淺談細胞體外培養(yǎng)的影響因素與防控策略

...wd......wd......wd...摘要動物細胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物科學中開展十分迅速的一種實驗技術(shù)。近年來，動物細胞培養(yǎng)技術(shù)已從單純的實驗操作擴展到生命科學、生物醫(yī)藥學等多個學科的研究和生產(chǎn)領(lǐng)域，成為廣泛采用的技術(shù)手段，許多生物技術(shù)科學研究都離不開細胞培養(yǎng)。本文從細胞培養(yǎng)的基本操作方法入手，介紹了動物細胞體外培養(yǎng)的主要影響因素，以及對細胞實驗室無菌環(huán)境的防控策略。關(guān)鍵詞：細胞體外培養(yǎng)；影響因素；無菌環(huán)境；防控策略目錄TOC\o"1-3"\h\u3543摘要I137741引言173702根基理論概述1166082.1細胞培養(yǎng)的概念1103502.2原代細胞培養(yǎng)的概念165352.3傳代細胞培養(yǎng)295713影響細胞體外培養(yǎng)的因素284553.1細胞別離方法2231353.1.1直接別離法3193913.1.2酶消化法3309343.2細胞培養(yǎng)溫度385983.3細胞培養(yǎng)基的成分3154173.3.1天然培養(yǎng)基3324733.3.2合成培養(yǎng)基3194093.4接種密度42753.5培養(yǎng)基的pH值4155463.6細胞的凍存與復(fù)蘇4101553.6.1細胞凍存4155123.6.2細胞復(fù)蘇5118394細胞實驗室無菌環(huán)境的防控策略5294244.1無菌室的徹底消毒559174.2培養(yǎng)用品的清洗和消毒滅菌6220934.2.1清洗6200414.2.2消毒滅菌6234544.3培養(yǎng)試劑的分裝與保存7209784.4對操作者的要求7228945結(jié)語829505參考文獻91505致謝10淺析細胞體外培養(yǎng)的影響因素及防控策略1引言細胞體外培養(yǎng)技術(shù)由于具有簡化細胞生長環(huán)境、明確生長條件、便于施加實驗因素、容易獲得活體直接觀測實驗結(jié)果，以及方便控制培養(yǎng)產(chǎn)物等優(yōu)點，在醫(yī)藥領(lǐng)域已成為研究發(fā)病機理和篩選藥物的重要手段，在分子生物學領(lǐng)域，利用細胞培養(yǎng)技術(shù)，結(jié)合細胞融合、細胞雜交以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)，進展基因重組、組織構(gòu)建，成為分子遺傳和組織工程研究者的重要研究工具，利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，已成為醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要局部。近年來，分子生物學和分子遺傳學獲得巨大進展，培養(yǎng)細胞技術(shù)被廣泛應(yīng)用于該領(lǐng)域的研究，這些培養(yǎng)的細胞已成為基因工程、遺傳工程、體細胞克隆、轉(zhuǎn)基因動物、生物制藥、干細胞、微生物學、細胞生物學、遺傳學、病毒學、免疫學等學科研究的有力工具和重要途徑。2根基理論概述2.1細胞培養(yǎng)的概念細胞培養(yǎng)是指將細胞從機體中取出，人工模擬機體內(nèi)生理條件，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，使其存在、生長、繁殖和傳代，進展細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等的研究工作，是維持細胞構(gòu)造和功能的體外培養(yǎng)方法。2.2原代細胞培養(yǎng)的概念原代培養(yǎng)是指取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)，這是細胞培養(yǎng)的最初和必經(jīng)階段。培養(yǎng)方法包括：單層細胞培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。