生化反應(yīng)器動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)

第五章

動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)

5．1動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是一項(xiàng)將動(dòng)植物組織、器官或細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。組織是指由結(jié)構(gòu)和功能相似的細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)組成，具有一定形態(tài)和生理功能的聚集體。器官是指機(jī)體中具有特殊結(jié)構(gòu)和完成特殊功能的分化部分。組織與器官的培養(yǎng)是指在人工條件下，使它們得以繼續(xù)生存或發(fā)展的一種培養(yǎng)方法。根據(jù)培養(yǎng)對象的不同，細(xì)胞培養(yǎng)分為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與植物細(xì)胞培養(yǎng)兩類，下面介紹這兩類細(xì)胞培養(yǎng)的基本特征。

5．1．1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特性由于動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)具有明顯的表達(dá)產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)，為傳統(tǒng)微生物發(fā)酵所無法取代，因此，生物技術(shù)中許多有價(jià)值的生物制品，需要借助于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)而獲得，這種需求極大地促進(jìn)了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。

早在1907年，美國的Harrison在世界上首次將蛙的神經(jīng)組織在試管內(nèi)培養(yǎng)成功，建立起動(dòng)物組織體外培養(yǎng)的第一塊基石。1950年前后，Enders及其同事發(fā)表了第一篇關(guān)于在培養(yǎng)細(xì)胞中生長病毒的報(bào)告，開拓了以動(dòng)物病毒為研究對象的新領(lǐng)域。當(dāng)時(shí)人們已知道在細(xì)胞培養(yǎng)物中存在一些有特殊功能的蛋白質(zhì)，如干擾素、抗生素、疫苗等，但是由于動(dòng)物細(xì)胞的營養(yǎng)要求復(fù)雜，培養(yǎng)要求嚴(yán)格，長期以來未能利用細(xì)胞培養(yǎng)來進(jìn)行有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的物質(zhì)的生產(chǎn)。作為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，Copsik等成功地進(jìn)行了有關(guān)倉鼠腎細(xì)胞(BHK)的懸浮培養(yǎng)。隨后，細(xì)胞培養(yǎng)的原理與方法日臻完善。采用在培養(yǎng)液中添加人工合成的小球狀惰性聚合體載體，大幅度提高了細(xì)胞的產(chǎn)量，并在10000L發(fā)酵罐內(nèi)成功地進(jìn)行深層培養(yǎng)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到有許多基因產(chǎn)物不能在原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，它們需要經(jīng)過真核細(xì)胞所特有的翻譯后修飾，以及正確的切割、折疊后，才能形成與自然分子一樣的功能和抗原性，使得動(dòng)物細(xì)胞一躍成為一種重要的宿主細(xì)胞，用以生成多種生物制品，如病毒疫苗、淋巴因子(如r干擾素等)、單克隆體、紅細(xì)胞生成素、纖維蛋白溶酶原激活劑、第八因子、腫瘤壞死因子、上皮生長因子和過氧化物歧化酶等。采用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)貴重藥品在臨床診斷、治療和預(yù)防等方面都有重要意義。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)對比有許多不同點(diǎn)(表5—1)。主要是動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；生長速度緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需要抗生素，且大多數(shù)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞需附著在固體或半固體的表面才能生長；對營養(yǎng)要求嚴(yán)格；大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，不可簡單地套用微生物培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)等。

大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的主要危險(xiǎn)之一是微生物污染。設(shè)備、培養(yǎng)基、懸浮系統(tǒng)和操作方法等的復(fù)雜性都易引起微生物污染，這是細(xì)胞培養(yǎng)都存在的一個(gè)普遍問題，在大規(guī)模培養(yǎng)中更為嚴(yán)重。動(dòng)物細(xì)胞生長十分緩慢，并易被大多數(shù)微生物污染物所破壞。支原體(mycoplasma)對動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的威脅最大，因?yàn)槠涓腥玖?qiáng)且不易檢出。因此，大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)成功的必要條件是要有一個(gè)設(shè)備精良的細(xì)胞庫(cellbank)。在細(xì)胞庫中的冷凍細(xì)胞不受污染。

由于動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，因此人們一般認(rèn)為細(xì)胞的脆性是導(dǎo)致培養(yǎng)控制(如溶氧)復(fù)雜化的關(guān)鍵。然而，選擇堅(jiān)韌的細(xì)胞，就不存在上述問題。經(jīng)仔細(xì)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)裝置可使細(xì)胞懸浮液很好混合，在向培養(yǎng)基內(nèi)流加基質(zhì)和輸送氣體時(shí)也不會(huì)損壞細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的配方十分復(fù)雜，并且還需補(bǔ)充血清和蛋白胨。原料的質(zhì)量控制和培養(yǎng)基的生產(chǎn)是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的主要問題。因?yàn)檠鍋碓蠢щy，質(zhì)量不穩(wěn)定，殘留血清給產(chǎn)物提純帶來困難等，所以，常采用無血清培養(yǎng)基。但是，在無血清培養(yǎng)基中更可能出現(xiàn)細(xì)胞毒(與水中的微量元素或有機(jī)污染有關(guān))。

