現(xiàn)代生物儀器分析第三章 分子熒光光譜法課件

第三章分子熒光光譜法分子熒光光譜法又稱為分子熒光分光光度法英文表示：moleculefluorescencespectrum簡稱MFS

分子熒光分析屬于發(fā)射光譜第三章分子熒光光譜法分子熒光光譜法又稱為分子熒光分光光度1重點(diǎn)部分熒光分析的基本原理熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光分析儀的基本類型及分析原理分子熒光分析的應(yīng)用重點(diǎn)部分熒光分析的基本原理2難點(diǎn)內(nèi)容熒光產(chǎn)生機(jī)理熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系難點(diǎn)內(nèi)容熒光產(chǎn)生機(jī)理3基本概念熒光效率熒光猝滅振動馳豫基本概念熒光效率4熒光法具有很強(qiáng)的檢出能力，其檢出限通常低于吸收光度法2～4個數(shù)量級，選擇性也比吸收光度法好。許多重要的生化物質(zhì)，藥物和致癌物質(zhì)（多環(huán)芳烴）都能產(chǎn)生熒光，因此熒光分析法在藥物分析，臨床分析，環(huán)境分析及食品分析中占有重要的地位。在無機(jī)物分析中，熒光法也有較廣泛的應(yīng)用。熒光屬發(fā)射光譜范疇。光致發(fā)光包括熒光和磷光。發(fā)光光譜:物質(zhì)分子或原子吸收輻射被激發(fā)后,電子以無輻射躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級,再以輻射的方式釋放這一部分能量而產(chǎn)生的光譜稱為熒光,磷光.熒光法具有很強(qiáng)的檢出能力，其檢出限通常低于吸收光度法2～4個5第一節(jié)

分子發(fā)光分析法分子發(fā)光分析主要包括:熒光分析磷光分析化學(xué)發(fā)光分析第一節(jié)

分子發(fā)光分析法分子發(fā)光分析主要包括:6若分子吸收了光能而激發(fā)到較高能態(tài)，在返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出與吸收波長相等或不等的輻射，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。光致發(fā)光最常見的類型是熒光和磷光。若在化學(xué)反應(yīng)中，產(chǎn)物分子吸收了反應(yīng)過程中釋放的化學(xué)能而被激發(fā),在返回基態(tài)時(shí)發(fā)出光輻射,稱為化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence)。若分子吸收了光能而激發(fā)到較高能態(tài)，在返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出與吸收7熒光和磷光這兩種光致發(fā)光過程的機(jī)理不同，可從實(shí)驗(yàn)觀察激發(fā)態(tài)分子壽命的長短來加以區(qū)別：對于熒光來說，當(dāng)激發(fā)光停止照射后，發(fā)光過程幾乎立即停止（在10-9～10-6秒，熒光壽命fluorescencelifetime

）。磷光則將持續(xù)一段時(shí)間（在10-3～10秒）。熒光和磷光這兩種光致發(fā)光過程的機(jī)理不同，可從實(shí)驗(yàn)觀察激發(fā)態(tài)分8熒光分析法發(fā)展簡史世界上第一次記錄熒光現(xiàn)象是16世紀(jì)西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家N.Monardes。1575年他提出在含有一種木頭切片的水溶液中，可觀察到極可愛的天藍(lán)色。熒光分析法發(fā)展簡史世界上第一次記錄熒光現(xiàn)象是16世紀(jì)西班牙的91852年，stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時(shí)，用分光光度計(jì)觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍微長些，從而導(dǎo)入了熒光是光發(fā)射的概念。1867年，Goppelsroder進(jìn)行了歷史上首次的熒光分析工作。應(yīng)用鋁—桑色素配合物的熒光進(jìn)行鋁的測定。19世紀(jì)以前，熒光的觀察是靠肉眼進(jìn)行的，直到1928年，才由Jette和West完成了第一臺熒光計(jì)。1852年，stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時(shí)，用分光光10現(xiàn)代生物儀器分析第三章分子熒光光譜法課件11第二節(jié)熒光分析的原理（一）熒光發(fā)生機(jī)理物質(zhì)的基態(tài)分子受一激發(fā)光源的照射，被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，在返回基態(tài)時(shí)，產(chǎn)生波長與入射光相同或較長的熒光。通過測定物質(zhì)分子產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析的方法稱為熒光分析(fluorescenceanalysis)。第二節(jié)熒光分析的原理（一）熒光發(fā)生機(jī)理通過測定物質(zhì)分子121、分子的激發(fā)態(tài)分子在基態(tài)時(shí)通常具有多對自旋成對的電子，根據(jù)包里不相容原理，在一個軌道上運(yùn)動的兩個電子的自旋方向是相反的。配對電子自旋總和是零。激發(fā)的單重態(tài)：分子吸收能量后，若電子在躍遷過程中不發(fā)生自旋方向的變化，這時(shí)分子處于激發(fā)的單重態(tài)(singlestate)。用符號S表示。激發(fā)的三重態(tài)：如果電子在躍遷過程中自旋方向發(fā)生了改變，即兩個電子的自旋相互平行，分子處于激發(fā)的三重態(tài)(tripletstate)。用T表示。1、分子的激發(fā)態(tài)分子在基態(tài)時(shí)通常具有多對自旋成對的電子，根據(jù)13激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的性質(zhì)不同熒光：10-7～10-9s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)單重態(tài)分子為反磁性，三重態(tài)分子為順磁性的。激發(fā)單重態(tài)的平均壽命約為10-8s，而激發(fā)三重態(tài)的平均壽命長達(dá)10-4～10s以上?；鶓B(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)容易發(fā)生，基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)三重態(tài)的幾率只相當(dāng)于前者的10-6。激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的性質(zhì)不同熒光：10-7～10-9s,14現(xiàn)代生物儀器分析第三章分子熒光光譜法課件152、分子熒光和磷光的產(chǎn)生分子在室溫時(shí)基本上處于電子能級的基態(tài)。當(dāng)吸收了紫外—可見光后，基態(tài)分子中的電子只能躍遷到激發(fā)單線態(tài)的各個不同振動—轉(zhuǎn)動能級，根據(jù)自旋禁阻規(guī)律，不能直接躍遷到激發(fā)三重態(tài)的各個振--轉(zhuǎn)能級。處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，它可能通過輻射躍遷和無輻射躍遷等分子內(nèi)的去活化過程釋放多余的能量而返回至基態(tài)，發(fā)射熒光是其中的一條途徑。

