。很郁悶?zāi)?！我是第一次投SCI，沒有投稿經(jīng)驗(yàn)，導(dǎo)師不懂微生物，更沒有投稿經(jīng)驗(yàn)。在這里，求助各位高人給予指點(diǎn)，這類菌種描述和分類的文章該投哪些期刊？FungalDiversity/fdp/fdp.htmInternationalJournalofSystematicBacteriology分形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定一般二者結(jié)合起來形態(tài)學(xué)一般都會(huì)參考一些資料，具體的圖片描述什么的分子鑒定要設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR鑒定怎么純化霉菌？我從植物中篩菌，但挑去菌絲后劃線，一個(gè)平板中有3種菌落的樣子，最表面是白色鋪滿的一層，背面看，還有橘紅色和青色的塊狀物。我該怎么分離出這三種？還有一般的純化霉菌的方法是什么？（求詳解）非常感謝！無菌生理鹽水無菌沖洗平板，稀釋，取樣涂布平板形成單菌落鏡檢觀察即可！具體梯度可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定！真菌DNA提取的方法CTAB法提取步驟：⑴在7mL離心管中加入65°C預(yù)熱的抽提液2.5mL。⑵加入1g樣品液氮研磨，加入巰基乙醇50pL,上下震蕩，使蛋白質(zhì)變性沉淀，65C水浴1h,每隔10min顛倒混勻一次。⑶加入等體積（約3mL）的氯仿/異戊醇（24/1）混勻，除去蛋白質(zhì),4C平衡離心，lOOOOrpm,10min。（4） 取上清（約2.5mL）到7mL管，加1/5體積（約0.5mL）65C預(yù)熱的CTAB/NaCl混勻，加入2mL的氯仿/異戊醇（24/1）混勻，4C平衡離心，10000rpm,10min。（5） 取上清，加等體積（約3mL）的CTAB沉淀液，顛倒混勻。65C水浴30min至沉淀可見。4C平衡離心，10000rpm,10min后小心去上清。⑹沉淀用TE(0.5mL)溶解，加入等體積(約0.5mL)的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提，4°C平衡離心，lOOOOrpm,10min。⑺取上清加入2倍體積的無水乙醇(1mL),再加入1/10體積的NaAC(pH5.2)約0.1mL。⑻-20C冰箱1h,4C平衡離心，12000rpm,10min,棄上清，用70%酒精清洗2次，濾紙吸去多余水分，超凈臺(tái)吹干。(9)0.05mLTE溶解，-20C保存。我個(gè)人覺得SDS方法比較好，收集菌絲后加入鋼珠，加入抽提液等，在渦旋儀上振蕩，……，也能提取出不錯(cuò)的DNA。CTAB、SDS法提都可以，我都提過，質(zhì)量很好加玻璃珠+酚：氯仿：異戊醇，震蕩五-十分鐘效果也不錯(cuò)94C5min;94C30S，XXC30S，72C50S(660bp50S足以)(25-30cycles);72C7minMostStableCrossMostStableCrossDimeSG=-4.9[kcals-MDl]上圖是用primer5.0設(shè)計(jì)的上游引物出現(xiàn)的crossprimer的AG數(shù)值。請問這個(gè)引物能用嗎?能不能用只有試了才知道，不要迷信軟件，盡量選評分高的，數(shù)值不超過5一般還是可以的看文獻(xiàn)的聚類分析圖，不知道是如何作出來的?還有上面的數(shù)字是怎么標(biāo)上去的?有序列，有軟件，但我就是做不出那個(gè)樣子的圖來。如《番茄葉霉菌拮抗放線菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件研究》這篇文章里的聚類分析圖，請問大蝦們這圖是怎么做出來的。先謝謝大家了。這個(gè)是如下：

一￡purpura曲MiQT.—S. BPS2.—S.cctnii^rtibidiliDSAf4&J43T.—Mci論翊tlMHtif1-C-A4&T.—工rtaeafiaviliATCC19910.-S.c^cniorlfSM^^一囂加諭hzjE鬧fJ腫卻.一￡如曲應(yīng)郴諭￡）SMJQ^Sr—$r伽皿曲“怦肆gATCC 曲.—5.iongisporui7>Sj4JJfli66T.一匚沁邨氏站亍一-5.jn^UrriDSM4}?劉玖—&srtfwartiaii:￡>S）fJWJT-—5.助疔牠評H柑血RL2940T.—￡tnmkxicni^sDSM4Q22]T.-S,aibn^sMF^I-CJ.-眾鞠wm祈型和京￡刖Q馭—5； NRRLB-J223-iT^一S.ytu^txisDSM417^1T.taatrifspfirmDSM4S^^T.—￡ctadtys1CM492ST.—耳.thtrfittitintflfaxJl^'iVJJJj/I.■^Bncillifrsp.”圖34描抗菌BPS2的16SrDNA及其典型鏈霉菌同源基因聚數(shù)字不是標(biāo)上去的大哥，數(shù)字是利用NJ法構(gòu)樹的時(shí)候自動(dòng)生成的，其意義類似于置信區(qū)間這樣的一個(gè)概念，往往50%以下的部分都不要的。用幾個(gè)軟件結(jié)合起來做效果挺好的。先用DNAMAN比對修飾序列后，在用CLUSTER生成序列文件，最后在MEGA中生成系統(tǒng)樹。你所說的數(shù)字并不是自己標(biāo)上去的，而是在MEGA中自舉檢驗(yàn)?zāi)闼龅南到y(tǒng)樹的置信度后所反映的值。用MEGA軟件建樹時(shí)使用Bootstrap檢驗(yàn)，可生成打分16srDNA怎么在ncbi上查詢細(xì)菌的16srDNA的全序列？/nucleotide搜索16s，再在右邊選擇bacteria本蟲做菌株鑒定方面，從形態(tài)學(xué)觀察是某種真菌，下面打算用基因方面鑒定，請問可否用真菌通用引物ITS1和ITS4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，之后BLAST比對確定該菌株種屬？我們從老鼠內(nèi)臟提取到細(xì)菌，我們要鑒定是什么細(xì)菌要做些什么過程呢？我是新人也查了些文獻(xiàn)，這菌是好氧的，桿菌，革蘭氏染為紅色，我們提取到的菌可能是混合菌，要進(jìn)行純化（怎么純化比較好），測定16SRNA,設(shè)計(jì)引物（不知道序列怎么設(shè)計(jì)?。恳罁?jù)其他文獻(xiàn)的引物可以嗎？），謝謝各位，如果要知道的可以討論或者賜教，我剛觸及這方面的知識(shí)不是太了解，雖然自己也有看文獻(xiàn)，希望有經(jīng)驗(yàn)的各位能給我點(diǎn)幫助，謝謝純化最好的方法是劃線分離，將你分離得到菌在平板上劃線，盡量劃得很開，是不是一種菌就一目了然了，你以后的操作就是挑取純培養(yǎng)的菌落提取16SrDNA之后測序，細(xì)菌有通用的16SrDNA引物，上網(wǎng)搜細(xì)菌通用引物估計(jì)就能搜到了，之后測序的結(jié)果到ncbi進(jìn)行比對或構(gòu)建進(jìn)化樹就好了先做形態(tài)學(xué)的觀察，再做生理生化實(shí)驗(yàn)，最后測16SrDNA序列，比對數(shù)據(jù)庫。第一次發(fā)帖，好緊張自己篩了一株細(xì)菌，對其進(jìn)行了誘變，拿到北京一個(gè)民營的菌種鑒定中心進(jìn)行16srRNA的鑒定，結(jié)果出來后，去NCBI進(jìn)行比對