玉米ZmEXO70s基因家族鑒定及苗期耐熱性關聯(lián)分析

本文格式為Word版，下載可任意編輯——玉米ZmEXO70s基因家族鑒定及苗期耐熱性關聯(lián)分析0.05（Lietal.，2022）。使用TASSEL的2個統(tǒng)計模型（Bradburyetal.，2022），即一般線性模型（GLM）和混合線性模型（MLM）進行SNP分子標記與苗期耐熱性的關聯(lián)分析。其中，GLM是將群體結構考慮在內，結合基因型數(shù)據(jù)及表型數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析;MLM則是將群體結構和親緣關系均考慮在內，結合基因型數(shù)據(jù)及表型數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析（Zhangetal.，2022b;Lietal.，2022）。

1.5AM368群體苗期耐熱存活率表型

在長江大學農學院的步入式生長溫室中對AM368群體自交系進行6次苗期耐熱表型鑒定。以玉米苗期高溫存活率為統(tǒng)計指標，試驗設2次重復，采用隨機區(qū)組設計。每個小缽子種植12棵玉米，稱取一致重量的土壤基質，嚴格操縱土壤基質的重量和水分，待幼苗生長至3葉1心期時，對其進行42℃高溫脅迫處理。當玉米出現(xiàn)葉片萎蔫及植株死亡表型時溫度降至25℃，并在25℃恢復7d后統(tǒng)計各自交系的存活率。

2結果與分析

2.1ZmEXO70s基因家族成員鑒定及蛋白理化性質分析結果

根據(jù)氨基酸序列相像性比對及NCBI數(shù)據(jù)庫BLASTp序列比對等生物信息學分析，共鑒定出36個ZmEXO70s基因家族成員，其GenBank登錄號、染色體位置、基因長度及編碼蛋白的理化性質如表1所示。36個ZmEXO70s基因分布在10條染色體上，基因序列長度和氨基酸數(shù)目各不一致，其中ZmEXO70G1a基因序列長度為228～3726bp，編碼75～1241個氨基酸殘基，蛋白分子量為8.6～136.6kD，理論等電點（pI）為4.5～9.9，大部分蛋白理論等電點小于7.0。

2.2ZmEXO70s蛋白系統(tǒng)發(fā)育進化分析結果

為了探究玉米與其他物種EXO70蛋白的同源進化關系，將已知的23個AtEXO70s蛋白（Chongetal.，2022）、41個OsEXO70s蛋白（Cvr?kováetal.，2022）和本研究鑒定出的36個ZmEXO70s蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析，結果如圖1-A所示。擬南芥、水稻和玉米的EXO70s蛋白可分為9組（A組～I組），各組數(shù)目不一致，以E組數(shù)目最少、I組數(shù)目最多。結合前人構建的AtEXO70s和OsEXO70s蛋白系統(tǒng)發(fā)育進化樹（Chongetal.，2022;Cvr?kováetal.，2022），對ZmEXO70s基因家族成員進行系統(tǒng)命名。由圖1-B可知，各組蛋白間有較高的同源性，十字花科植物擬南芥的AtEXO70s蛋白在不同組中均聚在同一小分支，OsEXO70s和ZmEXO70s蛋白則聚在其他小分支，究其原因可能是水稻和玉米同為禾本科植物，二者親緣關系較近。由表2可知，ZmEXO70s蛋白在不同組中均有分布，數(shù)目較多的是F組和I組，分別含有8和6個;數(shù)目最少的是E組和H組，分別只有1個;I組中只包含ZmEXO70s和OsEXO70s蛋白，分別為6和16個;在親緣關系較近的F組和I組中，ZmEXO70s與OsEXO70s蛋白數(shù)量相近，但明顯多于AtEXO70s蛋白數(shù)量，其原因可能是十字花科植物進化為禾本科植物時水稻和玉米全基因組發(fā)生復制事件并保存下較多基因;H組中ZmEXO70s蛋白數(shù)量遠少于AtEXO70s蛋白數(shù)量，其原因可能是H組中編碼ZmEXO70s蛋白的基因在玉米全基因組復制事件中發(fā)生基因丟失現(xiàn)象（表2）。綜上所述，ZmEXO70s蛋白在系統(tǒng)發(fā)育進化上較保守，玉米基因組復制事件可能發(fā)生在禾本科植物分化之后，且大部分編碼ZmEXO70s蛋白的基因被保存，僅部分基因發(fā)生丟失。