2、分子熒光和磷光的產(chǎn)生分子在室溫時(shí)基本上處于電子能級的基態(tài)16去活化過程是指分子中處于激發(fā)態(tài)的電子以輻射躍遷方式或無輻射躍遷方式放出多余能量.去活化過程是指分子中處于激發(fā)態(tài)的電子以輻射躍遷方式或無輻射躍17振動弛豫

vibrationalrelaxation

在溶液中,處于激發(fā)態(tài)的溶質(zhì)分子與溶劑分子間發(fā)生碰撞,把一部分能量以熱的形式迅速傳遞給溶劑分子(環(huán)境),在10-11~10-13秒時(shí)間回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級,這一過程稱為振動弛豫.因能量不是以光輻射的形式發(fā)生，故振動弛豫屬無輻射躍遷。振動弛豫只能在同一電子能級內(nèi)進(jìn)行，時(shí)間為10-12S數(shù)量級。振動弛豫

vibrationalrelaxation在溶18（2）內(nèi)轉(zhuǎn)換（內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換

）

internalconversion

當(dāng)兩個電子激發(fā)態(tài)之間的能量相差較小，以致其振動能級有重疊時(shí)，受激分子常由高電子能級以無輻射躍遷轉(zhuǎn)移至低電子能級。當(dāng)激發(fā)態(tài)S2的較低振動能級與S1的較高振動能級的能量相當(dāng)或重疊時(shí),分子有可能從S2的振動能級以無輻射方式過渡到S1的能量相等的振動能級上,這一無輻射過程稱為"內(nèi)轉(zhuǎn)換".“內(nèi)轉(zhuǎn)換”過程同樣也發(fā)生在三重激發(fā)態(tài)的電子能級間是相同多重度的能態(tài)之間的一種無輻射躍遷，躍遷過程中電子的自旋不改變，如Sm~→Sn,Tm~→Tn，時(shí)間10-12秒.

（2）內(nèi)轉(zhuǎn)換（內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換）

internalconve19（3）熒光發(fā)射

fluorescenceemission當(dāng)激發(fā)態(tài)的分子通過振動馳豫—內(nèi)轉(zhuǎn)換—振動馳豫到達(dá)第一單重激發(fā)態(tài)的最低振動能級時(shí),第一單重激發(fā)態(tài)最低振動能級的電子可通過發(fā)射輻射(光子)躍遷回到基態(tài)的不同振動能級,這時(shí)發(fā)射的光量子即為熒光，此過程稱為“熒光發(fā)射”.

電子振動弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換損失了部分能量，熒光的能量小于激發(fā)光能量，故發(fā)射熒光的波長比激發(fā)光波長要長。發(fā)射熒光的過程約為10-9～10-7S。（3）熒光發(fā)射

fluorescenceemission當(dāng)20（4）外轉(zhuǎn)換（外部能量轉(zhuǎn)換）

externalconversion

激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用(如碰撞)而以非輻射形式轉(zhuǎn)移掉能量回到基態(tài)的過程稱"外轉(zhuǎn)換".外轉(zhuǎn)換常發(fā)生在第一激發(fā)態(tài)單重態(tài)或第一激發(fā)態(tài)三重態(tài)的最低振動能級向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過程中，所需時(shí)間也為10-9～10-7S。外轉(zhuǎn)換降低熒光強(qiáng)度。外轉(zhuǎn)換與振動弛豫的異同點(diǎn)：均與粒子間的相互碰撞有關(guān)。但振動弛豫只能在同一電子能級內(nèi)進(jìn)行，時(shí)間10-12S，外轉(zhuǎn)換常發(fā)生在第一激發(fā)單線態(tài)或三線態(tài)→基態(tài)的過程中，時(shí)間10-9～10-7S。

（4）外轉(zhuǎn)換（外部能量轉(zhuǎn)換）

external21（5）系間跨越（體系間跨越）

intersystemcrossing

是指處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的過程。如果激發(fā)單重態(tài)S1*的最低振動能級同三重態(tài)T1*的最高振動能級重疊，則有可能發(fā)生電子自旋反轉(zhuǎn)的體系跨越。分子由激發(fā)單線態(tài)跨越三線態(tài)后，熒光強(qiáng)度減弱甚至熄滅。含有重原子如溴、碘等的分子，體系間跨越最為常見，原因是在高原子序數(shù)的原子中，電子的自旋與軌道運(yùn)動之間的相互作用較大，有利于電子自旋反轉(zhuǎn)的發(fā)生。此外在溶液中存在氧分子等順磁性物質(zhì)也容易發(fā)生體系間跨越，從而使熒光減弱。

指激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)之間的無輻射躍遷，它涉及受激電子自旋狀態(tài)的改變。（5）系間跨越（體系間跨越）

inters22（6）磷光發(fā)射

phosphorescenceemission第一電子三重激發(fā)態(tài)最低振動能級的分子以發(fā)射輻射(光子)的形式回到基態(tài)的不同振動能級,此過程稱為"磷光發(fā)射".

