配位化學(xué)在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用課件

配位化學(xué)在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用報(bào)告人：張煜導(dǎo)師：唐瑜教授配位化學(xué)在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用一、細(xì)胞凋亡的簡(jiǎn)介二、文獻(xiàn)三、設(shè)計(jì)思路四、總結(jié)配位化學(xué)在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用TextTextText一、細(xì)胞凋亡的簡(jiǎn)介1972年Kerr根據(jù)細(xì)胞發(fā)生與壞死不同的死亡現(xiàn)象，提出了細(xì)胞凋亡的概念，稱為Apoptosis，宣告了對(duì)細(xì)胞凋亡的真正探索的開(kāi)始。而細(xì)胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）最初是1956年發(fā)育生物學(xué)中提出的概念，是個(gè)功能性概念，強(qiáng)調(diào)的是其分子生物學(xué)和生理功能，一般指生理性細(xì)胞死亡。描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的、并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。在現(xiàn)在的研究中把二者作為一個(gè)意思解釋。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，近二三十年來(lái)，細(xì)胞凋亡的研究取得了重大的突破，越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界和生物學(xué)界的普遍關(guān)注。盡管人們尚未完全掌控細(xì)胞凋亡，但是目前人們對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制和凋亡異常導(dǎo)致的疾病有了比較全面的認(rèn)識(shí)，并且根據(jù)細(xì)胞凋亡的不同特征，形成了不同的凋亡檢測(cè)方法。這些都為人們更加深入地研究細(xì)胞凋亡奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為對(duì)疾病的新認(rèn)識(shí)打下了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。而且也為解決惡性腫瘤的醫(yī)學(xué)難題指明了新的方向。凋亡細(xì)胞的特征welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience形態(tài)學(xué)特征

細(xì)胞凋亡過(guò)程可分為三個(gè)不太明顯的階段：感應(yīng)階段、效應(yīng)階段和分解階段。感應(yīng)階段通過(guò)死亡誘導(dǎo)信號(hào)刺激凋亡前信號(hào)大量轉(zhuǎn)變。這種死亡誘導(dǎo)信號(hào)包括氧化還原種類、神經(jīng)酰胺信號(hào)、Ca2+的超活化途徑和Bcl家族蛋白如Bax和Bad。在第二階段，即效應(yīng)階段，在關(guān)鍵調(diào)節(jié)器——線粒體的作用下，細(xì)胞開(kāi)始死亡。最后的分解階段包含了細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)兩個(gè)部分。在細(xì)胞質(zhì)中一種叫caspases的復(fù)合級(jí)聯(lián)蛋白被激活；在細(xì)胞核中，染色質(zhì)濃縮，核膜破裂DNA被分解成若干小片段。最后細(xì)胞被分解成若干凋亡小體，在表面的磷脂酰絲氨酸被識(shí)別后被鄰近的細(xì)胞或者吞噬細(xì)胞所吞噬。從細(xì)胞發(fā)生凋亡開(kāi)始，到出現(xiàn)凋亡小體僅需數(shù)分鐘，而被吞噬消化整個(gè)過(guò)程可持續(xù)4～9h。凋亡細(xì)胞的特征welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience生化特征

早期凋亡細(xì)胞及活細(xì)胞的胞膜正常，對(duì)DNA染料碘化丙錠（PI）拒染，但可被另外一種DNA染料Hoechst33342（Ho33342）染色；而壞死細(xì)胞的胞膜完整性受到破壞，細(xì)胞不需固定即可被PI染色。凋亡細(xì)胞在凋亡早期原來(lái)位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）翻轉(zhuǎn)至磷脂雙分子層外側(cè)。凋亡發(fā)生時(shí)線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p，使細(xì)胞生成ATP的量減少；跨膜電位降低，細(xì)胞色素c從線粒體內(nèi)漏到胞質(zhì)中；線粒體膜的通透性升高。胞漿中Ca2+和Mg2+濃度升高，可以激活核酸內(nèi)切酶和蛋白酶激活的核酸內(nèi)切酶可以將DNA切成50～300bp大小的DNA，然后進(jìn)一步將染色質(zhì)裂解成單個(gè)核小體和寡聚核小體，形成180～200bp的DNA片斷。配位化學(xué)在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用二、文獻(xiàn)報(bào)道Conjugatesofferrocenewithbiologicalcompounds.CoordinationtogoldcomplexesandantitumoralpropertiesJournalofInorganicBiochemistry105(2011)1373–1382在這篇文獻(xiàn)中，他們合成了一系列帶有生物配體的二茂鐵配合物。并且將這些配合物和Au(I)和Au(III)結(jié)合。他們檢測(cè)了這兩個(gè)基團(tuán)的結(jié)合位點(diǎn)。而且這兩個(gè)基團(tuán)結(jié)合表現(xiàn)出很好的抗癌活性。他們將金的配合物運(yùn)用到三種癌細(xì)胞中：MCF-7（人類的乳腺癌細(xì)胞）、HeLa（人類的宮頸癌細(xì)胞）和NIE-115（來(lái)源于老鼠的交感神經(jīng)囊腫神經(jīng)元細(xì)胞）。檢測(cè)這些配合物對(duì)癌細(xì)胞的作用。Scheme1.i)L-histidinemethylester,ii)histamine,iii)L-tryptophanmethylester,iv)L-methioninemethylester,v)L-lysineethylester,vi)L-prolinamide.第一步、合成所需的配合物Scheme2.i)[Au(acac)(PR3)],ii)[Au(acac)(PR3)],iii)[Au(OTf)(PR3)],iv)[Au(C6F5)3(OEt2)].第二步、基于MTT比色法檢測(cè)IC50值的實(shí)驗(yàn)

