提取酒醅總RNA試驗(yàn)方案

酒酷總RNA提取試驗(yàn)方案各種提取方法所用到的研缽等器皿用錫箔紙包裹，180^烘箱高溫干熱滅活RNA酶12h,其他耗材120°C高溫高壓滅菌40min。一、改良CTAB法預(yù)處理：10g-20g酒酷置于含90ml無菌水三角瓶中，震蕩10—15min，取上層液體5-10ml于離心管，12000r/min離心5min，棄上清，重復(fù)此步驟以無菌去離子水洗滌一次，沉淀加入3-5ml5%中溫淀粉酶液混勻，40-50C保溫1小時，加1ml液化酶混勻，40-50C保溫1小時，12000r/min離心5min，棄上清，加無菌去離子水混勻，加3-5ml5%纖維素酶液混勻，40-50C保溫1小時，12000r/min離心5min，棄上清，加無菌去離子水混勻，重復(fù)此步驟以徹底去除干擾物質(zhì)⑶。測兩個指標(biāo)：①加入之后測淀粉、纖維素指標(biāo)變化：碘液法？分光光度計測透光率？②微生物數(shù)量變化，看預(yù)處理之后微生物死沒死：涂平板淀粉的測定：碘-淀粉比色法原理:淀粉可與碘生成藍(lán)色配合物，在一定濃度范圍內(nèi)，配合物顏色的深淺與樣品中淀粉的含量成正比，即吸光度值與淀粉含量之間的關(guān)系符合朗伯比爾定律，故可用分光光度法測定樣品中淀粉的含量。儀器及試劑:分光光度計，50mL燒杯，研缽，100mL無色容量瓶（2個），洗瓶，漏斗，濾紙，具塞刻度試管（15ml），恒溫水浴裝置，移液管（1ml,2ml），I2-KI溶液（碘化鉀8g；蒸餾水100ml；碘1g。先將碘化鉀溶于蒸餾水中，待全部溶解后再加碘，振蕩溶解。注：將此液保存在棕色玻璃瓶內(nèi)。），乙醚，80%乙醇測定方法：①標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作試劑的配制:（1）2g/L淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取0.2g可溶性淀粉于50ml干凈燒杯中，用蒸餾水打濕，攪勻，加入25ml沸騰的蒸餾水，攪拌均勻，在電爐上再保持沸騰,5min拿下，再加入蒸餾水25ml，攪拌冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至100ml無色容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻。（2）0.2%I2-KI標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取0.2g碘和0.5g碘化鉀，放入50ml燒杯中，加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml棕色容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻°0.02%I2-KI標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液10.00ml于100ml棕色容量瓶中用蒸餾水定容，搖勻。取100ml棕色容量瓶8個，按下表進(jìn)行，用水稀釋至刻度，搖勻，第一個容量瓶里的溶液為參比溶液，在最大吸收波長（610nm）處，測定各溶液的吸光度。容量瓶編號01234567標(biāo)準(zhǔn)淀粉溶液/mL02468101214I2-KI/mL88888888淀粉含量mg/mL00.040.080.120.160.20.240.28②測定：（稱離心管質(zhì)量m1，離心棄上清后質(zhì)量m2）向離心后的沉淀（記質(zhì)量m2-m1）加入8mlI2-KI溶液今直至溶液呈現(xiàn)透明藍(lán)色今蒸餾水補(bǔ)足到10ml，混勻，靜置10min9610nm波長測定吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品中淀粉的含量。③結(jié)果計算:淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)="炒10一3X100%m式中：c—從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的樣品淀粉含量，mg/ml；m—試樣的稱樣量，g；10—樣品體積10-3—將mg換算成g。