配位化學(xué)在細胞凋亡中的應(yīng)用課件

配位化學(xué)在細胞凋亡中的應(yīng)用報告人：張煜導(dǎo)師：唐瑜教授配位化學(xué)在細胞凋亡中的應(yīng)用一、細胞凋亡的簡介二、文獻三、設(shè)計思路四、總結(jié)配位化學(xué)在細胞凋亡中的應(yīng)用TextTextText一、細胞凋亡的簡介1972年Kerr根據(jù)細胞發(fā)生與壞死不同的死亡現(xiàn)象，提出了細胞凋亡的概念，稱為Apoptosis，宣告了對細胞凋亡的真正探索的開始。而細胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）最初是1956年發(fā)育生物學(xué)中提出的概念，是個功能性概念，強調(diào)的是其分子生物學(xué)和生理功能，一般指生理性細胞死亡。描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發(fā)育中的一個預(yù)定的、并受到嚴格程序控制的正常組成部分。在現(xiàn)在的研究中把二者作為一個意思解釋。隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的飛速發(fā)展，近二三十年來，細胞凋亡的研究取得了重大的突破，越來越受到醫(yī)學(xué)界和生物學(xué)界的普遍關(guān)注。盡管人們尚未完全掌控細胞凋亡，但是目前人們對細胞凋亡機制和凋亡異常導(dǎo)致的疾病有了比較全面的認識，并且根據(jù)細胞凋亡的不同特征，形成了不同的凋亡檢測方法。這些都為人們更加深入地研究細胞凋亡奠定了堅實的基礎(chǔ)，也為對疾病的新認識打下了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。而且也為解決惡性腫瘤的醫(yī)學(xué)難題指明了新的方向。凋亡細胞的特征welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience形態(tài)學(xué)特征

細胞凋亡過程可分為三個不太明顯的階段：感應(yīng)階段、效應(yīng)階段和分解階段。感應(yīng)階段通過死亡誘導(dǎo)信號刺激凋亡前信號大量轉(zhuǎn)變。這種死亡誘導(dǎo)信號包括氧化還原種類、神經(jīng)酰胺信號、Ca2+的超活化途徑和Bcl家族蛋白如Bax和Bad。在第二階段，即效應(yīng)階段，在關(guān)鍵調(diào)節(jié)器——線粒體的作用下，細胞開始死亡。最后的分解階段包含了細胞質(zhì)和核質(zhì)兩個部分。在細胞質(zhì)中一種叫caspases的復(fù)合級聯(lián)蛋白被激活；在細胞核中，染色質(zhì)濃縮，核膜破裂DNA被分解成若干小片段。最后細胞被分解成若干凋亡小體，在表面的磷脂酰絲氨酸被識別后被鄰近的細胞或者吞噬細胞所吞噬。從細胞發(fā)生凋亡開始，到出現(xiàn)凋亡小體僅需數(shù)分鐘，而被吞噬消化整個過程可持續(xù)4～9h。凋亡細胞的特征welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience生化特征

早期凋亡細胞及活細胞的胞膜正常，對DNA染料碘化丙錠（PI）拒染，但可被另外一種DNA染料Hoechst33342（Ho33342）染色；而壞死細胞的胞膜完整性受到破壞，細胞不需固定即可被PI染色。凋亡細胞在凋亡早期原來位于細胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）翻轉(zhuǎn)至磷脂雙分子層外側(cè)。凋亡發(fā)生時線粒體呼吸鏈受損，使細胞生成ATP的量減少；跨膜電位降低，細胞色素c從線粒體內(nèi)漏到胞質(zhì)中；線粒體膜的通透性升高。胞漿中Ca2+和Mg2+濃度升高，可以激活核酸內(nèi)切酶和蛋白酶激活的核酸內(nèi)切酶可以將DNA切成50～300bp大小的DNA，然后進一步將染色質(zhì)裂解成單個核小體和寡聚核小體，形成180～200bp的DNA片斷。配位化學(xué)在細胞凋亡中的應(yīng)用二、文獻報道Conjugatesofferrocenewithbiologicalcompounds.CoordinationtogoldcomplexesandantitumoralpropertiesJournalofInorganicBiochemistry105(2011)1373–1382在這篇文獻中，他們合成了一系列帶有生物配體的二茂鐵配合物。并且將這些配合物和Au(I)和Au(III)結(jié)合。他們檢測了這兩個基團的結(jié)合位點。而且這兩個基團結(jié)合表現(xiàn)出很好的抗癌活性。他們將金的配合物運用到三種癌細胞中：MCF-7（人類的乳腺癌細胞）、HeLa（人類的宮頸癌細胞）和NIE-115（來源于老鼠的交感神經(jīng)囊腫神經(jīng)元細胞）。檢測這些配合物對癌細胞的作用。Scheme1.i)L-histidinemethylester,ii)histamine,iii)L-tryptophanmethylester,iv)L-methioninemethylester,v)L-lysineethylester,vi)L-prolinamide.第一步、合成所需的配合物Scheme2.i)[Au(acac)(PR3)],ii)[Au(acac)(PR3)],iii)[Au(OTf)(PR3)],iv)[Au(C6F5)3(OEt2)].第二步、基于MTT比色法檢測IC50值的實驗

