黃曲霉素的檢測(cè)方法課件

黃曲霉素的檢測(cè)方法王慧Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.黃曲霉素的檢測(cè)方法王慧Evaluationonly.1由于黃曲霉素在自然界的廣泛存在和對(duì)人、畜等生物的巨大危害性（主要為致癌性，WHO將其列為自然界最強(qiáng)的三大致癌物之一），國(guó)際上將其納入到嚴(yán)格控制的有害生物名單之中。農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉素含量是國(guó)際上食品衛(wèi)生和農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中的必檢指標(biāo)。在我國(guó)加入WTO后，黃曲霉素（Aflatoxin）也常常成為某些國(guó)家和組織限制我國(guó)農(nóng)副產(chǎn)品出口的綠色壁壘，我國(guó)已連續(xù)多次因?yàn)辄S曲霉素被檢出而遭受農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易損失?；谏鲜鲞@些原因，我們必須加強(qiáng)農(nóng)副產(chǎn)品及飼料產(chǎn)品中各型黃曲霉素檢測(cè)的工作。世界公認(rèn)的三大致癌物：黃曲霉菌、三四苯并芘、亞硝酸鹽Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.由于黃曲霉素在自然界的廣泛存在和對(duì)人、畜等生物的巨世2

黃曲霉毒主要存在于發(fā)霉的糧、油、花生中，它是黃曲霉及寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，毒性極強(qiáng)，可致肝癌，由于黃曲霉素是一種熱穩(wěn)定的化學(xué)物質(zhì)，所以在烹調(diào)過程中不易破壞。預(yù)防措施主要是防霉。但如果食品已霉變產(chǎn)毒，則應(yīng)采取適當(dāng)去毒措施：如花生米可用排除霉粒法；大米可用碾軋法及水搓法；植物油可用加堿去毒法等。目前已分離鑒定出18種，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，都是二氫呋喃香豆素的衍生物，主要是黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2以及由B1、B2在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物M1、M2等，B1為毒性及致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)。其毒性為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍,被列入嚴(yán)管的特劇毒物質(zhì)！

難溶于水易溶于油、甲醇、丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.難溶于水易溶于油、甲醇、丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑E3

中藥材的采收、加工、銷售、直到使用需要一段相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，如果儲(chǔ)存環(huán)境不合理，會(huì)造成藥材或飲片發(fā)霉變質(zhì)，特別是含油脂比較豐富的種子類藥材，更容易發(fā)生變質(zhì)，產(chǎn)生大量黃曲霉素。2010版《中國(guó)藥典》，修改增加了很多項(xiàng)目，尤其是增加了安全性控制指標(biāo)，其中首次增加黃曲霉素控制。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.Evaluationonly.4

在藥典一部中增加了僵蠶、酸棗仁、桃仁、胖大海、陳皮等五個(gè)品種的黃曲霉素檢查。2010版藥典規(guī)定每1000g含黃曲霉素B1不得過5μg，含黃曲霉素G2、黃曲霉素G1、黃曲霉素B2和黃曲霉素B1的總量不得過10μg。

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.Evaluationonly.5測(cè)定方法測(cè)定黃曲霉毒素B1的方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、免疫親和層析凈化高效液相色譜法、免疫親和層析凈化熒光光度法等Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.測(cè)定方法測(cè)定黃曲霉毒素B1的方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、免6薄層分析法(TLC)最經(jīng)典、最常用，至今仍為一些檢測(cè)機(jī)構(gòu)所用，也是一種國(guó)標(biāo)方法原理是用適宜的萃取溶劑將黃曲霉素從試樣中萃取出來，經(jīng)柱層析（它利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)吸附能力的差異，用溶劑將混合物的組分逐一洗脫分離的一種分離方法）凈化后，再在薄板上展開后分離，利用黃曲霉素的熒光特性,根據(jù)熒光斑點(diǎn)的強(qiáng)弱與標(biāo)準(zhǔn)比較確定其含量，對(duì)于一些組分很復(fù)雜的試樣要雙向展開，才能獲得較高的靈敏度TLC法設(shè)備簡(jiǎn)單，檢測(cè)費(fèi)用低，但操作繁瑣費(fèi)時(shí)，萃取和凈化效果不理想，靈敏度差，對(duì)操作人員的身體健康存在較大程度的危害Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.薄層分析法(TLC)Evaluationonly.7