單層細胞培養(yǎng)：將取下的組織塊無菌剪切后，用0.25%胰酶消化，使細胞別離，再用無菌Hanks液或0.85%NaCl溶液洗滌后，置培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)：懸浮培養(yǎng)的細胞多取材于血液或體腔液，一般采用離心法別離細胞，低速500-1000r/min，離心5-10min即可。培養(yǎng)時，只要取適當濃度的細胞懸液接種于完全培養(yǎng)液中，細胞就能增殖。2.3傳代細胞培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng)是指細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中，即當原代培養(yǎng)細胞生長到一定時期，受到群體環(huán)境限制，就需要轉(zhuǎn)移到另一容器才能繼續(xù)生長，稱為傳代或繼代培養(yǎng)。根據(jù)原代培養(yǎng)物性狀的一致性與否，傳代成功后稱為細胞系或細胞株。這些細胞一般可順利傳40-50代次，并保持染色體二倍體數(shù)量和接觸抑制，傳至50代左右時那么出現(xiàn)生長停滯，大局部衰老死亡，此類稱為有限細胞系／株。一般細胞原代培養(yǎng)1-4周后，需要進展別離培養(yǎng)，否那么細胞會因存在空間缺乏或由于細胞密度過大引起營養(yǎng)枯竭，影響細胞的生長繁殖。在細胞傳代的過程中，有些因發(fā)生遺傳突變獲得了持久性增殖能力的細胞稱為無限細胞系/株。傳代次數(shù)與物種壽命有關(guān)：小鼠壽命3年，傳代12次；龜壽命200年，傳代140次。人傳代次數(shù)與個體年齡成反比：人胚胎40-60代；幼年20-40代；成年10-30代；得了早老病的兒童2-10代。傳代培養(yǎng)的方式主要有：貼壁型細胞傳代和懸浮型細胞傳代。(1)貼壁型細胞傳代：傳代時需要用胰酶將細胞消化，使其從支持物上脫落，或用ＥＤＴＡ溶液與胰酶按體積比為1:1或1:2比例混合后聯(lián)合使用。過濾除菌后小量分裝，于-20℃保存。消化時吸去培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，參加適量的ＥＤＴＡ溶液與胰酶的混合液，以能覆蓋細胞層為宜，將培養(yǎng)瓶平放，37℃作用3-5min，參加Hanks液，1000r/min離心5min即可除去消化液，洗1-2次后參加完全培養(yǎng)液，計數(shù)，置培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。(2)懸浮型細胞傳代：傳代時用吸管將細胞吹打均勻，特別是一些成團生長的細胞，應(yīng)將細胞團塊打散。根據(jù)細胞生長狀況的不同，用吸管將細胞懸液吸去適當?shù)牧?，然后再參加完全培養(yǎng)液至原體積3影響細胞體外培養(yǎng)的因素3.1細胞別離方法細胞別離方法細胞培養(yǎng)之前，首先要進展組織塊的別離，其主要方法包括：直接別離法〔包括機械法和EDTA螯合法〕和酶消化法〔包括胰蛋白酶消化和膠原酶消化〕。3.1.1直接別離法該方法別離得到的細胞數(shù)量沒有酶消化法得到的多，但可滿足一般實驗的要求，該方法的優(yōu)點是操作流程簡單，不需要復(fù)雜的儀器和昂貴的膠原酶。3.1.2酶消化法多用于新生動物組織或動物胚胎的肝細胞培養(yǎng)。胰蛋白酶消化法具有別離效果好、操作簡單和價格廉價的特點，因為胰酶消化的條件很難掌握，所以未被廣泛應(yīng)用；膠原酶消化法具有別離效果好、細胞產(chǎn)量高〔即時存活率高、對細胞損傷小〕、維持細胞特異性功能的時間長等優(yōu)點。3.2細胞培養(yǎng)溫度不同種類的動物細胞對溫度的要求并不一致，如人和哺乳動物的細胞培養(yǎng)溫度為35-37℃，鳥類細胞培養(yǎng)溫度為38.5℃，鼠類細胞為34℃。一般來說，細胞對低溫的耐受力比高溫強。因此，在細胞的培養(yǎng)過程中要及時地根據(jù)細胞的類型調(diào)整適宜的溫度。在使用恒溫培養(yǎng)箱時，箱內(nèi)溫度應(yīng)維持在37℃、CO2體積分數(shù)為5%。3.3細胞培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基既是培養(yǎng)細胞中供給細胞營養(yǎng)和促使細胞生殖的根基物質(zhì)，也是培養(yǎng)細胞生長和繁殖的存在環(huán)境。培養(yǎng)基的種類很多，按其物質(zhì)狀態(tài)分為半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，按其來源分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。