纖維素含量的測定：分光光度法實(shí)驗(yàn)原理:纖維素（cellulose）為8—葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱能分解成［3一葡萄糖。3—葡萄糖在強(qiáng)酸作用下，可脫水生成3—糠醛類化合物。3一糠醛類化合物與蒽酮脫水縮合，生成黃色的糠醛衍生物。顏色的深淺可間接定量測定纖維素含量。儀器:試管、量筒、燒杯、移液管、容量瓶、布氏漏斗、天平、水浴鍋、電爐、分光光度計。溶液：60%H2SO4溶液；濃H2SO4（AR）；2%蒽酮試劑：將2g蒽酮溶解于100mL乙酸乙酯中，貯放于棕色試劑瓶中；纖維素標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取100mg純纖維素，放入100mL量瓶中，將量瓶放入冰浴中，然后加冷的60%H2SO460?70mL，在冷的條件下消化處理20?30min，然后用60%H2SO4稀釋至刻度，搖勻。吸取此液5.0mL放入另一50mL量瓶中，將量瓶放入冰浴中，加蒸餾水稀釋至刻度，則每mL含100pg纖維素。操作步驟：求纖維標(biāo)準(zhǔn)回歸方程⑴6支小試管，分別放入0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00mL纖維素標(biāo)準(zhǔn)液，然后分別加入2.00、1.60、1.20、0.80、0.40、0mL蒸餾水，搖勻，則每管依次含纖維素0、40、80、120、160、200pg。編號012345纖維素標(biāo)準(zhǔn)液/ml00.40.81.21.62.0蒸餾水/ml2.01.61.20.80.402%蒽酮/ml0.50.50.50.50.50.5濃H2SO4/ml（沿管壁）5.05.05.05.05.05.0纖維素含量0⑵向每管加0.5mL2%蒽酮，再沿管壁加5.0mL濃H2SO4，塞上塞子、搖勻，靜置1min。然后在620nm下，求測不同含量纖維素溶液的吸光度。⑶以測得的吸光度為Y值，對應(yīng)的纖維素含量為X值，求得Y隨X而變的回歸方程。樣品纖維素含量的測定（1）稱取風(fēng)干的棉花纖維0.2g于燒杯中，將燒杯置冷水浴中，加入60%H2SO460mL，并消化30min，然后將消化好的纖維素溶液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶，并用60%H2SO4定容至刻度，搖勻后用布氏漏斗過濾于另一燒杯中。（2）上述濾液5mL放入100mL容量瓶中，在冷水浴上加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻后用。（3）取2中的溶液2mL于具塞試管中，加入0.5mL2%蒽酮試劑，并沿管壁加5mL濃H2SO4，塞上塞子，搖勻，靜置12min，然后在620nm波長下，求測吸光度。計算:根據(jù)測得的吸光度按回歸方程求出纖維素的量，然后按下式計算樣品纖維素的含量：Y（%）=X*10-6*a*100*w式中：X一按回歸方程計算出的纖維素含量（ug）；10-6—將Ug換算成g的系數(shù)；a一樣品稀釋倍數(shù)W一樣品重量（g）；Y（%）-樣品中纖維素含量（%）RNA提取步驟：①+等菌體體積玻璃粉（目測即可）+1mlCTAB試劑（2%CTAB，2%PVP，1.4M氯化鈉，100mMTris，20MmEDTA，1%3-巰基乙醇或者10%3-巰基乙醇（v/v））（以上均在超凈工作臺內(nèi)操作）冰浴5min，漩渦震蕩器震蕩10min，室溫靜置5-10min（使核酸和蛋白質(zhì)完全分離）65°C水浴30min（每隔10min上下顛倒震蕩），室溫靜置5min12000g，4°。，離心10min（先打開大離心機(jī)降溫），收集上層水相于新離心管中，加入等體積酚-氯仿-異戊醇（通風(fēng)櫥操作），稍微漩渦震蕩（抽提RNA，同時除去蛋白），12000g，4。。，離心10min，收集上清水相（重復(fù)除蛋白三次）加入等體積異丙醇，混勻，室溫或者4°C沉淀30min或者-20°C沉淀至少1h12000g,4°。