Cellswereexposedtoeachcompoundforatotalof48h.Usingthecolorimetricmitochondrialfunction-basedMTTviabilityassay,theIC50values(finalconcentration≤0.5%DMSO)werecalculatedfromdose-responsecurvesobtainedbynonlinearregressionanalysis.IC50valuesareconcentrationsofdrugrequiredtoinhibittumorcellproliferationby50%,comparedtothecontrolviability.AsdemonstratedbytheIC50for48hvalueslistedinTable4,thetestedferrocenebioconjugatesdonotshowsignificantantiproliferativeactivitybutthegoldcomplexesappearedtobequiteeffectiveascytotoxicagentsagainstinvitrogrowthofvariouscancercelllines.MTT比色法原理MTT比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氧酶使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在440nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。MTT結(jié)晶形成量與細(xì)胞數(shù)成正比。IC50值的簡(jiǎn)介IC50是指被抑制一半時(shí)抑制劑的濃度，這里的反應(yīng)可以是酶催化反應(yīng)，抗原抗體反應(yīng)等。在凋亡方面，可以理解為一定濃度的某種藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡50%，該濃度稱為50%抑制濃度，即凋亡細(xì)胞與全部細(xì)胞數(shù)之比等于50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度，IC50值可以用來(lái)衡量藥物誘導(dǎo)凋亡的能力，即誘導(dǎo)能力越強(qiáng)，該數(shù)值越低，當(dāng)然也可以反向說(shuō)明某種細(xì)胞對(duì)藥物的耐受程度。IC50(48h)ofcomplexesagainstHeLa,MCF-7,andN1E-115cells.

IC50(μM)CompoundsHeLaMCF-7N1E-1153＞1000NTNT4＞1000NTNT6＞1000NTNT732±1.815±1.227±2.2822±1.945±1.726±1.6928±1.652±1.254±2.31029±1.332±2.5＜10±2.21118±1.415±1.829±1.71387±2.088±2.231±2.4Fig.3.Variationofcellsurvivalwiththeincubationtime(complex10).第三步、流式細(xì)胞記數(shù)法

Flowcytometrystudiesusingdoublestainingwith

Hoechst33342andpropidiumiodideshowedalsoasignificativepercentageofapoptoticcellsafterincubationofMCF-7cellswithincreasingconcentrationsofcompound10(10and50μM)for3and24h(Fig.4andTable5).

TheuseofthemolecularprobeH2DCF-DAshowedthatincubationofMCF-7cellswithcompound10producedanincreasingdoseandtimedependentamountofreactiveoxygenspecies(ROS)(Fig.5and

Table6).Fig.4.FCMoflightscatterofapoptoticMCF-7cells.Cellswereincubatedfor3and24hwithcomplex10at10and50μM.a)10μMfor3h;b)10μMfor24h;c)50μMfor3hand

d)50μMfor24h.Table5

Percentageofapoptotic,deadandlivecellsafterincubationwithcomplex10.Complex10(μM)Incubationtime(h)ApoptoticDeadAlive10352.1047.470.182458.4441.130.2350324.5974.910.042411.3688.460.04Fig.5.FCMofROSproductionusingH2DCF-DA(2′,7′-dichlorodihydrofluresceindiacetate).a)Control(non-treatedcells);b)Positivecontrol(cellsincubatedwith500μMH2O2.Cellsincubatedwithcomplex10for3and6hat10and50μM.c)10μMfor3h;d)10μMfor6h;e)50μMfor3handf)50μMfor6h.Table6

Productionofreactiveoxygenspecies(ROS)byMCF-7cellsincubatedwithcomplex10.Complex10(μM)Incubationtime(h)ROS(%)Control––2.46H2O25002.3055.610361.4684.550358.2696.7三、設(shè)計(jì)思路1、合成一種新的配體，它可以和金配位2、設(shè)計(jì)一條多肽鏈作為caspase-3酶作用底物3、這條肽鏈