2.3ZmEXO70基因結構與保守結構域分析結果

構建36個ZmEXO70s蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，如圖2-A所示。36個ZmEXO70s分為9組，與表2一致。對ZmEXO70s基因結構進行序列結構分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因不含有內含子，僅少數(shù)基因含內含子，且內含子數(shù)量不同，其中內含子數(shù)最多是ZmEXO70D1b基因，含15個內含子。為研究ZmEXO70s蛋白基序組成的多樣性和保守性，利用MEME對其保守基序進行分析，結果如圖2-B所示。36個ZmEXO70s蛋白共含8種基序（Motif1～Motif8），且各基序主要集中在基因的C端，示意ZmEXO70s蛋白C端序列具有較高的保守性。從基序種類來看，B組、D組和E組的ZmEXO70s蛋白保守性更高，包含全部基序，其他組ZmEXO70s在基序種類分布上存在明顯差異，部分成員出現(xiàn)不同種類基序丟失現(xiàn)象，如ZmEXO70G1a蛋白只含有Motif1，ZmEXO70F2c蛋白只含有Motif3。此外，同一組內的ZmEXO70s蛋白含有不同基序，如ZmEXO70A2蛋白缺少Motif1、Motif2和Motif3，但ZmEXO70A1蛋白只含有Motif1、Motif2和Motif3;ZmEXO70F2b和ZmEXO70F2d蛋白只含有Motif2和Motif3，ZmEXO70F2c蛋白只含有Motif3。雖然8種基序的功能尚不明確，但通過Pfam分析保守結構域，結果顯示Motif1～Motif8組成Exo70保守結構域（圖2-C）。

已有研究證明EXO70蛋白C端含有多個高度保守且?guī)в姓姾傻膲A性氨基酸，與帶有負電荷的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸發(fā)生互作，促進胞泌復合體其他亞基募集至胞吐部位（Pe?enkováetal.，2022）。為此，本研究將ZmEXO70s蛋白C端可能與質膜脂質互作有關的氨基酸序列進行多重比對分析，結果如圖3所示。與質膜脂質互作有關的氨基酸序列由65～75個氨基酸組成，包含11個堿性氨基酸（藍色星號）和9個酸性氨基酸（紅色星號），其中有多個氨基酸位點相對保守。除ZmEXO70A1、ZmEXO70G1a、ZmEXO70F2b、ZmEXO70F2c和ZmEXO70F2d不含該段氨基酸序列外，其余31個ZmEXO70s蛋白C端均含該段氨基酸序列。在11個堿性氨基酸中，除第1和10個堿性氨基酸以外，其余9個堿性氨基酸在ZmEXO70s蛋白中保守性較高。在9個酸性氨基酸中，除第1、5和6個以外，其余6個酸性氨基酸在ZmEXO70s中也具有較高的保守性。但目前對這些保守的酸性和堿性氨基酸在Exo70結構域中的功能尚不明了，猜測部分位點的氨基酸差異影響ZmEXO70s蛋白脂質結合能力，進而影響蛋白在細胞中的定位，或是ZmEXO70s蛋白功能差異的重要決定因素。

