WesternBlot詳解及問(wèn)題分析課件

蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及常見(jiàn)問(wèn)題分析張紹進(jìn)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及張紹進(jìn)1WesternBlot簡(jiǎn)介WesternBlot一般流程WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析WesternBlot簡(jiǎn)介WesternBlot簡(jiǎn)介：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱(chēng)為Southern印跡法。而后人們用類(lèi)似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱(chēng)為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱(chēng)為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱(chēng)為Eastern印跡法。WesternBlot簡(jiǎn)介：印跡法（blotting）是WesternBlot基本原理WesternBlot基本原理WesternBlot優(yōu)點(diǎn)

高分辨率的電泳技術(shù)特異敏感的抗原-抗體反應(yīng)1-5ng中等大小的靶蛋白WesternBlot優(yōu)點(diǎn)高分辨率的電泳技術(shù)WesternBlot應(yīng)用目的蛋白的表達(dá)特性分析目的蛋白與其它蛋白的互作目的蛋白的組織定位目的蛋白的表達(dá)量分析WesternBlot應(yīng)用目的蛋白的表達(dá)特性分析WesternBlot流程蛋白樣品的制備SDS轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色WesternBlot流程蛋白樣品的制備通過(guò)有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法針對(duì)水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。有機(jī)溶劑提取法對(duì)于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通過(guò)層析或電洗脫法制備目的蛋白蛋白樣品的提取通過(guò)有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白蛋白樣品的提取蛋白樣品的定量目前常用比色法測(cè)定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）、Lowry法（Folin-酚試劑法）、BCA法等。但各有優(yōu)缺點(diǎn)，大家可以根據(jù)具體情況選取。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說(shuō)明操作，測(cè)定樣品濃度。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的各種方法匯總：/thread-23639-1-1.html蛋白樣品的定量目前常用比色法測(cè)定樣品蛋白的含量：Bradfo蛋白樣品的變性2×SDS上樣緩沖液：DTT可臨用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分裝，-20℃凍存。按1:1比例與蛋白質(zhì)樣品混合，95～100℃加熱5～15min，冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為20-25μl，總蛋白量20～50μg。1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚藍(lán)0.2g總體積100ml100mMTris-HCl(pH6.8)200mMDTT4%SDS0.2%溴酚蘭20%甘油ddH2O蛋白樣品的變性2×SDS上樣緩沖液：1MTrisSDS：陰離子去污劑變性劑氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異。與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，使蛋白質(zhì)分子線性化。SDS：陰離子去污劑變性劑蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點(diǎn)：（1）具有相同的形狀，形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒

（2）平均1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4gSDS（3）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的（4）長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分子量的大小成正比蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點(diǎn)：（1）具有相同的形狀，形狀像一個(gè)長(zhǎng)不連續(xù)的電泳緩沖體系。SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時(shí)，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳不連續(xù)的電泳緩沖體系。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS

是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，它可以斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）可以斷開(kāi)二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基的相對(duì)分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無(wú)關(guān)。【SDS基本原理】SDS是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的凝膠成分丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過(guò)硫酸銨Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成分丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺PAGE：聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠?；瘜W(xué)惰性強(qiáng)，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和透明度。是良好的電泳介質(zhì)。PAGE：聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(polya聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：?jiǎn)误w：丙烯酰胺（Acr）；交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；催化劑：過(guò)硫酸胺或核黃素（AP）；加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）；產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是通過(guò)提供氧游離基(freeradicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redoxsystems)來(lái)完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（AP—TEMED）和光化學(xué)催化（核黃素——TMTED）體系。聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：?jiǎn)误w：丙烯酰胺（Acr）；聚丙烯酰凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS濃縮膠(5%Acrylamide)及分離膠配方表：/thread-20726-1-1.html

凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)15不連續(xù)電泳：

作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠使蛋白樣品濃縮pH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠使蛋白樣品分離pH8.8Tris-Cl高，根據(jù)蛋白大小電泳緩沖液：pH8.3Tris-甘氨酸系統(tǒng)。不連續(xù)電泳：作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠使蛋白樣品濃灌制分離膠隔絕空氣ddH2O0.1%SDS:<8%異丁醇：>8%灌制分離膠隔絕空氣ddH2O灌制積層膠插入梳子灌制積層膠插入梳子StakinggelSeparatinggelStakinggelSeparatinggel轉(zhuǎn)膜要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜）上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場(chǎng)的機(jī)械裝置不同。轉(zhuǎn)膜要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜轉(zhuǎn)移膜的選擇最常用于WesternBlot的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和NC膜的特點(diǎn)相似,主要用于核酸雜交。各種膜的詳細(xì)特點(diǎn)介紹：/bio101/2008/21461_2.htm轉(zhuǎn)移膜的選擇最常用于WesternBlot的轉(zhuǎn)移膜主要是硝濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)麗春紅染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色