因此，與培養(yǎng)物相接觸的水必須采用高純度的水。高純度水的腐蝕性很強(qiáng)，并且有從金屬物瀝出元素的能力，所以，凡是與純水接觸的不銹鋼容器和管道的表面都必須進(jìn)行適當(dāng)處理。培養(yǎng)基一般需經(jīng)膜過濾器過濾。常用的膜過濾器可保證其無菌狀態(tài)，甚至支原體也可被0．1um的過濾膜濾出。目前，利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法生產(chǎn)的有用產(chǎn)品大致可分為4大類：①疫苗；②干擾素；③單克隆抗體；④遺傳重組產(chǎn)品。

總之，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程的特征是：(1)生長速率慢，易被微生物污染，但可采用在培養(yǎng)基中加入抗生素等措施來解決。(2)細(xì)胞個(gè)體大且無壁，對環(huán)境敏感，因此應(yīng)慎重解決供氧(攪拌與通風(fēng))與細(xì)胞脆弱的矛盾。(3)設(shè)備放大是一新課題，不能完全按照微生物反應(yīng)過程的經(jīng)驗(yàn)。(4)反應(yīng)過程成本高，主要用于高附加值產(chǎn)物的生產(chǎn)。5．1.2植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性

有關(guān)植物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)研究很多，而工業(yè)規(guī)模應(yīng)用卻較少。早在1902年，出生于奧地利的德國植物學(xué)家巳Haberlandt就預(yù)言植物細(xì)胞培養(yǎng)的可能性。1937年前后，法國和美國科學(xué)家分別成功地進(jìn)行了胡蘿卜和煙草的組織培養(yǎng)。隨后，人們認(rèn)識(shí)到生長素等植物激素在組織培養(yǎng)中的作用。1966年Klein指出，能利用植物細(xì)胞培養(yǎng)物代替栽培植株來生產(chǎn)生化制品。近40年來，植物細(xì)胞培養(yǎng)研究成功的例子已有不少，如用紫草懸浮培養(yǎng)物生產(chǎn)紫草寧，煙草細(xì)胞的大量培養(yǎng)等。與微生物相比，植物細(xì)胞具有這樣一些特性(表4—1)：①細(xì)胞個(gè)大，并且細(xì)胞壁是以纖維素為主要成分，耐拉不耐扭，因此，抗剪切能力低。②與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)類同，生長速率慢，為防止培養(yǎng)過程中染菌，需加抗生素。③細(xì)胞培養(yǎng)需氧，而培養(yǎng)液黏度大，且不能強(qiáng)力通風(fēng)攪拌。④產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)且產(chǎn)量低。⑤培養(yǎng)的植物細(xì)胞常生長成各種大小的團(tuán)塊(從幾個(gè)細(xì)胞到幾百個(gè)細(xì)胞)，增加了懸浮培養(yǎng)的難度等。生長緩慢等是植物細(xì)胞的先天不足，然而它能產(chǎn)生一些微生物所不能合成的特有代謝產(chǎn)物，如朝鮮參皂角苷、桉樹油和某些生物堿等。植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)這些有用物質(zhì)提供了新途徑。細(xì)胞培養(yǎng)用于試管苗生產(chǎn)，如蘭花等名貴花卉的培育，可以不受環(huán)境的影響。

利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，有產(chǎn)品規(guī)格好；易達(dá)到供需平衡；生產(chǎn)占地少等優(yōu)點(diǎn)。進(jìn)入20世紀(jì)90年代以來，伴隨著紫杉醇的研究成功并應(yīng)用于臨床，植物細(xì)胞培養(yǎng)及其次級代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)入了新的發(fā)展時(shí)期，尤其是誘導(dǎo)子、前體飼喂、兩相法培養(yǎng)、質(zhì)體轉(zhuǎn)化、毛狀根和冠癭瘤組織培養(yǎng)等新技術(shù)和新方法的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展，更顯示了植物細(xì)胞培養(yǎng)工程在制藥領(lǐng)域的廣闊發(fā)展前景。另外，將固定化技術(shù)應(yīng)用于植物細(xì)胞培養(yǎng)中的研究對有效改善植物細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)的不足有一定成效。可以認(rèn)為，固定化技術(shù)有可能在植物細(xì)胞培養(yǎng)中得以應(yīng)用。