Cellswereexposedtoeachcompoundforatotalof48h.Usingthecolorimetricmitochondrialfunction-basedMTTviabilityassay,theIC50values(finalconcentration≤0.5%DMSO)werecalculatedfromdose-responsecurvesobtainedbynonlinearregressionanalysis.IC50valuesareconcentrationsofdrugrequiredtoinhibittumorcellproliferationby50%,comparedtothecontrolviability.AsdemonstratedbytheIC50for48hvalueslistedinTable4,thetestedferrocenebioconjugatesdonotshowsignificantantiproliferativeactivitybutthegoldcomplexesappearedtobequiteeffectiveascytotoxicagentsagainstinvitrogrowthofvariouscancercelllines.MTT比色法原理MTT比色法是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氧酶使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚，并沉淀在細胞中，而死細胞無此功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚。用酶聯(lián)免疫檢測儀在440nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。MTT結(jié)晶形成量與細胞數(shù)成正比。IC50值的簡介IC50是指被抑制一半時抑制劑的濃度，這里的反應(yīng)可以是酶催化反應(yīng)，抗原抗體反應(yīng)等。在凋亡方面，可以理解為一定濃度的某種藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡50%，該濃度稱為50%抑制濃度，即凋亡細胞與全部細胞數(shù)之比等于50%時所對應(yīng)的濃度，IC50值可以用來衡量藥物誘導(dǎo)凋亡的能力，即誘導(dǎo)能力越強，該數(shù)值越低，當(dāng)然也可以反向說明某種細胞對藥物的耐受程度。IC50(48h)ofcomplexesagainstHeLa,MCF-7,andN1E-115cells.

IC50(μM)CompoundsHeLaMCF-7N1E-1153＞1000NTNT4＞1000NTNT6＞1000NTNT732±1.815±1.227±2.2822±1.945±1.726±1.6928±1.652±1.254±2.31029±1.332±2.5＜10±2.21118±1.415±1.829±1.71387±2.088±2.231±2.4Fig.3.Variationofcellsurvivalwiththeincubationtime(complex10).第三步、流式細胞記數(shù)法

Flowcytometrystudiesusingdoublestainingwith

Hoechst33342andpropidiumiodideshowedalsoasignificativepercentageofapoptoticcellsafterincubationofMCF-7cellswithincreasingconcentrationsofcompound10(10and50μM)for3and24h(Fig.4andTable5).

TheuseofthemolecularprobeH2DCF-DAshowedthatincubationofMCF-7cellswithcompound10producedanincreasingdoseandtimedependentamountofreactiveoxygenspecies(ROS)(Fig.5and

Table6).Fig.4.FCMoflightscatterofapoptoticMCF-7cells.Cellswereincubatedfor3and24hwithcomplex10at10and50μM.a)10μMfor3h;b)10μMfor24h;c)50μMfor3hand

d)50μMfor24h.Table5

Percentageofapoptotic,deadandlivecellsafterincubationwithcomplex10.Complex10(μM)Incubationtime(h)ApoptoticDeadAlive10352.1047.470.182458.4441.130.2350324.5974.910.042411.3688.460.04Fig.5.FCMofROSproductionusingH2DCF-DA(2′,7′-dichlorodihydrofluresceindiacetate).a)Control(non-treatedcells);b)Positivecontrol(cellsincubatedwith500μMH2O2.Cellsincubatedwithcomplex10for3and6hat10and50μM.c)10μMfor3h;d)10μMfor6h;e)50μMfor3handf)50μMfor6h.Table6

Productionofreactiveoxygenspecies(ROS)byMCF-7cellsincubatedwithcomplex10.Complex10(μM)Incubationtime(h)ROS(%)Control––2.46H2O25002.3055.610361.4684.550358.2696.7三、設(shè)計思路1、合成一種新的配體，它可以和金配位2、設(shè)計一條多肽鏈作為caspase-3酶作用底物3、這條肽鏈