只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的Western印跡過(guò)程。轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)（此步可以省略）麗春紅染色轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)（此步可以省略）封閉為避免作為檢測(cè)試劑的特異性第一抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景提高，需對(duì)膜上的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理。5%脫脂奶粉或BSA（室溫孵育1h）WesternBlot膜封閉液（生物試劑公司）Tween-20的作用：減少非特異性吸附，不影響抗體與抗原的結(jié)合。封閉為避免作為檢測(cè)試劑的特異性第一抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，一抗、二抗孵育把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜?；厥找豢谷芤?，用TBST漂洗膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜?；厥找豢谷芤海肨BST漂洗膜3次，每次10min。最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。一抗、二抗孵育把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過(guò)氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過(guò)氧化物酶法（HRP）膜解吸方法（膜的重復(fù)利用）

通過(guò)加熱和去污劑進(jìn)行解吸

原理：組合使用去污劑和加熱使抗體解離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。酸解吸

原理：使用低pH改變抗體結(jié)構(gòu)從而使結(jié)合位點(diǎn)失活，從而將抗體與抗原分離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。膜解吸方法（膜的重復(fù)利用）通過(guò)加熱和去污劑進(jìn)行解吸WesternBlot結(jié)果分析目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。WesternBlot結(jié)果分析軟件Gel-ProAnalyzer4綠色版（附動(dòng)畫(huà)演示教程）/thread-44929-1-1.html

WesternBlot結(jié)果分析目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入AP和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對(duì)齊SDS電泳膠不平？膠板洗刷干凈條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動(dòng)作輕緩拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過(guò)高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適SDS電泳條帶比正常的窄？凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動(dòng)作輕轉(zhuǎn)膜及抗體檢測(cè)凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？轉(zhuǎn)膜緩沖液過(guò)熱？可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙確保膜和膠塊之間沒(méi)有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過(guò)程注意降溫轉(zhuǎn)膜及抗體檢測(cè)凝膠腫脹或卷曲？可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白很少蛋白分子量<

10KD蛋白的等電點(diǎn)<9SDS濃度不合適凝膠太厚

原因?qū)Σ叩鞍追肿恿?lt;10KD時(shí)，減少轉(zhuǎn)膜時(shí)間；使用小孔徑的膜更換高pH值Buffer在陰極buffer中加入0.005-0.01%SDS可提高轉(zhuǎn)膜效率延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白很少蛋白分子量<10KD原因?qū)Φ鞍追肿恿磕](méi)有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過(guò)高

原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度背景太高膜沒(méi)有均勻浸濕原因?qū)D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕背景太雜交信號(hào)很弱抗體保存不當(dāng)抗原不充足膜的漂洗過(guò)度

原因?qū)Σ呖贵w長(zhǎng)期保存應(yīng)在－70℃，使用前做效價(jià)檢測(cè)增加蛋白上樣量，做已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對(duì)照減少漂洗的時(shí)間和次數(shù)雜交信號(hào)很弱抗體保存不當(dāng)原因?qū)贵w長(zhǎng)期保存應(yīng)在－70℃，使一抗不是唯一特異的二抗出現(xiàn)非特異結(jié)合

原因?qū)Σ咧苽鋯慰寺】贵w或者重新選取合成抗原多肽的位點(diǎn)設(shè)立不加一抗，只加二抗的平行對(duì)照來(lái)檢測(cè)二抗是否有非特異結(jié)合出現(xiàn)非特異帶一抗不是唯一特異的原因?qū)χ苽鋯慰寺】贵w或者重新選取合成抗原FurtherReadings生物秀WesternBlotting專(zhuān)題/special/experiment/WesternBlotting.htm

Millipore的蛋白印跡手冊(cè)/thread-45770-1-1.html

Bio-Rad的westernBlotting操作手冊(cè)/thread-30154-1-1.html

Westernblot問(wèn)題解答專(zhuān)帖/thread-40769-1-1.htmlFurtherReadings生物秀WesternBlo謝謝大家！謝謝大家！42蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及常見(jiàn)問(wèn)題分析張紹進(jìn)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及張紹進(jìn)43WesternBlot簡(jiǎn)介WesternBlot一般流程WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析WesternBlot簡(jiǎn)介WesternBlot簡(jiǎn)介：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱(chēng)為Southern印跡法。而后人們用類(lèi)似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱(chēng)為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱(chēng)為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱(chēng)為Eastern印跡法。WesternBlot簡(jiǎn)介：印跡法（blotting）是WesternBlot基本原理WesternBlot基本原理WesternBlot優(yōu)點(diǎn)