2.4ZmEXO70s基因在不同組織及非生物脅迫下的表達分析結果

利用玉米B73的RNA-Seq數(shù)據(jù)（Sekhonetal.，2022），對36個ZmEXO70s基因在15個組織中的表達特性進行分析，結果如圖4-A所示。組間和組內的ZmEXO70s基因表達水平均存在明顯差異，其中ZmEXO70A2、ZmEXO70F1a和ZmEXO70AF1b基因表達水平較高，其次是ZmEXO70B1、ZmEXO70B2a、ZmEXO70B2b、ZmEXO70D1a、ZmEXO70D1c、Zm-EXO70D2a、ZmEXO70D2b、ZmEXO70E1、ZmEXO70-F1a、ZmEXO70F1b、ZmEXO70F2a、ZmEXO70F2b、ZmEXO70G1b、ZmEXO70G1c和ZmEXO70G2等15個ZmEXO70s基因，表達水平也較高，猜測這些Zm-EXO70s基因是玉米生長發(fā)育中的重要調控基因;剩余基因的表達水平相對較低。值得注意的是，Zm-EXO70B3基因在雄穗、花藥、葉片和花絲中高表達，ZmEXO70C1a基因僅在雄穗和花藥中高表達，ZmEXO70D2b基因在胚乳和萌發(fā)種子中低表達，ZmEXO70G1c基因在花絲和萌發(fā)種子中低表達。

利用Li等（2022）的RNA-Seq數(shù)據(jù)（PRJNA244661和PRJNA335771）分析ZmEXO70s基因在干旱、高溫、高鹽和低溫等非生物脅迫下的表達模式，結果如圖4-B所示。在36個ZmEXO70s基因中，有23個ZmEXO70s基因至少可響應一種非生物脅迫，說明這些ZmEXO70s基因響應非生物脅迫，其余13個ZmEXO70s基因可能表達量極低，在RNA-Seq數(shù)據(jù)中未檢測出。干旱脅迫下，ZmEXO70D1和ZmEXO70I2基因上調表達，ZmEXO70A1、ZmEXO70B3、ZmEXO-70D1a、ZmEXO70G1c和ZmEXO70I6基因下調表達。高溫脅迫下，ZmEXO70s基因表現(xiàn)出不同的表達模式，如ZmEXO70D2b、ZmEXO70E1、ZmEXO70F2a和ZmEXO70F4基因上調表達，而ZmEXO70F1b、ZmEXO70H1和ZmEXO70I6基因下調表達。高鹽脅迫和低溫脅迫下，大多數(shù)ZmEXO70s基因被誘導上調表達，僅少數(shù)基因表達受到抑制，如ZmEXO70G1c和ZmEXO70H1基因在高鹽和低溫脅迫下均下調表達，ZmEXO70A1和ZmEXO70A1基因在低溫脅迫下的表達微弱下調。猜測大多數(shù)ZmEXO70s基因在非生物脅迫響應過程中發(fā)揮重要調控作用。

2.5ZmEXO70s基因遺傳變異與玉米苗期耐熱性的關聯(lián)分析結果

利用基因家族關聯(lián)分析方法檢測ZmEXO70s基因的遺傳變異與玉米苗期耐熱性是否關聯(lián)。玉米苗期耐熱性是以玉米3葉1心期植株經持續(xù)高溫脅迫下植株存活率為衡量指標。首先對AM368群體ZmEXO70s基因進行SNP分析，結果如表3所示。有31個ZmEXO70s基因含SNP位點，平均SNP位點數(shù)為21個，其中以ZmEXO70F2a基因SNP位點數(shù)最多，達85個。隨后采用2種統(tǒng)計模型來分析基因型與表型間的相關性，結果如圖5所示。通過GLM分析發(fā)現(xiàn)，ZmEXO70D2a、ZmEXO70E1和ZmEXO70I2基因的遺傳變異與苗期耐熱性存在顯著相關性（P≤0.01）。通過MLM分析發(fā)現(xiàn)，ZmEXO70D2a和ZmEXO70E1基因分別有2個SNP位點與苗期耐熱性呈極顯著相關（P≤0.001，下同）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ZmEXO70E1基因的2個SNP位點位于其5"-非編碼區(qū)（UTR）（圖6-A）;ZmEXO70D2a基因的2個SNP位點位于其編碼區(qū)（圖6-B）。