(磷光的波長較熒光的波長稍長,發(fā)生過程較慢約10-4~10s).由于三線態(tài)→單線態(tài)的躍遷是禁阻的,三線態(tài)壽命比較長(10-3~10s左右),若沒其它過程同它競爭時(shí),磷光的發(fā)生就有可能;由于三線態(tài)壽命較長,因而發(fā)生振動弛豫及外轉(zhuǎn)換的幾率也高,失去激發(fā)能的可能性大,以致在室溫條件下很難觀察到溶液中的磷光現(xiàn)象.因此,試樣采用液氮冷凍降低其它去活化才能觀察到某些分子的磷光.磷光在激發(fā)光輻射停止后仍可以持續(xù)一段時(shí)間。由于激發(fā)三線態(tài)的最低振動能級能量低，所以磷光輻射的能量比熒光小，亦即磷光的波長與熒光的更長。（6）磷光發(fā)射

phosphorescenceem23（二）激發(fā)光譜和熒光光譜熒光物質(zhì)分子都具有2個特征光譜，即激發(fā)光譜與熒光光譜。（1）激發(fā)光譜excitationspectrum

指不同激發(fā)波長的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光的相對效率。具體測繪方法是：固定熒光波長，改變激發(fā)波長，測定相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，以激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，便可得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。從激發(fā)光譜圖上可找到發(fā)生熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的激發(fā)波長,可得到強(qiáng)度最大的熒光.（二）激發(fā)光譜和熒光光譜熒光物質(zhì)分子都具有2個特征光譜，即激24熒光激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)及熒光測定時(shí)選擇適宜的激發(fā)光。激發(fā)光譜表明不同波長的激發(fā)光產(chǎn)生熒光的相對效率。激發(fā)光譜中最高峰的波長，能使熒光的物質(zhì)發(fā)出最強(qiáng)的熒光。熒光激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)及熒光測定時(shí)選擇適宜的激發(fā)光。25蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜…表示激發(fā)光譜—表示熒光光譜蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜…表示激發(fā)光譜—表示熒光光譜26⑵熒光光譜fluorescencespectrum

表示在所發(fā)射的熒光中各種波長的相對強(qiáng)度。即固定激發(fā)光波長和強(qiáng)度，讓物質(zhì)所發(fā)射的熒光通過單色器色散，測定不同波長時(shí)熒光強(qiáng)度.具體做法是：固定激發(fā)光波長及強(qiáng)度，測定不同熒光波長相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，以熒光波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，可得到熒光光譜。

熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長λexmax和最大熒光波長λemmax是鑒定物質(zhì)的依據(jù)。選擇ex作激發(fā)光源,用另一單色器將物質(zhì)發(fā)射的熒光分光,記錄每一波長下的F,作F-光譜圖稱為熒光光譜.

熒光光譜中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的波長為em.

ex與em一般為定量分析中所選用的最靈敏的波長.⑵熒光光譜fluorescencespectrum表示27第三節(jié)熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子產(chǎn)生熒光必須具備的2個條件：⑴分子必須具有能吸收一定頻率激發(fā)光的特定結(jié)構(gòu)；⑵分子在吸收了特征頻率的輻射能后，必須具有較高的熒光效率。熒光效率fluorescenceefficiency：物質(zhì)發(fā)射熒光的光子數(shù)與吸收激發(fā)光的光子數(shù)的比值.第三節(jié)熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子產(chǎn)生熒光必須具備的2個條件28熒光效率表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力：

高熒光物質(zhì)如熒光素，其值一般接近于1。大多數(shù)物質(zhì)的值一般小于1。如羅丹明B的乙醇溶液＝0.97，蒽的乙醇溶液＝0.30。＝0意味著該物質(zhì)不能發(fā)射熒光。熒光效率表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力：291、具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的有機(jī)物對于大多數(shù)熒光物質(zhì)來說，都是經(jīng)歷π→π*或n→π*躍遷而得到熒光。其中以π→π*躍遷發(fā)出的熒光較強(qiáng)。同時(shí)隨著體系共軛度的增加，熒光效率一般也隨之增大。1、具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的有機(jī)物30一般而言，芳香族化合物分子或含有多共軛雙鍵的分子是熒光性的。而能發(fā)生熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少。一般而言，芳香族化合物分子或含有多共軛雙鍵的分子是熒光性的。312、具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子具有剛性的不飽和的平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子具有強(qiáng)烈的熒光。分子的剛性及共平面性越大，熒光效率越高。2、具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子32例如熒光素和酚酞：例如熒光素和酚酞：333、苯環(huán)上取代基的類型通常有以下一些規(guī)律：（1）給電子基團(tuán)常使熒光增強(qiáng)，如—OH、—NH2、—NHR、—NR2，—OR等；（2）同π電子體系相互作用較小的取代基如—SO3H、—NH3+和烷基對分子熒光的影響不明顯；（3）吸電子基團(tuán)如—COOH、—C=O、—NO2、—NO、—N=N—及鹵素會減弱甚至破壞熒光。3、苯環(huán)上取代基的類型34第四節(jié)影響熒光強(qiáng)度的因素1、溫度的影響

溫度降低熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，相反溫度上升會使熒光強(qiáng)度下降。主要原因：溶液溫度下降時(shí)溶液中分子的活性減弱，溶劑粘度增大，溶質(zhì)分子與溶劑分子之間碰撞機(jī)會減少，降低了無輻射去活幾率，使熒光效率增加。相反隨著溫度上升，碰撞頻率增加，使外轉(zhuǎn)換的去活幾率增加。第四節(jié)影響熒光強(qiáng)度的因素1、溫度的影響主要原因：35例如熒光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，熒光效率增加3%；冷至－80℃時(shí)，熒光效率為100%。例如熒光素的乙醇溶液362、溶劑的影響