原理是根據(jù)抗體和抗原之間特異性的免疫學(xué)反應(yīng)，最后用測(cè)定酶活力的方法來增加測(cè)定的靈敏度ELISA法將已知的待測(cè)AFB1抗原(或抗體)吸附于固定載體的免疫吸附劑上，洗滌未吸附的其他抗原和雜質(zhì),加入酶標(biāo)記的AFB1抗體(或抗原)與樣品中的待測(cè)物(抗原或抗體)發(fā)生特異免疫學(xué)反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的抗原一抗體復(fù)合物，洗滌后，加入酶底物，進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過顏色的深淺來測(cè)定AFB1抗原或抗體的含量。

酶聯(lián)免疫法(ELISA)Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.酶聯(lián)免疫法(ELISA)Evaluation8ELISA法具有特異性強(qiáng)、干擾小，樣品的預(yù)處理簡(jiǎn)便，且快速、靈敏、高效等特點(diǎn)，而且回收率高，提取方法簡(jiǎn)單，可以進(jìn)行定性和定量測(cè)定，并且對(duì)設(shè)備裝置的投資比HPLC降低了許多，大大節(jié)約了測(cè)試的成本，因而ELISA已廣泛用于食品中黃曲霉毒素的測(cè)定。

重復(fù)性差，假陽性概率較高,需要配置專門的酶標(biāo)儀,且對(duì)一些富含鹽和脂肪的試樣需進(jìn)行額外的處理.Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.ELISA法具有特異性強(qiáng)、干擾小，樣品的預(yù)處理簡(jiǎn)便9藥典檢測(cè)方法(HPLC)柱后衍生：又稱柱后反應(yīng)。利用衍生反應(yīng)使被測(cè)物與相應(yīng)的試劑分析反應(yīng)，以改變其物理或化學(xué)性質(zhì)，使其被檢測(cè)到。例如將發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán)鍵合到樣品中去，多極放大檢測(cè)靈敏度

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.藥典檢測(cè)方法(HPLC)柱后衍生：又稱柱后反應(yīng)。利用衍生反應(yīng)10Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.Evaluationonly.11Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.Evaluationonly.12免疫親和層析凈化高效液相色譜法

（IAC/HPLC)試樣經(jīng)過甲醇一水提取，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對(duì)黃曲霉毒素B1，B2,G1，G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水或吐溫-20/PBS將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，洗脫液通過帶熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀柱后碘溶液衍生測(cè)定黃曲霉毒素的含量。將免疫親和柱與高效液相色譜法結(jié)合應(yīng)用是目前采用較多的一種方法，這些新方法新手段的快速應(yīng)用，為黃曲霉毒素的檢測(cè)提供了更廣泛的選擇余地，適應(yīng)了不同的檢測(cè)目的和要求免疫親和柱：基于抗原抗體反應(yīng)，特異性抗體連接在柱體內(nèi)，選擇性吸附樣品中的待檢物，雜質(zhì)不被吸附，流出柱外，柱上結(jié)合的目標(biāo)物再被特定的洗脫液洗下來，可以用于液相色譜(HPLC)分析或者ELISA含量測(cè)定，是一種高效的前處理柱。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.免疫親和層析凈化高效液相色譜法

（IAC/HPLC)試13免疫親和層析凈化熒光光度法IAC/SFB

黃曲霉毒素速測(cè)儀—農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)檢中心中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所根據(jù)GB/T18979-2003研制成042NYART型黃曲霉毒素速測(cè)儀,本儀器采用的是免疫親和層析凈化熒光光度法

該方法的原理是利用各種黃曲霉素的熒光特性差異用熒光光度計(jì)測(cè)定試樣中黃曲霉素的含量。試樣經(jīng)過甲醇一水提取，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對(duì)黃曲霉毒素B1，B2,G1，G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水將免疫親和柱上雜質(zhì)除去.以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，加入溴溶液衍生，以提高測(cè)定靈敏度。洗脫液通過熒光光度計(jì)測(cè)定黃曲霉毒素總量。該方法對(duì)檢測(cè)人員身體健康無危害，檢測(cè)速度迅速，靈敏度高，適用于大量試樣檢測(cè)，且定量準(zhǔn)確，但檢測(cè)費(fèi)用較高，需要配置專用設(shè)備，且不能對(duì)單一的毒素進(jìn)行檢測(cè)使用免疫親和柱（IAC),操作簡(jiǎn)便，溶劑消耗少，特異性高，凈化效果好，國(guó)內(nèi)外得到了廣泛應(yīng)用。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.免疫親和層析凈化熒光光度法IAC/SFB黃14幾種黃曲霉素檢測(cè)方法的特點(diǎn)Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.幾種黃曲霉素檢測(cè)方法的特點(diǎn)Evaluationonly.15Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.Evaluationonly.16

