細(xì)菌的生化試驗(yàn)

關(guān)于細(xì)菌的生化試驗(yàn)第1頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五第2頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五第3頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五細(xì)菌的基本鑒定技術(shù)生化反應(yīng)鑒定：通過觀察細(xì)菌利用酶和降解糖類、醇類、脂類、蛋白質(zhì)和氨基酸的能力可以了解其生化活性，從而識別和鑒定細(xì)菌。免疫學(xué)鑒定（血清學(xué)鑒定）編碼鑒定第4頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五第一碳水化合物代謝試驗(yàn)一、糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn)：

原理：各種細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖類的酶，分糖類的能力各不相同，且不同細(xì)菌分解同一種糖的代謝產(chǎn)物也不一定相同。第5頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果判斷反應(yīng)現(xiàn)象結(jié)果描述酸性變色、有氣泡分解××糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣酸性變色、無氣泡分解××糖產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣培養(yǎng)基不變色不分解××糖第6頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五1．原理：細(xì)菌在分解葡萄糖的代謝過程中根據(jù)對氧分子參加的需要，分成三種類型：需要分子氧參加的為氧化型；能進(jìn)行無氧降解的為發(fā)酵型，發(fā)酵型細(xì)菌無論在有氧或無氧環(huán)境中都能分解葡萄糖。在有氧和厭氧環(huán)境中都不能分解葡萄糖的細(xì)菌為產(chǎn)堿型或不活動型細(xì)菌。

二．葡萄糖的氧化/發(fā)酵試驗(yàn)：第7頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五2．結(jié)果：發(fā)酵特征試管顏色不變而氧化特征試管顏色變黃，表明試驗(yàn)細(xì)菌的葡萄糖分解代謝為氧化型；兩管顏色均變黃色為發(fā)酵型；兩支培養(yǎng)管顏色均不變?yōu)楫a(chǎn)堿型或不活動型。O管F管O管F管第8頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五糖發(fā)酵試驗(yàn)第9頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五原理：細(xì)菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸等，使培養(yǎng)pH下降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑呈現(xiàn)紅色。如細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)(如醇、酮、醛、氣體和水)，培養(yǎng)基pH在5.4以上，甲基紅(MR)試驗(yàn)呈橘黃色。三．甲基紅試驗(yàn)：第10頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五2．結(jié)果：呈現(xiàn)紅色者為陽性；橘黃色為陰性；橘紅色為弱陽性。MR陰性MR陽性第11頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五某些細(xì)菌分解葡萄糖后生成丙酮酸，丙酮酸的分解產(chǎn)物則因細(xì)菌種類不同而有差別，如產(chǎn)氣腸桿菌能使丙酮酸脫羧產(chǎn)生中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化成二乙酰，在α-奈酚的催化作用下與培養(yǎng)基中氨基酸如精氨酸中的胍基化合物絡(luò)合形成紅色的化合物，即V-P試驗(yàn)陽性。四．V-P試驗(yàn)：第12頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五VP陰性VP陽性第13頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五五．β—半乳糖苷酶試驗(yàn)(ONPG試驗(yàn))：遲緩分解乳糖的細(xì)菌可產(chǎn)生β—半乳糖苷酶，能分解鄰硝基酚-β-半乳糖苷(ONPG)而釋放出黃色的鄰硝基酚。故此試驗(yàn)又稱為ONPG試驗(yàn)。細(xì)菌分解乳糖需二種酶半乳糖苷滲透酶β—半乳糖苷第14頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五第15頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五六．七葉苷水解試驗(yàn)：1．原理：七葉苷可被細(xì)菌水解，生成葡萄糖和七葉素。七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價(jià)鐵離子反應(yīng)生成黑色的化合物，使培養(yǎng)基變黑。2．結(jié)果：培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蜃睾谏邽殛栃?，不變色者為陰性。?6頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五第二蛋白質(zhì)和氨基酸代謝試驗(yàn)有些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解培養(yǎng)基中的色氨酸，生成吲哚。吲哚與試劑對位二甲氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈紅色。一．吲哚試驗(yàn)(靛基質(zhì)試驗(yàn))I陰性I陽性第17頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五二．尿素酶試驗(yàn)：某些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，分解尿素產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基變堿，使酚紅指示劑變紅色。U陽性U陰性第18頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五四．苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)：細(xì)菌分解氨基酸，可通過脫氨基或羧基生成反應(yīng)物，這些反應(yīng)由酶反應(yīng)進(jìn)行的，試驗(yàn)應(yīng)選擇合適底物。有些細(xì)菌能產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸氧化脫氨后生成苯丙酮酸，與三氯化鐵試劑產(chǎn)生深綠色反應(yīng)。苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)陰性陽性第19頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五第三碳源利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)C陰性C陽性在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基中，細(xì)菌能利用的碳源只有枸櫞酸鹽，分解后生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性，pH指示劑溴麝香草酚藍(lán)由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。能利用枸櫞酸鹽作為碳源的細(xì)菌也可利用氮源。第20頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五第四呼吸酶類試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)硝酸鹽還原反應(yīng)包括兩個過程：即細(xì)菌在合成代謝過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)胞內(nèi)其它含氮化合物；細(xì)菌在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。硝酸鹽還原的過程可因細(xì)菌不同而產(chǎn)物各異，有的細(xì)菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；有的細(xì)菌可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細(xì)菌還能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮；有的細(xì)菌還可以將其還原產(chǎn)物在合成代謝中完全利用。硝酸鹽或亞硝酸鹽如果還原生成氣體的終末產(chǎn)物，如氮和氧化氮，稱為脫硝化作用。第21頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五硝酸鹽還原試驗(yàn)是測定還原過程中生成的亞硝酸。硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性陽性第22頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五氧化酶試驗(yàn)【原理】氧化酶又稱細(xì)胞色素氧化酶，能將還原型細(xì)胞色素C氧化形成水和氧化型細(xì)胞色素C，氧化型細(xì)胞色素C再使四甲基對苯二胺氧化，形成顯色反應(yīng)。第23頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五氧化酶試驗(yàn)【試劑與器材】1．菌種大腸埃希菌、銅綠假單胞菌2．試劑氧化酶試劑（1%四甲基對苯二胺）3．器材2cm×2cm濾紙片、污物缸第24頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五氧化酶試驗(yàn)【操作步驟】1．將濾紙片疊成四方塊狀。2．用濾紙片的中心尖角小心刮取大腸埃希菌菌落，注意不可碰到培養(yǎng)基。3．輕輕展開濾紙片，刮取的菌落正好在濾紙片中心，滴加一滴1%四甲基對苯二胺。4．立刻觀察菌落顏色的變化。5．同法做銅綠假單胞菌的氧化酶試驗(yàn)。第25頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五氧化酶試驗(yàn)【結(jié)果】滴加氧化酶試劑后銅綠假單胞菌立刻變?yōu)樽仙?，為氧化酶陽性。大腸埃希菌不變色，為氧化酶陰性。