同一種熒光物質(zhì)溶于不同溶劑，其熒光光譜的位置和強(qiáng)度可能有明顯不同。一般情況下，隨著溶劑極性的增強(qiáng)，熒光物質(zhì)的n→π*躍遷能量將增大，π→π*躍遷能量將減少，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，熒光峰紅移。維生素B6：在二噁烷中熒光波長為335nm；在水中熒光波長為400nm2、溶劑的影響維生素B6：37

3、溶液PH值的影響當(dāng)熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的PH值對其熒光強(qiáng)度和熒光光譜影響較大。有些熒光物質(zhì)在離子狀態(tài)無熒光，而有些則相反；有些熒光物質(zhì)在分子和離子狀態(tài)時(shí)都有熒光，但熒光光譜卻不同。3、溶液PH值的影響38以苯胺為例：在PH7~12的溶液中苯胺以分子形式存在，會發(fā)出藍(lán)色熒光；而在PH＜2或PH＞13的溶液中苯胺以離子形式存在，都不發(fā)生熒光。以苯胺為例：39

4、猝滅劑的影響

熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低或消失的現(xiàn)象稱為熒光猝滅fluorescencequenching

。能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為猝滅劑。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等均為常見的猝滅劑。4、猝滅劑的影響40引起溶液中熒光猝滅的主要原因有：（1）碰撞猝滅是指處于單重激發(fā)態(tài)的熒光分子與猝滅劑發(fā)生碰撞，使激發(fā)態(tài)分子以無輻射躍遷方式回到基態(tài)，因而產(chǎn)生猝滅作用。引起溶液中熒光猝滅的主要原因有：41（2）氧的猝滅溶解氧的存在使熒光物質(zhì)氧化，或由于順磁性的氧分子與單重激發(fā)態(tài)的熒光分子相作用生成順磁性的三重態(tài)而使熒光猝滅。（2）氧的猝滅42

（3）靜態(tài)猝滅靜態(tài)猝滅又稱組合化合物的猝滅。熒光物質(zhì)分子與猝滅劑分子作用生成非熒光的配合物。（3）靜態(tài)猝滅43

（4）重原子效應(yīng)熒光物質(zhì)分子中引入溴或碘，使系間跨越增加，易使單重態(tài)轉(zhuǎn)化為三重態(tài)。（4）重原子效應(yīng)44（5）自猝滅和自吸收當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時(shí)，常會發(fā)生自猝滅現(xiàn)象。其原因是：單重激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而引起自猝滅。如蒽和苯的自猝滅。有些熒光物質(zhì)分子在溶液濃度高時(shí)會形成二聚體或多聚體，使它們的吸收光譜發(fā)生變化，也引起溶液熒光強(qiáng)度的降低或消失。（5）自猝滅和自吸收45當(dāng)熒光物質(zhì)的熒光光譜曲線與吸收光譜曲線重疊時(shí)，熒光被溶液中處于基態(tài)的分子吸收。這種現(xiàn)象稱為自吸收。當(dāng)熒光物質(zhì)的熒光光譜曲線與吸收光譜曲線重疊時(shí)，熒光被溶液中處46第四節(jié)熒光分析儀熒光分析的儀器有：熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)兩大類。它們通常都是由激發(fā)光源、單色器、樣品池、檢測器以及放大顯示系統(tǒng)組成。第四節(jié)熒光分析儀熒光分析的儀器有：47熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)48熒光分析儀組成示意圖

熒光分析儀組成示意圖491、激發(fā)光源常用的光源有高壓汞燈、氙燈。高壓汞燈發(fā)射的光強(qiáng)度大而穩(wěn)定，但光譜不連續(xù)，熒光分析中常用365、405、436nm三條譜線，常用于熒光計(jì).平均壽命為1500～3000h。1、激發(fā)光源常用的光源有高壓汞燈、氙燈。50氙燈發(fā)射的光強(qiáng)度大，能在紫外及可見區(qū)給出較好的連續(xù)光譜，可用于200～700nm波長范圍，在300～400nm波段內(nèi)，光譜強(qiáng)度幾乎相等。氙燈常用于熒光分光光度計(jì)。氙燈發(fā)射的光強(qiáng)度大，能在紫外及可見區(qū)給出較好的連續(xù)光譜，可用512、樣品池?zé)晒夥治鲇玫臉悠烦匦栌玫蜔晒獠牧希Ｓ檬⒊?，四面都是拋光的，有的附有恒溫裝置。2、樣品池52現(xiàn)代生物儀器分析第三章分子熒光光譜法課件53

3、單色器熒光計(jì)用濾光片作單色器，濾光片分激發(fā)光用濾光片和熒光用濾光片。熒光分光光度計(jì)則采用兩塊光柵作為單色器，一塊用于選擇激發(fā)光，另一塊用于熒光的色散。3、單色器544、檢測器熒光的強(qiáng)度通常比較弱，因此要求檢測器具有較高的靈敏度。在熒光計(jì)中常用光電池或光電管；在熒光分光光度計(jì)中常用光電倍增管。4、檢測器熒光的強(qiáng)度通常比較弱，因此要求檢測器具有較高的靈敏55第五節(jié)分子熒光分析法及其應(yīng)用1、定性分析在使用熒光分析法進(jìn)行定性時(shí)，一般常需用純品作對照。在定性時(shí)應(yīng)測繪熒光物質(zhì)與純品的激發(fā)光譜和熒光光譜，若純品與被測樣品的激發(fā)光譜和熒光光譜一致，可認(rèn)為為同一熒光物質(zhì)。分子熒光定性分析應(yīng)用比較少。第五節(jié)分子熒光分析法及其應(yīng)用1、定性分析56