，離心15min,使用移液槍移去上清，加入1ml70%乙醇（DEPC水配制）洗滌沉淀兩遍，12000g，4°。，離心5min，移去上清，于超凈工作臺內(nèi)自然風(fēng)干10min加入30-50mlDEPC水溶解沉淀，并于-70C保存樣品。凝膠電泳：從-70C冰箱中取出樣品于-4C冰箱中解凍，稱取瓊脂糖0.35-0.4g，加入TAE緩沖溶液35-40ml，即（1%瓊脂糖凝膠），樣品RNA10ul+RNALoadingBuffer10ul或樣品RNA15ul+RNALoadingBuffer15ul,RNAMarker1ul+9ulDEPC水+RNALoadingBuffer10圖，l稍微震蕩混勻，稍微離心即可，于65C水浴10min，迅速冷卻，上樣，110v，15-20min（15min較佳）即可，于紫外線儀觀看膠圖。二、CTAB法提取RNA取0.5ml-8000g，5min收集酒醅菌體沉淀于2ml離心管+等菌體體積玻璃粉（目測即可）+1mlCTAB試劑（2%CTAB，2%PVP，1.4M氯化鈉，100mMTris，20MmEDTA，1%P-巰基乙醇或者10%p-巰基乙醇（v/v））（以上均在超凈工作臺內(nèi)操作）一冰浴5min，漩渦震蕩器震蕩10min，室溫靜置5-10min（使核酸和蛋白質(zhì)完全分離）一65C水浴30min（每隔10min上下顛倒震蕩），室溫靜置5min-12000g，4。。，離心10min（先打開大離心機(jī)降溫），收集上層水相于新離心管中，加入等體積酚-氯仿-異戊醇（通風(fēng)櫥操作），稍微漩渦震蕩（抽提RNA，同時除去蛋白）一12000g，4。。，離心10min，收集上清水相（重復(fù)除蛋白三次）一加入等體積異丙醇，混勻，室溫或者4C沉淀30min或者-20C沉淀至少1h-12000g，4°。，離心15min，使用移液槍移去上清，加入1ml70%乙醇（DEPC水配制）洗滌沉淀兩遍-12000g，4C，離心5min，移去上清，于超凈工作臺內(nèi)自然風(fēng)干10min，加入30-50mlDEPC水溶解沉淀，并于-70C保存樣品。三、改良Trizol法⑴預(yù)處理（PBS法）：稱取0.5g酒醅樣品于50mL離心管，離心管加入3mLPBS緩沖液和0.3g玻璃珠（直徑2mm），漩渦震蕩5min，200Xg離心5min，吸取上清液。重復(fù)操作兩次，合并三次上清液，4C，12000rpm離心5min，取沉淀。⑵（1）在沉淀迅速加1mLTrizol,振蕩混勻，室溫放置5min。⑵4C，12000rpm離心10min，取上清，轉(zhuǎn)入一個新的1.5mL離心管中。（3）加入0.2mL的氯仿，加蓋好后用振蕩器振蕩15s，室溫放置3min，然后4C，12000rmp離心15min，取上層溶液至新管中。（4）加入4C預(yù)冷，等體積的異丙醇，-20C冰箱中靜置30min，4C，12000rmp離心10min后去清液。（5）加入1mL75%乙醇（4C預(yù)冷）洗滌RNA沉淀，輕輕混勻，4C，7500rmp離心3min，倒去上清液。（6）加入1mL無水乙醇（4C預(yù)冷）輕輕混勻，4C，7500rmp離心3min，倒去上清液。⑺4C，7500rmp離心2min，用槍頭吸干余液，置于超凈工作臺上干燥5min，再加入50pLRNase-FreeddH2O，用槍頭反復(fù)吹打幾次溶解，置于-80C冰箱保存。四、改良超純RNA提取試劑盒預(yù)處理：取0.5ml-8000g，5min收集酒醅菌體沉淀于2ml離心管-1mlDEPC水洗滌9后續(xù)步驟依照產(chǎn)品說明書。參考文獻(xiàn)：[1]秦亞龍,王忠,徐敏,等.水茄果實(shí)總RNA提取方法的比較分析[J].分子植物育種,2016(4):864-869.李德林,許正宏,敖宗華，等.通過預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法:,CN102816757A[P].2012.朱會霞，程宗志,郭亞偉，等.通過預(yù)處理提高大曲高粱酒醅總DNA提取質(zhì)量的方法:,CN105002165A[P].2015.CarvalhaisLC,DennisPG,TysonGW,etal.Applicat