分子醫(yī)學(xué)技能：酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)技術(shù)課件

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)技術(shù)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)技術(shù)ELISPOT（Enzyme-linkedImmunospotAssay）結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA技術(shù)），能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況；用抗體原位捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來(lái)。

ELISPOT（Enzyme-linkedImmunosp特點(diǎn)：斑點(diǎn)可持久保存并進(jìn)行計(jì)數(shù)分析易操作、有效、快速、靈敏度高細(xì)胞因子的檢測(cè)不易受非分泌細(xì)胞的干擾比傳統(tǒng)的ELISA和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法敏感20-200倍樣本量大的情況下實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行快速、客觀的分析特點(diǎn)：CoatingAb包被培養(yǎng)孔根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入淋巴細(xì)胞及含或不含刺激因子的培養(yǎng)液孵育

基本原理CoatingAb包被培養(yǎng)孔根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入淋巴細(xì)胞及含活化的淋巴細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子與CoatingAb結(jié)合洗除細(xì)胞，依次加入生物素標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體及酶標(biāo)抗生物素抗體進(jìn)行反應(yīng)加入酶底物顯色形成斑點(diǎn)（SPOT）活化的淋巴細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子與CoatingAb結(jié)合洗除細(xì)CoatingAb包被培養(yǎng)板每孔加入200ul培養(yǎng)基封閉按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入含或不含刺激劑的培養(yǎng)液及一定數(shù)目細(xì)胞孵育20-24小時(shí)40C過(guò)夜室溫孵育1小時(shí)無(wú)菌直接取外周血單核細(xì)胞或脾淋巴細(xì)胞

基本操作CoatingAb每孔加入200ul培養(yǎng)基按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)40C去除細(xì)胞加入生物素標(biāo)記的detectorAb加入酶標(biāo)抗生物素抗體(GABA)加入顯色劑I/II,暗處室溫孵育20-30分鐘PBST洗板室溫孵育2小時(shí)后，PBST洗板室溫孵育1小時(shí)后，洗板去離子水清洗培養(yǎng)板室溫干燥后在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果非無(wú)菌去除細(xì)胞加入生物素標(biāo)記加入酶標(biāo)抗生物素抗體(GABA)加入顯技術(shù)要點(diǎn)預(yù)孵育的淋巴細(xì)胞若有壞死/凋亡（培養(yǎng)液過(guò)黃）會(huì)影響斑點(diǎn)的形成提取淋巴細(xì)胞時(shí)應(yīng)盡量去除紅細(xì)胞的干擾加入ELISPOT培養(yǎng)孔的細(xì)胞須為單細(xì)胞懸液細(xì)胞孵育過(guò)程應(yīng)保證ELISPOT培養(yǎng)板靜置，CO2培養(yǎng)箱應(yīng)保證穩(wěn)定，避免震蕩稀釋抗體及GABA凍干粉時(shí)建議無(wú)菌操作，保存過(guò)程避免細(xì)菌的污染以保證其效用顯色劑I和II應(yīng)避光保存，不使用時(shí)切勿混合技術(shù)要點(diǎn)預(yù)孵育的淋巴細(xì)胞若有壞死/凋亡（培養(yǎng)液過(guò)黃

ELISPOT

實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖分子醫(yī)學(xué)技能：酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)技術(shù)課件雙色ELISPOT原理雙抗體包被培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞因子A細(xì)胞因子B包被抗體HRP-檢測(cè)抗體Biotin-檢測(cè)抗體堿性磷酸酶-streptavidinBCIP/NBT底物AEC底物斑點(diǎn)形成細(xì)胞因子A細(xì)胞因子B雙色ELISPOT原理雙抗體包被培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞因子A細(xì)胞因子B雙色ELISPOT結(jié)果示意圖藍(lán)色：IFN-γ,紅色：IL-2;藍(lán)色：IFN-γ,紅色：IL-17雙色ELISPOT結(jié)果示意圖藍(lán)色：IFN-γ,紅色：IL-B細(xì)胞雜交瘤的篩選化合物和藥物免疫學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)優(yōu)化樹(shù)突細(xì)胞和T細(xì)胞的抗腫瘤活性靶向疫苗的質(zhì)控自身免疫疾病的診斷和預(yù)后分析自身免疫疾病免疫治療的監(jiān)控過(guò)敏性疾病的脫敏治療的監(jiān)測(cè)器官移植中排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè)微量組織、腫瘤和免疫細(xì)胞分泌譜的分析結(jié)核病的診斷