2、定量分析（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法熒光分析一般多采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。即用已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過和試樣一樣的處理后，配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定的儀器條件下測定這些標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后在同樣的儀器條件下，測定試樣溶液的熒光強(qiáng)度，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該試樣溶液的濃度。2、定量分析（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法即用已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過和試樣57（2）比較法如果已知某熒光物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度線性范圍。在此濃度范圍內(nèi)配一標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其熒光強(qiáng)度；然后在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強(qiáng)度（熒光強(qiáng)度不應(yīng)超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍）；由標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度以及試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度的比值，求得試樣中熒光物質(zhì)的含量。（2）比較法如果已知某熒光物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度線性范圍。583、應(yīng)用定量分析方法一般有以下幾種：對于自身能發(fā)生熒光的化合物，可直接測定；對于發(fā)射熒光較弱或不能發(fā)射熒光的物質(zhì)，可利用有機(jī)試劑與其形成能發(fā)生熒光的配合物來進(jìn)行測定；有些熒光物質(zhì)能與猝滅劑作用而導(dǎo)致溶液熒光強(qiáng)度的降低，可由測量其熒光強(qiáng)度降低的程度來測定其含量。3、應(yīng)用定量分析方法一般有以下幾種：59（1）元素的熒光測定在紫外光照射下能發(fā)生熒光的無機(jī)物很少，對于無機(jī)陽離子的測定，是利用無機(jī)陽離子能與一些有機(jī)試劑形成熒光配合物，然后進(jìn)行熒光測定。（1）元素的熒光測定在紫外光照射下能發(fā)生熒光的無機(jī)物很少，對60能用此方法進(jìn)行分析的元素已達(dá)60余種。其中鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂以及某些稀土元素，常用熒光法進(jìn)行測定。一些陰離子，如氟、氰等離子能使熒光減弱，可用熒光猝滅法測定?？捎脽晒忖绶y定的元素有氟、硫、氰離子、鐵、銀、鈷、鎳等。能用此方法進(jìn)行分析的元素已達(dá)60余種。61（2）有機(jī)化合物芳香族化合物具有共軛不飽和結(jié)構(gòu)，多能產(chǎn)生熒光，可以直接進(jìn)行熒光測定。此外可用熒光法測定氨基酸、蛋白質(zhì)。熒光法也是進(jìn)行定性和定量分析酶以及研究酶動力學(xué)和機(jī)理的有用工具。在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)方面，熒光法是測定腎上腺素、維生素、抗菌素等藥物的靈敏方法。（2）有機(jī)化合物芳香族化合物具有共軛不飽和結(jié)構(gòu)，多能產(chǎn)生熒光62熒光分光光度計(jì)（天津）熒光分光光度計(jì)（天津）63熒光分光光度計(jì)（日本）熒光分光光度計(jì)（日本）64熒光分光光度計(jì)（日本）熒光分光光度計(jì)（日本）65熒光分光光度計(jì)（日本）熒光分光光度計(jì)（日本）66現(xiàn)代生物儀器分析第三章分子熒光光譜法課件67第三章分子熒光光譜法分子熒光光譜法又稱為分子熒光分光光度法英文表示：moleculefluorescencespectrum簡稱MFS

分子熒光分析屬于發(fā)射光譜第三章分子熒光光譜法分子熒光光譜法又稱為分子熒光分光光度68重點(diǎn)部分熒光分析的基本原理熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光分析儀的基本類型及分析原理分子熒光分析的應(yīng)用重點(diǎn)部分熒光分析的基本原理69難點(diǎn)內(nèi)容熒光產(chǎn)生機(jī)理熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系難點(diǎn)內(nèi)容熒光產(chǎn)生機(jī)理70基本概念熒光效率熒光猝滅振動馳豫基本概念熒光效率71熒光法具有很強(qiáng)的檢出能力，其檢出限通常低于吸收光度法2～4個數(shù)量級，選擇性也比吸收光度法好。許多重要的生化物質(zhì)，藥物和致癌物質(zhì)（多環(huán)芳烴）都能產(chǎn)生熒光，因此熒光分析法在藥物分析，臨床分析，環(huán)境分析及食品分析中占有重要的地位。在無機(jī)物分析中，熒光法也有較廣泛的應(yīng)用。熒光屬發(fā)射光譜范疇。光致發(fā)光包括熒光和磷光。發(fā)光光譜:物質(zhì)分子或原子吸收輻射被激發(fā)后,電子以無輻射躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級,再以輻射的方式釋放這一部分能量而產(chǎn)生的光譜稱為熒光,磷光.熒光法具有很強(qiáng)的檢出能力，其檢出限通常低于吸收光度法2～4個72第一節(jié)

分子發(fā)光分析法分子發(fā)光分析主要包括:熒光分析磷光分析化學(xué)發(fā)光分析第一節(jié)

分子發(fā)光分析法分子發(fā)光分析主要包括:73若分子吸收了光能而激發(fā)到較高能態(tài)，在返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出與吸收波長相等或不等的輻射，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。光致發(fā)光最常見的類型是熒光和磷光。若在化學(xué)反應(yīng)中，產(chǎn)物分子吸收了反應(yīng)過程中釋放的化學(xué)能而被激發(fā),在返回基態(tài)時(shí)發(fā)出光輻射,稱為化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence)。若分子吸收了光能而激發(fā)到較高能態(tài)，在返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出與吸收74熒光和磷光這兩種光致發(fā)光過程的機(jī)理不同，可從實(shí)驗(yàn)觀察激發(fā)態(tài)分子壽命的長短來加以區(qū)別：對于熒光來說，當(dāng)激發(fā)光停止照射后，發(fā)光過程幾乎立即停止（在10-9～10-6秒，熒光壽命fluorescencelifetime