3探討

玉米是目前我國種植面積最大的作物。隨著測序技術不斷發(fā)展和玉米全基因組測序的完成，為玉米基因家族鑒定、功能基因挖掘及基因功能研究等提供極有利的先決條件。雖然現(xiàn)已證明不同植物中EXO70s蛋白參與細胞壁形成、細胞分泌和抗逆應答等重要細胞學過程（Sekere?etal.，2022;Kulichetal.，2022），但目前鮮見有關ZmEXO70s基因家族的研究報道。本研從玉米基因組中共鑒定出36個ZmEXO70s基因，說明EXO70s蛋白在玉米中與其他植物一樣，均為多拷貝。植物EXO70s蛋白多拷貝現(xiàn)象可能是由于植物具有多種多樣的細胞壁及繁雜的液泡結構，需要多種胞泌復合體滿足其適應環(huán)境的需要，進而演化出不同基因特有的調控機制（Eliasetal.，2022;Chongetal.，2022）。ZmEXO70s基因家族成員數(shù)（36個）與高梁Ex070s（SbEXO70s）基因家庭數(shù)目（31個）相當，但比AtEXO70s基因家族成員數(shù)（23個）多，比OsEXO70s基因家族成員數(shù)（41個）少，可能是由于禾本科植物（水稻、玉米和高粱）在物種形成和進化過程中發(fā)生了全基因組復制和二倍體化，從而導致其EXO70s基因家族成員數(shù)目比十字花科的擬南芥多，且玉米和高粱在進化過程中經歷染色體的丟失和融合，導致二者的EXO70s基因家族成員數(shù)目均比水稻少。

基因表達模式示意其所行使的生物學功能。已有研究說明，胞泌復合體負責將高爾基囊泡栓系到細胞質膜上，其基因缺失或突變均會導致其失去該生物學功能（Koumandouetal.，2022;Drdováetal.，2022）。本研究對36個ZmEXO70s基因在15個組織中的表達水平進行分析，結果顯示大多數(shù)Zm-EXO70s基因在玉米組織中均有表達，猜測這些ZmEXO70s基因是玉米生長發(fā)育中重要調控基因，其中，ZmEXO70B3和ZmEXO70C1a基因在雄穗和花藥中高表達。Li等（2022）也研究發(fā)現(xiàn)，AtEXO70C1基因在成熟花粉中高效表達，當其發(fā)生突變后會導致花粉管生長遲鈍，花粉的傳遞效率下降。可見，植物EXO70s基因家族中部分成員可能參與調控植株花粉發(fā)育過程。此外，已有研究說明，囊泡運輸相關蛋白通過參與非生物脅迫下的質膜修復增加植物對低溫、高鹽等非生物脅迫的耐受性（Yamazakietal.，2022;KimandBassham，2022;Drakakakietal.，2022），但針對胞泌復合體在非生物脅迫應答響應過程的功能研究較少。本研究通過分析ZmEXO70s基因在干旱、高溫、高鹽和低溫等非生物脅迫下的表達模式，結果顯示36個ZmEXO70s基因中有23個ZmEXO70s至少響應一種非生物脅迫，示意ZmEXO70s基因可能參與調控植物非生物脅迫響應過程，為進一步表明植物胞泌復合體功能的分子機制提供理論依據(jù)。

雖然玉米來源于熱帶，但仍對高溫環(huán)境敏感，當氣溫超過35℃時，玉米植株整個生命周期（營養(yǎng)生長和生殖生長）均會受到影響（牛麗等，2022;Shietal.，2022;石江等，2022），如春播玉米在抽雄吐絲期、夏播青儲玉米在幼苗出土期遭遇高溫熱害的問題在我國玉米生產上表現(xiàn)