5．2生長模型與培養(yǎng)條件

5．2．1動(dòng)植物細(xì)胞的生長模型微生物的生長是多種環(huán)境因子與細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的代謝反應(yīng)的綜合結(jié)果，生長與環(huán)境因子的關(guān)系目前還難以用簡單的方程式來表達(dá)。同理，動(dòng)植物細(xì)胞生長是細(xì)胞與影響細(xì)胞生長的環(huán)境因子相互作用的綜合結(jié)果，并且其研究還處于萌芽階段。

5．2．1．1碳源與生長模型

微生物反應(yīng)中，細(xì)胞的生長速率與限制性基質(zhì)間的關(guān)系常用Monod方程來描述。同理，Monod方程也可以用于表達(dá)某些碳源與動(dòng)植物細(xì)胞生長速率間的關(guān)系。例如，在植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，多以蔗糖為碳源，據(jù)安田報(bào)道，煙草細(xì)胞在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長速率與蔗糖濃度的關(guān)系可利用Monod方程來表達(dá)，此時(shí)umax＝0．023h-1，Ks＝2．35g/L。蔗糖為碳源時(shí)，植物細(xì)胞首先分解蔗糖為葡萄糖和果糖，然后優(yōu)先利用葡萄糖。分別以果糖或葡萄糖為碳源分批培養(yǎng)煙草細(xì)胞時(shí)，前者有umax＝0．038h-1，Ks=0．25g／L，后者為umax=0．038h-1，Ks＝0．94g／L。5．2．1．2呼吸與生長模型

由于動(dòng)植物細(xì)胞的培養(yǎng)過程是好氧過程，因此，許多科技工作者研究了與細(xì)胞呼吸速率相關(guān)的因素。例如，人參細(xì)胞培養(yǎng)中，添加椰子汁后細(xì)胞的生長速率加快，耗氧量比不添加椰子汁時(shí)明顯增大。另外，也有報(bào)道，Acer．PsedoplatanusL．細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞體內(nèi)的含氮量與耗氧量有正比關(guān)系。一般好氧微生物的比生長速率u與菌體的維持常數(shù)m及氧的比消耗速率Qo2有如下關(guān)系：據(jù)加藤等所獲得的煙草細(xì)胞分批培養(yǎng)的結(jié)果表明，當(dāng)氧為細(xì)胞生長的限制性因素時(shí),u與Q02有與(5—1)式相似的關(guān)系。這說明，植物細(xì)胞培養(yǎng)中氧的消耗，部分用于維持代謝，部分用于生長繁殖，所獲得的m＝0．09mmol／(g·h)，Y＝0．061g／mmol，與一般微生物的m和Y值相比，m很小而Y較大。這可能是植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的重要特性。5．2．1．3胞內(nèi)物質(zhì)與生長模型

微生物培養(yǎng)中，把細(xì)胞內(nèi)RNA含量作為描述其生長速率的指標(biāo)，且隨微生物比生長速率的增加，RNA含量增大。植物細(xì)胞培養(yǎng)中，也有類似的報(bào)道。吉田等在進(jìn)行人參細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在對數(shù)生長期，細(xì)胞的RNA含量顯著增大。培養(yǎng)煙草細(xì)胞時(shí)，人們詳細(xì)研究了細(xì)胞的比生長速率與細(xì)胞內(nèi)RNA的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與一般微生物相似，可以用一次方程表達(dá)，即綜上所述，動(dòng)植物細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)的研究，在很大程度上是借鑒了微生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論。從已有的實(shí)例看，又多屬于定性探討。

5．2．2動(dòng)植物細(xì)胞的培養(yǎng)操作

5．2．2．1植物細(xì)胞的培養(yǎng)操作植物細(xì)胞的培養(yǎng)方式根據(jù)植物細(xì)胞所處狀態(tài)的不同，分為懸浮培養(yǎng)法與固定化植物細(xì)胞培養(yǎng)法，根據(jù)操作方式的不同，又分為分批式、反復(fù)分批式和連續(xù)式培養(yǎng)3種。下面以懸浮培養(yǎng)法(分批、反復(fù)分批和連續(xù)培養(yǎng))為例進(jìn)行介紹。

(1)分批培養(yǎng)植物細(xì)胞的分批培養(yǎng)與微生物的分批培養(yǎng)類同。由于操作簡單，從實(shí)驗(yàn)室到大型罐廣泛應(yīng)用。分批培養(yǎng)中，植物細(xì)胞的生長曲線一般呈s形，可明顯觀察出誘導(dǎo)期、對數(shù)生長期、減速期、靜止期和衰亡期(死亡期)，但是與細(xì)菌和酵母菌的培養(yǎng)相比，即使是生長速率快的煙草細(xì)胞，分批培養(yǎng)時(shí)間(一個(gè)周期)也要6d以上，這也就是前面所說的植物細(xì)胞培養(yǎng)的先天不足——生長緩慢。