）。磷光則將持續(xù)一段時(shí)間（在10-3～10秒）。熒光和磷光這兩種光致發(fā)光過程的機(jī)理不同，可從實(shí)驗(yàn)觀察激發(fā)態(tài)分75熒光分析法發(fā)展簡史世界上第一次記錄熒光現(xiàn)象是16世紀(jì)西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家N.Monardes。1575年他提出在含有一種木頭切片的水溶液中，可觀察到極可愛的天藍(lán)色。熒光分析法發(fā)展簡史世界上第一次記錄熒光現(xiàn)象是16世紀(jì)西班牙的761852年，stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時(shí)，用分光光度計(jì)觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍微長些，從而導(dǎo)入了熒光是光發(fā)射的概念。1867年，Goppelsroder進(jìn)行了歷史上首次的熒光分析工作。應(yīng)用鋁—桑色素配合物的熒光進(jìn)行鋁的測定。19世紀(jì)以前，熒光的觀察是靠肉眼進(jìn)行的，直到1928年，才由Jette和West完成了第一臺熒光計(jì)。1852年，stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時(shí)，用分光光77現(xiàn)代生物儀器分析第三章分子熒光光譜法課件78第二節(jié)熒光分析的原理（一）熒光發(fā)生機(jī)理物質(zhì)的基態(tài)分子受一激發(fā)光源的照射，被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，在返回基態(tài)時(shí)，產(chǎn)生波長與入射光相同或較長的熒光。通過測定物質(zhì)分子產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析的方法稱為熒光分析(fluorescenceanalysis)。第二節(jié)熒光分析的原理（一）熒光發(fā)生機(jī)理通過測定物質(zhì)分子791、分子的激發(fā)態(tài)分子在基態(tài)時(shí)通常具有多對自旋成對的電子，根據(jù)包里不相容原理，在一個軌道上運(yùn)動的兩個電子的自旋方向是相反的。配對電子自旋總和是零。激發(fā)的單重態(tài)：分子吸收能量后，若電子在躍遷過程中不發(fā)生自旋方向的變化，這時(shí)分子處于激發(fā)的單重態(tài)(singlestate)。用符號S表示。激發(fā)的三重態(tài)：如果電子在躍遷過程中自旋方向發(fā)生了改變，即兩個電子的自旋相互平行，分子處于激發(fā)的三重態(tài)(tripletstate)。用T表示。1、分子的激發(fā)態(tài)分子在基態(tài)時(shí)通常具有多對自旋成對的電子，根據(jù)80激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的性質(zhì)不同熒光：10-7～10-9s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)單重態(tài)分子為反磁性，三重態(tài)分子為順磁性的。激發(fā)單重態(tài)的平均壽命約為10-8s，而激發(fā)三重態(tài)的平均壽命長達(dá)10-4～10s以上?；鶓B(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)容易發(fā)生，基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)三重態(tài)的幾率只相當(dāng)于前者的10-6。激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的性質(zhì)不同熒光：10-7～10-9s,81現(xiàn)代生物儀器分析第三章分子熒光光譜法課件822、分子熒光和磷光的產(chǎn)生分子在室溫時(shí)基本上處于電子能級的基態(tài)。當(dāng)吸收了紫外—可見光后，基態(tài)分子中的電子只能躍遷到激發(fā)單線態(tài)的各個不同振動—轉(zhuǎn)動能級，根據(jù)自旋禁阻規(guī)律，不能直接躍遷到激發(fā)三重態(tài)的各個振--轉(zhuǎn)能級。處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，它可能通過輻射躍遷和無輻射躍遷等分子內(nèi)的去活化過程釋放多余的能量而返回至基態(tài)，發(fā)射熒光是其中的一條途徑。

2、分子熒光和磷光的產(chǎn)生分子在室溫時(shí)基本上處于電子能級的基態(tài)83去活化過程是指分子中處于激發(fā)態(tài)的電子以輻射躍遷方式或無輻射躍遷方式放出多余能量.去活化過程是指分子中處于激發(fā)態(tài)的電子以輻射躍遷方式或無輻射躍84振動弛豫

vibrationalrelaxation

在溶液中,處于激發(fā)態(tài)的溶質(zhì)分子與溶劑分子間發(fā)生碰撞,把一部分能量以熱的形式迅速傳遞給溶劑分子(環(huán)境),在10-11~10-13秒時(shí)間回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級,這一過程稱為振動弛豫.因能量不是以光輻射的形式發(fā)生，故振動弛豫屬無輻射躍遷。振動弛豫只能在同一電子能級內(nèi)進(jìn)行，時(shí)間為10-12S數(shù)量級。振動弛豫

vibrationalrelaxation在溶85（2）內(nèi)轉(zhuǎn)換（內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換

）

internalconversion

當(dāng)兩個電子激發(fā)態(tài)之間的能量相差較小，以致其振動能級有重疊時(shí)，受激分子常由高電子能級以無輻射躍遷轉(zhuǎn)移至低電子能級。當(dāng)激發(fā)態(tài)S2的較低振動能級與S1的較高振動能級的能量相當(dāng)或重疊時(shí),分子有可能從S2的振動能級以無輻射方式過渡到S1的能量相等的振動能級上,這一無輻射過程稱為"內(nèi)轉(zhuǎn)換".“內(nèi)轉(zhuǎn)換”過程同樣也發(fā)生在三重激發(fā)態(tài)的電子能級間是相同多重度的能態(tài)之間的一種無輻射躍遷，躍遷過程中電子的自旋不改變，如Sm~→Sn,Tm~→Tn，時(shí)間10-12秒.

（2）內(nèi)轉(zhuǎn)換（內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換）

internalconve86（3）熒光發(fā)射

fluorescenceemission當(dāng)激發(fā)態(tài)的分子通過振動馳豫—內(nèi)轉(zhuǎn)換—振動馳豫到達(dá)第一單重激發(fā)態(tài)的最低振動能級時(shí),第一單重激發(fā)態(tài)最低振動能級的電子可通過發(fā)射輻射(光子)躍遷回到基態(tài)的不同振動能級,這時(shí)發(fā)射的光量子即為熒光，此過程稱為“熒光發(fā)射”.