3.3.1天然培養(yǎng)基最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細胞生長因子、促貼附因子及多種活性物質(zhì)。與合成培養(yǎng)基合用，能使細胞順利增殖生長。質(zhì)量好的血清應(yīng)該是無溶血、橘黃色清亮透明、無細菌、無支原體污染的黏稠狀液體。血清的體積分數(shù)要控制在5%-20%，當超過30%時反而不利于細胞生長，過高或過低的血清體積分數(shù)都不利于細胞的生長和增殖。一般將血清保存于-20℃以下，時間不易過長。3.3.2合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量嚴格配制而成的。內(nèi)含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機鹽、維生素、微量元素和細胞生長因子等。單獨使用細胞雖有存在但不能很好地生長增殖。迄今為止，人工合成的培養(yǎng)基已有多種，如RPMI-1640、Eagle’sMEM、DMEM等，其主要差異在于氨基酸、維生素、無機鹽和能源物質(zhì)的組成及含量不同。一般認為RPMI-1640營養(yǎng)全面，對各種組織生長都適用；Eagle’sMEM適合于細胞株的傳代培養(yǎng)；DMEM有利于細胞的分裂增殖；Ham’sF12能促進細胞的分化。也有學者將不同培養(yǎng)基混合應(yīng)用，從而得到較好的培養(yǎng)效果。培養(yǎng)液中的抗生素是青霉素和鏈霉素。此外，卡那霉素、新霉素、兩性霉素、氯霉素等都可以防止細胞培養(yǎng)過程中細菌和真菌的感染。3.4接種密度一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細胞生長，細胞密度過大時，養(yǎng)分缺乏，使細胞迅速老化；而密度過小時，不利于細胞單層的形成。在傳代培養(yǎng)中，細胞的密度取決于傳代的時間。一般分瓶的稀釋比例為1:3至1:6，依細胞種類而異。在細胞生長的外部條件完全一樣的情況下，細胞分散比率不同會導致不同的增殖倍數(shù)，影響細胞產(chǎn)量，這對培養(yǎng)種細胞尤其重要。3.5培養(yǎng)基的pH值在培養(yǎng)動物細胞時，不同種動物或是同一種動物的不同部位對pH值的要求各不一樣。一般認為，動物細胞培養(yǎng)基的pH值一般在7.2-7.4，呈弱堿性。培養(yǎng)過程中pH值低于6.8時對細胞生長會有抑制作用，細胞生長緩慢；而當pH高于7.6時那么細胞不能生長，這可能是由于空氣的接觸而導致培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分被氧化所致。3.6細胞的凍存與復(fù)蘇細胞凍存和復(fù)蘇的基本原那么是“慢凍快融〞，實驗證明這樣可以最大限度地保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)都能提高細胞膜對水的通透性。緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復(fù)蘇細胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，防止由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。3.6.1細胞凍存?zhèn)鞔囵B(yǎng)的細胞，如果暫時不用，可以冷凍保存。利用凍存技術(shù)將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，在需要的時候再復(fù)蘇細胞后用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購置、寄贈、交換和運送某些細胞。細胞凍存時向培養(yǎng)基中參加保護劑至終體積分數(shù)5％。15％的甘油或二甲基亞砜〔DMSO〕，可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結(jié)條件下細胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而防止細胞損傷。