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.Evaluationonly.17Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.Evaluationonly.18黃曲霉素的檢測(cè)方法王慧Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.黃曲霉素的檢測(cè)方法王慧Evaluationonly.19由于黃曲霉素在自然界的廣泛存在和對(duì)人、畜等生物的巨大危害性（主要為致癌性，WHO將其列為自然界最強(qiáng)的三大致癌物之一），國(guó)際上將其納入到嚴(yán)格控制的有害生物名單之中。農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉素含量是國(guó)際上食品衛(wèi)生和農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中的必檢指標(biāo)。在我國(guó)加入WTO后，黃曲霉素（Aflatoxin）也常常成為某些國(guó)家和組織限制我國(guó)農(nóng)副產(chǎn)品出口的綠色壁壘，我國(guó)已連續(xù)多次因?yàn)辄S曲霉素被檢出而遭受農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易損失?；谏鲜鲞@些原因，我們必須加強(qiáng)農(nóng)副產(chǎn)品及飼料產(chǎn)品中各型黃曲霉素檢測(cè)的工作。世界公認(rèn)的三大致癌物：黃曲霉菌、三四苯并芘、亞硝酸鹽Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.由于黃曲霉素在自然界的廣泛存在和對(duì)人、畜等生物的巨世20

黃曲霉毒主要存在于發(fā)霉的糧、油、花生中，它是黃曲霉及寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，毒性極強(qiáng)，可致肝癌，由于黃曲霉素是一種熱穩(wěn)定的化學(xué)物質(zhì)，所以在烹調(diào)過程中不易破壞。預(yù)防措施主要是防霉。但如果食品已霉變產(chǎn)毒，則應(yīng)采取適當(dāng)去毒措施：如花生米可用排除霉粒法；大米可用碾軋法及水搓法；植物油可用加堿去毒法等。目前已分離鑒定出18種，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，都是二氫呋喃香豆素的衍生物，主要是黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2以及由B1、B2在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物M1、M2等，B1為毒性及致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)。其毒性為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍,被列入嚴(yán)管的特劇毒物質(zhì)！

難溶于水易溶于油、甲醇、丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.難溶于水易溶于油、甲醇、丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑E21

中藥材的采收、加工、銷售、直到使用需要一段相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，如果儲(chǔ)存環(huán)境不合理，會(huì)造成藥材或飲片發(fā)霉變質(zhì)，特別是含油脂比較豐富的種子類藥材，更容易發(fā)生變質(zhì)，產(chǎn)生大量黃曲霉素。2010版《中國(guó)藥典》，修改增加了很多項(xiàng)目，尤其是增加了安全性控制指標(biāo)，其中首次增加黃曲霉素控制。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.Evaluationonly.22

在藥典一部中增加了僵蠶、酸棗仁、桃仁、胖大海、陳皮等五個(gè)品種的黃曲霉素檢查。2010版藥典規(guī)定每1000g含黃曲霉素B1不得過5μg，含黃曲霉素G2、黃曲霉素G1、黃曲霉素B2和黃曲霉素B1的總量不得過10μg。

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.Evaluationonly.23測(cè)定方法測(cè)定黃曲霉毒素B1的方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、免疫親和層析凈化高效液相色譜法、免疫親和層析凈化熒光光度法等Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.測(cè)定方法測(cè)定黃曲霉毒素B1的方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、免24薄層分析法(TLC)最經(jīng)典、最常用，至今仍為一些檢測(cè)機(jī)構(gòu)所用，也是一種國(guó)標(biāo)方法原理是用適宜的萃取溶劑將黃曲霉素從試樣中萃取出來，經(jīng)柱層析（它利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)吸附能力的差異，用溶劑將混合物的組分逐一洗脫分離的一種分離方法）凈化后，再在薄板上展開后分離，利用黃曲霉素的熒光特性,根據(jù)熒光斑點(diǎn)的強(qiáng)弱與標(biāo)準(zhǔn)比較確定其含量，對(duì)于一些組分很復(fù)雜的試樣要雙向展開，才能獲得較高的靈敏度TLC法設(shè)備簡(jiǎn)單，檢測(cè)費(fèi)用低，但操作繁瑣費(fèi)時(shí)，萃取和凈化效果不理想，靈敏度差，對(duì)操作人員的身體健康存在較大程度的危害Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.薄層分析法(TLC)Evaluationonly.25