電子振動弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換損失了部分能量，熒光的能量小于激發(fā)光能量，故發(fā)射熒光的波長比激發(fā)光波長要長。發(fā)射熒光的過程約為10-9～10-7S。（3）熒光發(fā)射

fluorescenceemission當(dāng)87（4）外轉(zhuǎn)換（外部能量轉(zhuǎn)換）

externalconversion

激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用(如碰撞)而以非輻射形式轉(zhuǎn)移掉能量回到基態(tài)的過程稱"外轉(zhuǎn)換".外轉(zhuǎn)換常發(fā)生在第一激發(fā)態(tài)單重態(tài)或第一激發(fā)態(tài)三重態(tài)的最低振動能級向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過程中，所需時(shí)間也為10-9～10-7S。外轉(zhuǎn)換降低熒光強(qiáng)度。外轉(zhuǎn)換與振動弛豫的異同點(diǎn)：均與粒子間的相互碰撞有關(guān)。但振動弛豫只能在同一電子能級內(nèi)進(jìn)行，時(shí)間10-12S，外轉(zhuǎn)換常發(fā)生在第一激發(fā)單線態(tài)或三線態(tài)→基態(tài)的過程中，時(shí)間10-9～10-7S。

（4）外轉(zhuǎn)換（外部能量轉(zhuǎn)換）

external88（5）系間跨越（體系間跨越）

intersystemcrossing

是指處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的過程。如果激發(fā)單重態(tài)S1*的最低振動能級同三重態(tài)T1*的最高振動能級重疊，則有可能發(fā)生電子自旋反轉(zhuǎn)的體系跨越。分子由激發(fā)單線態(tài)跨越三線態(tài)后，熒光強(qiáng)度減弱甚至熄滅。含有重原子如溴、碘等的分子，體系間跨越最為常見，原因是在高原子序數(shù)的原子中，電子的自旋與軌道運(yùn)動之間的相互作用較大，有利于電子自旋反轉(zhuǎn)的發(fā)生。此外在溶液中存在氧分子等順磁性物質(zhì)也容易發(fā)生體系間跨越，從而使熒光減弱。

指激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)之間的無輻射躍遷，它涉及受激電子自旋狀態(tài)的改變。（5）系間跨越（體系間跨越）

inters89（6）磷光發(fā)射

phosphorescenceemission第一電子三重激發(fā)態(tài)最低振動能級的分子以發(fā)射輻射(光子)的形式回到基態(tài)的不同振動能級,此過程稱為"磷光發(fā)射".

(磷光的波長較熒光的波長稍長,發(fā)生過程較慢約10-4~10s).由于三線態(tài)→單線態(tài)的躍遷是禁阻的,三線態(tài)壽命比較長(10-3~10s左右),若沒其它過程同它競爭時(shí),磷光的發(fā)生就有可能;由于三線態(tài)壽命較長,因而發(fā)生振動弛豫及外轉(zhuǎn)換的幾率也高,失去激發(fā)能的可能性大,以致在室溫條件下很難觀察到溶液中的磷光現(xiàn)象.因此,試樣采用液氮冷凍降低其它去活化才能觀察到某些分子的磷光.磷光在激發(fā)光輻射停止后仍可以持續(xù)一段時(shí)間。由于激發(fā)三線態(tài)的最低振動能級能量低，所以磷光輻射的能量比熒光小，亦即磷光的波長與熒光的更長。（6）磷光發(fā)射

phosphorescenceem90（二）激發(fā)光譜和熒光光譜熒光物質(zhì)分子都具有2個特征光譜，即激發(fā)光譜與熒光光譜。（1）激發(fā)光譜excitationspectrum

指不同激發(fā)波長的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光的相對效率。具體測繪方法是：固定熒光波長，改變激發(fā)波長，測定相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，以激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，便可得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。從激發(fā)光譜圖上可找到發(fā)生熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的激發(fā)波長,可得到強(qiáng)度最大的熒光.（二）激發(fā)光譜和熒光光譜熒光物質(zhì)分子都具有2個特征光譜，即激91熒光激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)及熒光測定時(shí)選擇適宜的激發(fā)光。激發(fā)光譜表明不同波長的激發(fā)光產(chǎn)生熒光的相對效率。激發(fā)光譜中最高峰的波長，能使熒光的物質(zhì)發(fā)出最強(qiáng)的熒光。熒光激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)及熒光測定時(shí)選擇適宜的激發(fā)光。92蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜…表示激發(fā)光譜—表示熒光光譜蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜…表示激發(fā)光譜—表示熒光光譜93⑵熒光光譜fluorescencespectrum

表示在所發(fā)射的熒光中各種波長的相對強(qiáng)度。即固定激發(fā)光波長和強(qiáng)度，讓物質(zhì)所發(fā)射的熒光通過單色器色散，測定不同波長時(shí)熒光強(qiáng)度.具體做法是：固定激發(fā)光波長及強(qiáng)度，測定不同熒光波長相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，以熒光波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，可得到熒光光譜。

熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長λexmax和最大熒光波長λemmax是鑒定物質(zhì)的依據(jù)。選擇ex作激發(fā)光源,用另一單色器將物質(zhì)發(fā)射的熒光分光,記錄每一波長下的F,作F-光譜圖稱為熒光光譜.