表5—2表示某些植物細(xì)胞分批培養(yǎng)中對數(shù)生長期的u與微生物的比較。即使已知生長較快的煙草細(xì)胞的平均世代時(shí)間也要15．8h(u＝0.044h-1)，不到酵母比生

長速率的l／10。因此，有必要開發(fā)長期無菌培養(yǎng)技術(shù)。

目前，無論在實(shí)驗(yàn)室還是在工廠中，大至20t罐，廣泛采用分批式操作。藤田開發(fā)的二步培養(yǎng)法是分批培養(yǎng)法的一種變形，同時(shí)使用兩個(gè)反應(yīng)器，第一個(gè)反應(yīng)器主要是為大量培養(yǎng)細(xì)胞，第二個(gè)反應(yīng)器是為增加目的產(chǎn)物的含量。分批培養(yǎng)中，在一定范圍內(nèi)增加底物濃度，可增加目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，但濃度過高又會(huì)造成接種細(xì)胞的死亡。(2)反復(fù)式分批培養(yǎng)若反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液體積為V，補(bǔ)加量為F'(等于取出量)，則比值F'／V稱為替換率D'。D'與連續(xù)培養(yǎng)中的稀釋率D不同，其與培養(yǎng)液取出至加入完成期間的比生長速率u'有如下關(guān)系：(3)連續(xù)培養(yǎng)由于連續(xù)培養(yǎng)可以保證細(xì)胞生長環(huán)境長時(shí)間的穩(wěn)定，因此，在研究細(xì)胞的生理或代謝等方面時(shí)，連續(xù)培養(yǎng)是一種重要的培養(yǎng)方法。與微生物的連續(xù)培養(yǎng)相同，對于單罐連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)，與細(xì)胞生長相關(guān)的物料衡算式為：一般連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)率高于分批培養(yǎng)的，但由于植物細(xì)胞生長速率慢，維持長時(shí)間的無菌狀態(tài)是需要解決的基本技術(shù)問題。另外，單罐連續(xù)培養(yǎng)法并不能適應(yīng)各種反應(yīng)，因此，有必要開發(fā)一些新的方法。

5．2．2．2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法有兩種類型，一類是非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，來源于血液、淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞(包括雜交瘤細(xì)胞)和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞屬于這一類型，其可采用類似微生物培養(yǎng)的方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。另一類是貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞，包括非淋巴組織的細(xì)胞和許多異倍體體系的細(xì)胞屬于這一類型，它們需要附著于適量正電荷的固體或半固體的表面生長。

能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞是一類能無限繁殖的細(xì)胞，這樣的細(xì)胞又稱為確立細(xì)胞株。由于動(dòng)物細(xì)胞對剪切力的敏感，豐富培養(yǎng)基容易形成過多泡沫，這都增加了反應(yīng)器操作的難度。懸浮培養(yǎng)多采用分批式操作方法，其原理與植物細(xì)胞的類同。另外，適用于動(dòng)物細(xì)胞的還有一種連續(xù)式操作方法——灌流培養(yǎng)法。這種方法是把細(xì)胞置于某種封閉系統(tǒng)中，連續(xù)注入新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)，連續(xù)等量排出用過的培養(yǎng)基，但不排出懸浮的細(xì)胞。

采用這種方法后，從產(chǎn)物開始分泌時(shí)起，便可用快速純化方法不斷地從流出培養(yǎng)基中收集目的產(chǎn)物。雖然灌流培養(yǎng)系統(tǒng)具有以上優(yōu)點(diǎn)，但也存在培養(yǎng)基消耗量比一般懸浮培養(yǎng)高幾倍，工作過程復(fù)雜，培養(yǎng)物易受污染和培養(yǎng)細(xì)胞不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。灌流培養(yǎng)系統(tǒng)可分為3類：①微小均質(zhì)系統(tǒng)，如灌流懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，微載體系統(tǒng)；②巨大均質(zhì)系統(tǒng)，如把細(xì)胞包埋在微小球或凝膠中；③非均質(zhì)系統(tǒng)，如邊灌流邊用過濾膜將細(xì)胞加以固定。上述灌流培養(yǎng)方法屬于微小均質(zhì)系統(tǒng)中的灌流懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞需附著在固體或半固體表面生長，生長的細(xì)胞最終擴(kuò)展成一單層，所以這種貼壁依賴培養(yǎng)有時(shí)又稱為單層培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞能否在載體表面附著生長以達(dá)到擴(kuò)展成一單層的目的，取決于細(xì)胞的特性、載體的理化性質(zhì)及培養(yǎng)基成分。例如，瓊脂糖是一種天然材質(zhì)，如果注意控制熔融后的冷卻速率，使凝膠緩慢生成，則瓊脂糖鏈形成纖維狀結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)的瓊脂糖能支持細(xì)胞在其表面上附著生長。相反，冷卻迅速的瓊脂凝膠不能支持細(xì)胞在其表面附著生長。