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文檔簡介

質(zhì)粒DNA的提取與酶切電泳鑒定質(zhì)粒提取關(guān)鍵：基因組DNA與質(zhì)粒DNA的有效分離（堿裂解法）

高pH使質(zhì)粒DNA和染色體DNA變性，同時沉淀蛋白質(zhì)。再將pH值調(diào)至中性，質(zhì)粒DNA較小，很容易復(fù)性成雙鏈。而染色體DNA較大，不會復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀不溶物質(zhì)，從而可以通過離心除去。注意事項:實驗方法

堿裂解法

1、挑取攜帶目標(biāo)DH5α單菌落于3-5mlLB（含Amp100μg/ml）,37℃振蕩培養(yǎng)過夜（12-16h）；2、取2ml培養(yǎng)液倒入1.5mlEP管中（分次加入，離心），4℃12000rpm離心30s-1min，棄去上清；3、用渦旋混勻器使菌體沉淀重懸浮于250μl冰預(yù)冷的溶液Ⅰ。4、加入新配制的溶液Ⅱ250μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒離心管5次，菌液變得透亮，以混勻內(nèi)容物（千萬不要振蕩）。5、加入350μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，反復(fù)顛倒離心管5次，出現(xiàn)白色沉淀，使沉淀混勻，4℃

12000rpm離心10分鐘。

6、上清液移入干凈離心管中，加入等體積的酚/氯仿（1:1），振蕩混勻，4℃下12000rpm離心2分鐘。7、將上層水相移入干凈離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻后室溫放置2分鐘，然后4℃下12000rpm離心5分鐘。8、徹底棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000rpm離心2分鐘。9、吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，室溫開蓋放置10-15min，使乙醇揮發(fā)殆盡。10、將沉淀溶于30-50μlTE緩沖液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，儲于-20℃冰箱中。11、酶切鑒定并將沒有酶切的質(zhì)粒與酶切的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（酶切體系一般1-2ul提取

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