ELISPOT方法主要用途B細(xì)胞雜交瘤的篩選ELISPOT方法主要用途Thankyou!Thankyou!酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)技術(shù)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)技術(shù)ELISPOT（Enzyme-linkedImmunospotAssay）結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA技術(shù)），能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況；用抗體原位捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來(lái)。

ELISPOT（Enzyme-linkedImmunosp特點(diǎn)：斑點(diǎn)可持久保存并進(jìn)行計(jì)數(shù)分析易操作、有效、快速、靈敏度高細(xì)胞因子的檢測(cè)不易受非分泌細(xì)胞的干擾比傳統(tǒng)的ELISA和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法敏感20-200倍樣本量大的情況下實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行快速、客觀的分析特點(diǎn)：CoatingAb包被培養(yǎng)孔根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入淋巴細(xì)胞及含或不含刺激因子的培養(yǎng)液孵育

基本原理CoatingAb包被培養(yǎng)孔根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入淋巴細(xì)胞及含活化的淋巴細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子與CoatingAb結(jié)合洗除細(xì)胞，依次加入生物素標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體及酶標(biāo)抗生物素抗體進(jìn)行反應(yīng)加入酶底物顯色形成斑點(diǎn)（SPOT）活化的淋巴細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子與CoatingAb結(jié)合洗除細(xì)CoatingAb包被培養(yǎng)板每孔加入200ul培養(yǎng)基封閉按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入含或不含刺激劑的培養(yǎng)液及一定數(shù)目細(xì)胞孵育20-24小時(shí)40C過(guò)夜室溫孵育1小時(shí)無(wú)菌直接取外周血單核細(xì)胞或脾淋巴細(xì)胞

基本操作CoatingAb每孔加入200ul培養(yǎng)基按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)40C去除細(xì)胞加入生物素標(biāo)記的detectorAb加入酶標(biāo)抗生物素抗體(GABA)加入顯色劑I/II,暗處室溫孵育20-30分鐘PBST洗板室溫孵育2小時(shí)后，PBST洗板室溫孵育1小時(shí)后，洗板去離子水清洗培養(yǎng)板室溫干燥后在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果非無(wú)菌去除細(xì)胞加入生物素標(biāo)記加入酶標(biāo)抗生物素抗體(GABA)加入顯技術(shù)要點(diǎn)預(yù)孵育的淋巴細(xì)胞若有壞死/凋亡（培養(yǎng)液過(guò)黃）會(huì)影響斑點(diǎn)的形成提取淋巴細(xì)胞時(shí)應(yīng)盡量去除紅細(xì)胞的干擾加入ELISPOT培養(yǎng)孔的細(xì)胞須為單細(xì)胞懸液細(xì)胞孵育過(guò)程應(yīng)保證ELISPOT培養(yǎng)板靜置，CO2培養(yǎng)箱應(yīng)保證穩(wěn)定，避免震蕩稀釋抗體及GABA凍干粉時(shí)建議無(wú)菌操作，保存過(guò)程避免細(xì)菌的污染以保證其效用顯色劑I和II應(yīng)避光保存，不使用時(shí)切勿混合技術(shù)要點(diǎn)預(yù)孵育的淋巴細(xì)胞若有壞死/凋亡（培養(yǎng)液過(guò)黃

ELISPOT

實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖分子醫(yī)學(xué)技能：酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)技術(shù)課件雙色ELISPOT原理雙抗體包被培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞因子A細(xì)胞因子B包被抗體HRP-檢測(cè)抗體Biotin-檢測(cè)抗體堿性磷酸酶-streptavidinBCIP/NBT底物AEC底物斑點(diǎn)形成細(xì)胞因子A細(xì)胞因子B雙色ELISPOT原理雙抗體包被培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞因子A細(xì)胞因子B雙色ELISPOT結(jié)果示意圖藍(lán)色：IFN-γ,紅色：IL-2;藍(lán)色：IFN-γ,紅色：IL-17雙色ELISPOT結(jié)果示意圖藍(lán)色：IFN-γ,紅色：IL-B細(xì)胞雜交瘤的篩選化合物和藥物免疫學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)優(yōu)化樹(shù)突細(xì)胞和T細(xì)