氧化酶試驗(yàn)（左側(cè)為銅綠假單胞菌、右側(cè)為大腸埃希菌）第26頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五氧化酶試驗(yàn)【注意事項(xiàng)】1．實(shí)驗(yàn)中的菌種要求新培養(yǎng)的，不宜用陳舊的培養(yǎng)物。2．刮取細(xì)菌時不可碰到培養(yǎng)基，不可用接種環(huán)等金屬物品取菌。3．氧化酶試劑要新鮮配制，一般裝在棕色瓶中，放在冰箱中可保存一周，時間長了易被空氣氧化變色。4．結(jié)果要立刻觀察，1min內(nèi)變色者為陽性，超過1min變色的為陰性。5．在濾紙片上滴加試劑時不要過多，以剛潤濕紙片為宜，如濾紙片過濕，可能妨礙空氣與細(xì)菌接觸，延長反應(yīng)時間，造成假陰性。第27頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五過氧化氫酶試驗(yàn)【原理】過氧化氫酶試驗(yàn)又稱觸酶試驗(yàn)。部分細(xì)菌含有黃素蛋白，在代謝過程中與空氣中的氧發(fā)生反應(yīng)，形成過氧化氫，過氧化氫對細(xì)菌有毒害作用，會破壞細(xì)胞組分，因此，細(xì)菌為保護(hù)自己，通常具有過氧化氫酶，可以催化裂解過氧化氫，形成水和氧氣。第28頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五過氧化氫酶試驗(yàn)【試劑與器材】1、菌種金黃色葡萄球菌2、試劑3%過氧化氫3、器材載玻片、無菌移液器吸頭、酒精燈、火柴、超凈工作臺第29頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五過氧化氫酶試驗(yàn)【操作步驟】1、在載玻片中央滴加一滴3%過氧化氫。2、用無菌移液器吸頭蘸取少量細(xì)菌，在3%過氧化氫中混勻?！窘Y(jié)果】觀察氣泡的產(chǎn)生情況。可以看見在吸頭上金黃色葡萄球菌菌苔周圍，產(chǎn)生大量氣泡，為過氧化氫酶陽性。如果菌苔周圍無氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶陰性。第30頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五過氧化氫酶試驗(yàn)【注意事項(xiàng)】1、普通金屬接種環(huán)可能與過氧化氫反應(yīng)，形成氣泡，造成假陽性，因此必須使用鉑絲接種環(huán)或塑料、玻璃材質(zhì)的工具。2、從血液瓊脂平板上挑取菌落時千萬小心，不要碰到培養(yǎng)基，因紅細(xì)胞中有過氧化氫酶，即使一點(diǎn)點(diǎn)也會造成假陽性。3、過氧化氫試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。第31頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五第五復(fù)合生化試驗(yàn)一．KIA試驗(yàn)：