原理是根據(jù)抗體和抗原之間特異性的免疫學(xué)反應(yīng)，最后用測(cè)定酶活力的方法來增加測(cè)定的靈敏度ELISA法將已知的待測(cè)AFB1抗原(或抗體)吸附于固定載體的免疫吸附劑上，洗滌未吸附的其他抗原和雜質(zhì),加入酶標(biāo)記的AFB1抗體(或抗原)與樣品中的待測(cè)物(抗原或抗體)發(fā)生特異免疫學(xué)反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的抗原一抗體復(fù)合物，洗滌后，加入酶底物，進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過顏色的深淺來測(cè)定AFB1抗原或抗體的含量。

酶聯(lián)免疫法(ELISA)Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.酶聯(lián)免疫法(ELISA)Evaluation26ELISA法具有特異性強(qiáng)、干擾小，樣品的預(yù)處理簡(jiǎn)便，且快速、靈敏、高效等特點(diǎn)，而且回收率高，提取方法簡(jiǎn)單，可以進(jìn)行定性和定量測(cè)定，并且對(duì)設(shè)備裝置的投資比HPLC降低了許多，大大節(jié)約了測(cè)試的成本，因而ELISA已廣泛用于食品中黃曲霉毒素的測(cè)定。

重復(fù)性差，假陽性概率較高,需要配置專門的酶標(biāo)儀,且對(duì)一些富含鹽和脂肪的試樣需進(jìn)行額外的處理.Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.ELISA法具有特異性強(qiáng)、干擾小，樣品的預(yù)處理簡(jiǎn)便27藥典檢測(cè)方法(HPLC)柱后衍生：又稱柱后反應(yīng)。利用衍生反應(yīng)使被測(cè)物與相應(yīng)的試劑分析反應(yīng)，以改變其物理或化學(xué)性質(zhì)，使其被檢測(cè)到。例如將發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán)鍵合到樣品中去，多極放大檢測(cè)靈敏度

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.藥典檢測(cè)方法(HPLC)柱后衍生：又稱柱后反應(yīng)。利用衍生反應(yīng)28Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.Evaluationonly.29Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.Evaluationonly.30免疫親和層析凈化高效液相色譜法

（IAC/HPLC)試樣經(jīng)過甲醇一水提取，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對(duì)黃曲霉毒素B1，B2,G1，G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水或吐溫-20/PBS將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，洗脫液通過帶熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀柱后碘溶液衍生測(cè)定黃曲霉毒素的含量。將免疫親和柱與高效液相色譜法結(jié)合應(yīng)用是目前采用較多的一種方法，這些新方法新手段的快速應(yīng)用，為黃曲霉毒素的檢測(cè)提供了更廣泛的選擇余地，適應(yīng)了不同的檢測(cè)目的和要求免疫親和柱：基于抗原抗體反應(yīng)，特異性抗體連接在柱體內(nèi)，選擇性吸附樣品中的待檢物，雜質(zhì)不被吸附，流出柱外，柱上結(jié)合的目標(biāo)物再被特定的洗脫液洗下來，可以用于液相色譜(HPLC)分析或者ELISA含量測(cè)定，是一種高效的前處理柱。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.免疫親和層析凈化高效液相色譜法

（IAC/HPLC)試31免疫親和層析凈化熒光光度法IAC/SFB

黃曲霉毒素速測(cè)儀—農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)檢中心中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所根據(jù)GB/T18979-2003研制成042NYART型黃曲霉毒素速測(cè)儀,本儀器采用的是免疫親和層析凈化熒光光度法

該方法的原理是利用各種黃曲霉素的熒光特性差異用熒光光度計(jì)測(cè)定試