高分辨率的電泳技術(shù)特異敏感的抗原-抗體反應(yīng)1-5ng中等大小的靶蛋白WesternBlot優(yōu)點(diǎn)高分辨率的電泳技術(shù)WesternBlot應(yīng)用目的蛋白的表達(dá)特性分析目的蛋白與其它蛋白的互作目的蛋白的組織定位目的蛋白的表達(dá)量分析WesternBlot應(yīng)用目的蛋白的表達(dá)特性分析WesternBlot流程蛋白樣品的制備SDS轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色WesternBlot流程蛋白樣品的制備通過(guò)有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法針對(duì)水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。有機(jī)溶劑提取法對(duì)于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通過(guò)層析或電洗脫法制備目的蛋白蛋白樣品的提取通過(guò)有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白蛋白樣品的提取蛋白樣品的定量目前常用比色法測(cè)定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）、Lowry法（Folin-酚試劑法）、BCA法等。但各有優(yōu)缺點(diǎn)，大家可以根據(jù)具體情況選取。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說(shuō)明操作，測(cè)定樣品濃度。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的各種方法匯總：/thread-23639-1-1.html蛋白樣品的定量目前常用比色法測(cè)定樣品蛋白的含量：Bradfo蛋白樣品的變性2×SDS上樣緩沖液：DTT可臨用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分裝，-20℃凍存。按1:1比例與蛋白質(zhì)樣品混合，95～100℃加熱5～15min，冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為20-25μl，總蛋白量20～50μg。1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚藍(lán)0.2g總體積100ml100mMTris-HCl(pH6.8)200mMDTT4%SDS0.2%溴酚蘭20%甘油ddH2O蛋白樣品的變性2×SDS上樣緩沖液：1MTrisSDS：陰離子去污劑變性劑氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異。與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，使蛋白質(zhì)分子線性化。SDS：陰離子去污劑變性劑蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點(diǎn)：（1）具有相同的形狀，形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒

（2）平均1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4gSDS（3）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的（4）長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分子量的大小成正比蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點(diǎn)：（1）具有相同的形狀，形狀像一個(gè)長(zhǎng)不連續(xù)的電泳緩沖體系。SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時(shí)，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳不連續(xù)的電泳緩沖體系。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS

是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，它可以斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）可以斷開(kāi)二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基的相對(duì)分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無(wú)關(guān)?！維DS基本原理】SDS是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的凝膠成分丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過(guò)硫酸銨Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成分丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺PAGE：聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠?；瘜W(xué)惰性強(qiáng)，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和透明度。是良好的電泳介質(zhì)。PAGE：聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(polya聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：?jiǎn)误w：丙烯酰胺（Acr）；交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；催化劑：過(guò)硫酸胺或核黃素（AP）；加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）；產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是通過(guò)提供氧游離基(freeradicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redoxsystems)來(lái)完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（AP—TEMED）和光化學(xué)催化（核黃素——TMTED）體系。聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：?jiǎn)误w：丙烯酰胺（Acr）；聚丙烯酰凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS濃縮膠(5%Acrylamide)及分離膠配方表：/thread-20726-1-1.html

凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)15不連續(xù)電泳：

作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠使蛋白樣品濃縮pH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠使蛋白樣品分離pH8.8Tris-Cl高，根據(jù)蛋白大小電泳緩沖液：pH8.3Tris-甘氨酸系統(tǒng)。不連續(xù)電泳：作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠使蛋白樣品濃灌制分離膠隔絕空氣ddH2O0.1%SDS:<8%異丁醇：>8%灌制分離膠隔絕空氣ddH2O灌制積層膠插入梳子灌制積層膠插入梳子StakinggelSeparatinggelStakinggelSeparatinggel轉(zhuǎn)膜要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜）上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場(chǎng)的機(jī)械裝置不同。轉(zhuǎn)膜要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜轉(zhuǎn)移膜的選擇最常用于WesternBlot的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和NC膜的特點(diǎn)相似,主要用于核酸雜交。各種膜的詳細(xì)特點(diǎn)介紹：/bio101/2008/21461_2.htm轉(zhuǎn)移膜的選擇最常用于WesternBlot的轉(zhuǎn)移膜主要是硝濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)麗春紅染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色

只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的Western印跡過(guò)程。轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)（此步可以省略）麗春紅染色轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)（此步可以省略）封閉為避免作為檢測(cè)試劑的特異性第一抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景提高，需對(duì)膜上的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理。5%脫脂奶粉或BSA（室溫孵育1h）WesternBlot膜封閉液（生物試劑公司）Tween-20的作用：減少非特異性吸附，不影響抗體與抗原的結(jié)合。封閉為避免作為檢測(cè)試劑的特異性第一抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，一抗、二抗孵育把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜?；厥找豢谷芤?，用TBST漂洗膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜?；厥找豢谷芤?，用TBST漂洗膜3次，每次10min。最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。一抗、二抗孵育把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過(guò)氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過(guò)氧化物酶法（HRP）膜解吸方法（膜的重復(fù)利用）

通過(guò)加熱和去污劑進(jìn)行解吸

原理：組合使用去污劑和加熱使抗體解離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。酸解吸

原理：使用低pH改變抗體結(jié)構(gòu)從而使結(jié)合位點(diǎn)失活，從而將抗體與抗原分離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。膜解吸方法（膜的重復(fù)利用）通過(guò)加熱和去污劑進(jìn)行解吸WesternBlot結(jié)果分析目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。WesternBlot結(jié)果分析軟件Gel-ProAnalyzer4綠色版（附動(dòng)畫(huà)演示教程）/thread-44929-1-1.html

WesternBlot結(jié)果分析目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入AP和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對(duì)齊SDS電泳膠不平？膠板洗刷干凈條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動(dòng)作輕緩拔梳子要迅