成分：KIA主要用糖是葡萄糖與乳糖，比例為1：10，指示劑為酚紅。內(nèi)還含有蛋白質(zhì)4種衍生物：牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨和胨，硫代硫酸鈉，鐵鹽等，無抑制物。KIA第32頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五連續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時后，在細(xì)菌和氧的作用下，培養(yǎng)基斜面部分所含氨基酸發(fā)生降解，釋放胺類，產(chǎn)即中和斜面部分酸，經(jīng)18～24小時后，整個斜面轉(zhuǎn)變?yōu)閴A性，又復(fù)原以紅色。

原理：如某菌只分解葡萄糖，不能分解乳糖，它分解葡萄糖產(chǎn)少量酸，在最初培育的8～12小時內(nèi)，這少量的酸也足以使深層和斜面酚紅指示劑變黃。第33頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五如某菌既分解葡萄糖，又分解乳糖，那在KIA上產(chǎn)生大量酸（因乳糖含量多），超過斜面上形成的堿，成長整管培養(yǎng)基呈黃色。培養(yǎng)基深層的氨基酸降解作用不足以中和細(xì)菌分解葡萄糖所產(chǎn)生的少量酸，故深層仍呈黃色。第34頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五培養(yǎng)基中的硫代硫酸鈉可供給細(xì)菌產(chǎn)生H2S所需要的硫，鐵鹽-硫酸亞鐵和枸櫞酸銨鐵分別與H2S起反應(yīng)，產(chǎn)生不溶性的黑色FeS沉淀。由于細(xì)菌產(chǎn)生H2S需要在酸性環(huán)境中，所以KIA只限于瓊脂深層變黑。第35頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五結(jié)果：堿性（K），酸性（A）

K/K：不發(fā)酵碳水化合物，為不發(fā)酵菌特征。

K/A：葡萄糖發(fā)酵，乳糖不發(fā)酵，如志賀菌。

K/A（黑色）：葡萄糖發(fā)酵，乳糖不發(fā)酵并產(chǎn)生硫化氫，如沙門菌。

A/A：葡萄糖和乳糖發(fā)酵，如大腸埃希菌和克雷伯菌屬。第36頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五二．動力靛基質(zhì)尿素試驗(yàn)（MIU）

成分：MIU主要含尿素的半固體培養(yǎng)基，指示劑為酚紅，內(nèi)還有蛋白胨，蛋白胨中含有色氨酸。MIU第37頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五

原理：當(dāng)細(xì)菌在內(nèi)生長，通過半固體培養(yǎng)基可觀察其動力，另如果細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶，它可水解色氨酸形成靛基質(zhì)，當(dāng)加入對-二甲氨基苯甲醛（靛基質(zhì)試劑）時可形成玫瑰色吲哚，玫瑰色吲哚為紅色。如該菌又能產(chǎn)生尿素酶利用培養(yǎng)基中的尿素產(chǎn)堿，加酚紅指示劑后顯桃紅色。因此MIU可以觀察細(xì)菌動力、靛基質(zhì)的產(chǎn)生和細(xì)菌分解尿素的活性。有動力無動力第38頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五A管：MIU＋－－B管：MIU＋＋＋第39頁，共42頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)24分，星期五明膠水解實(shí)驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能分泌明膠酶分解明膠，產(chǎn)生小分子物質(zhì)。如果細(xì)菌具有分解明膠的能力，則平板培養(yǎng)基中的明膠被分解成小分子的物質(zhì)，在平板上