熒光光譜中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的波長為em.

ex與em一般為定量分析中所選用的最靈敏的波長.⑵熒光光譜fluorescencespectrum表示94第三節(jié)熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子產(chǎn)生熒光必須具備的2個條件：⑴分子必須具有能吸收一定頻率激發(fā)光的特定結(jié)構(gòu)；⑵分子在吸收了特征頻率的輻射能后，必須具有較高的熒光效率。熒光效率fluorescenceefficiency：物質(zhì)發(fā)射熒光的光子數(shù)與吸收激發(fā)光的光子數(shù)的比值.第三節(jié)熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子產(chǎn)生熒光必須具備的2個條件95熒光效率表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力：

高熒光物質(zhì)如熒光素，其值一般接近于1。大多數(shù)物質(zhì)的值一般小于1。如羅丹明B的乙醇溶液＝0.97，蒽的乙醇溶液＝0.30。＝0意味著該物質(zhì)不能發(fā)射熒光。熒光效率表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力：961、具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的有機(jī)物對于大多數(shù)熒光物質(zhì)來說，都是經(jīng)歷π→π*或n→π*躍遷而得到熒光。其中以π→π*躍遷發(fā)出的熒光較強(qiáng)。同時(shí)隨著體系共軛度的增加，熒光效率一般也隨之增大。1、具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的有機(jī)物97一般而言，芳香族化合物分子或含有多共軛雙鍵的分子是熒光性的。而能發(fā)生熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少。一般而言，芳香族化合物分子或含有多共軛雙鍵的分子是熒光性的。982、具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子具有剛性的不飽和的平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子具有強(qiáng)烈的熒光。分子的剛性及共平面性越大，熒光效率越高。2、具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子99例如熒光素和酚酞：例如熒光素和酚酞：1003、苯環(huán)上取代基的類型通常有以下一些規(guī)律：（1）給電子基團(tuán)常使熒光增強(qiáng)，如—OH、—NH2、—NHR、—NR2，—OR等；（2）同π電子體系相互作用較小的取代基如—SO3H、—NH3+和烷基對分子熒光的影響不明顯；（3）吸電子基團(tuán)如—COOH、—C=O、—NO2、—NO、—N=N—及鹵素會減弱甚至破壞熒光。3、苯環(huán)上取代基的類型101第四節(jié)影響熒光強(qiáng)度的因素1、溫度的影響

溫度降低熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，相反溫度上升會使熒光強(qiáng)度下降。主要原因：溶液溫度下降時(shí)溶液中分子的活性減弱，溶劑粘度增大，溶質(zhì)分子與溶劑分子之間碰撞機(jī)會減少，降低了無輻射去活幾率，使熒光效率增加。相反隨著溫度上升，碰撞頻率增加，使外轉(zhuǎn)換的去活幾率增加。第四節(jié)影響熒光強(qiáng)度的因素1、溫度的影響主要原因：102例如熒光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，熒光效率增加3%；冷至－80℃時(shí)，熒光效率為100%。例如熒光素的乙醇溶液1032、溶劑的影響

同一種熒光物質(zhì)溶于不同溶劑，其熒光光譜的位置和強(qiáng)度可能有明顯不同。一般情況下，隨著溶劑極性的增強(qiáng)，熒光物質(zhì)的n→π*躍遷能量將增大，π→π*躍遷能量將減少，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，熒光峰紅移。維生素B6：在二噁烷中熒光波長為335nm；在水中熒光波長為400nm2、溶劑的影響維生素B6：104

3、溶液PH值的影響當(dāng)熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的PH值對其熒光強(qiáng)度和熒光光譜影響較大。有些熒光物質(zhì)在離子狀態(tài)無熒光，而有些則相反；有些熒光物質(zhì)在分子和離子狀態(tài)時(shí)都有熒光，但熒光光譜卻不同。3、溶液PH值的影響105以苯胺為例：在PH7~12的溶液中苯胺以分子形式存在，會發(fā)出藍(lán)色熒光；而在PH＜2或PH＞13的溶液中苯胺以離子形式存在，都不發(fā)生熒光。以苯胺為例：106

4、猝滅劑的影響

熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低或消失的現(xiàn)象稱為熒光猝滅fluorescencequenching

。能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為猝滅劑。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等均為常見的猝滅劑。4、猝滅劑的影響107引起溶液中熒光猝滅的主要原因有：（1）碰撞猝滅是指處于單重激發(fā)態(tài)的熒光分子與猝滅劑發(fā)生碰撞，使激發(fā)態(tài)分子以無輻射躍遷方式回到基態(tài)，因而產(chǎn)生猝滅作用。引起溶液中熒光猝滅的主要原因有：108（2）氧的猝滅溶解氧的存在使熒光物質(zhì)氧化，或由于順磁性的氧分子與單重激發(fā)態(tài)的熒光分子相作用生成順磁性的三重態(tài)而使熒光猝滅。（2）氧的猝滅109

（3）靜態(tài)猝滅靜態(tài)猝滅又稱組合化合物的猝滅。熒光物質(zhì)分子與猝滅劑分子作用生成非熒光的配合物。（3）靜態(tài)猝滅110

（4）重原子效應(yīng)熒光物質(zhì)分子中引入溴或碘，使系間跨越增加，易使單重態(tài)轉(zhuǎn)化為三重態(tài)。（4）重原子效應(yīng)111（5）自猝滅和自吸收當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時(shí)，常會發(fā)生自猝滅現(xiàn)象。其原因是：單重激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而引起自猝滅。如蒽和苯的自猝滅。有些熒光物質(zhì)分子在溶液濃度高時(shí)會形成二聚體或多聚體，使它們的吸收光譜發(fā)生變化，也引起溶液熒光強(qiáng)度的降低或消失。（5）自猝滅和自吸收112當(dāng)熒光物質(zhì)的熒光光譜曲線與吸收光譜曲線重疊時(shí)，熒光被溶液中處于基態(tài)的分子吸收。這種現(xiàn)象稱為自吸收。當(dāng)熒光物質(zhì)的熒光光譜曲線與吸收光譜曲線重疊時(shí)，熒光被溶液中處113第四節(jié)熒光分析儀熒光分析的儀器有：熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)兩大類。它們通常都是由激發(fā)光源、單色器、樣品池、檢測器以及放大顯示系統(tǒng)組成。第四節(jié)熒光分析儀熒光分析的儀器有