標準冷凍速度開場為-1℃／min或者-2℃／min，當溫度低于-25℃時可加速，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)〔-196℃〕。3.6.2細胞復(fù)蘇復(fù)蘇細胞的原那么為快速解凍，從液氮中取出細胞凍存管之前應(yīng)準備好38℃的溫水，凍存管取出后用鑷子夾住頂端迅速放入溫水中，完畢后還要在75％酒精中清洗幾次，除去透明過程中染上的雜質(zhì)。為縮短透明時間，可將標本放在烘干箱或燈光下加熱，透明時間長短根據(jù)標本大小、多少和環(huán)境溫度而定。凍存復(fù)蘇后的狀態(tài)主要與凍存保護劑的種類、濃度以及細胞復(fù)蘇方法和復(fù)蘇后培養(yǎng)液中小牛血清濃度等有關(guān)。二甲基亞砜〔DMSO〕是一種具有非常強的溶解能力和非凡滲透能力的化學物質(zhì)，也是應(yīng)用最廣泛的體外培養(yǎng)細胞凍存保護劑，其常用體積分數(shù)為10％～20％，不同種屬細胞的最適濃度也存在一定差異。4細胞實驗室無菌環(huán)境的防控策略目前細胞培養(yǎng)過程中最主要的問題就是污染，污染可導致細胞死亡，從而造成人力、財力和時間的損失，有時還可能造成特殊材料的不可再用。因此，在做細胞實驗時，一定要盡力防止污染的發(fā)生。4.1無菌室的徹底消毒無菌室的構(gòu)造：一般由更衣間、緩沖間、操作間三局部組成。一般情況下，無菌室每周都要徹底清潔、消毒1次，用稀釋的新潔爾全面徹底地擦洗無菌室的臺面和地板，用屋頂裝置的紫外燈照射整個細胞培養(yǎng)室30-60min，以對環(huán)境進展消毒。實際工作中，要根據(jù)無菌室建筑材料的差異來選擇適宜的消毒方法。在超凈工作臺區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬闊，必要物品，如試管架、吸管盒等可暫時放置，其他實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流的通暢。超凈臺的平均風速保持在03.2-0.48m/s為宜，過大、過小均不利于保持凈化度。使用前最好開啟超凈臺內(nèi)紫外燈照射10-30min，然后讓超凈臺預(yù)工作10-15min，以除去臭氧和使工作臺面空間呈凈化狀態(tài)。使用完畢后，要用70％酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈，以保證超凈臺無菌。4.2培養(yǎng)用品的清洗和消毒滅菌細胞培養(yǎng)需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類、紙類等，從事細胞培養(yǎng)的工作人員必須要掌握這些物品的清洗和消毒滅菌的知識與方法。4.2.1清洗離體條件下，細胞對任何有害物質(zhì)十分敏感，極少殘留物都可以對細胞產(chǎn)生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必須認真清洗，到達不含任何殘留物的要求。(1)玻璃器皿的清洗：一般經(jīng)過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗４個步驟。(2)橡膠制品清洗：新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/LNaOH煮沸15min，流水沖洗；0.5mol/LHCl煮沸15min，流水沖洗；自來水煮沸2次；蒸餾水煮沸20min；50℃烤干備用。(3)塑料制品的清洗：塑料制品由于質(zhì)軟而易出現(xiàn)劃痕，耐腐蝕能力強但不耐熱。使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，然后用紗布〔或棉簽〕和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15min，流水沖洗〔15-20遍〕，蒸餾水浸洗3次，雙蒸水泡24h，晾干備用。(4)包裝：對細胞培養(yǎng)用品進展消毒前，要進展嚴密包裝，以便于消毒和貯存。常用的包裝材料有牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培養(yǎng)皿等，近幾年用鋁箔包裝非常方便、適用。培養(yǎng)皿、注射器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內(nèi)，較大的器皿可以進展局部包扎。4.2.2消毒滅菌微生物污染是造成細胞培養(yǎng)失敗的主要原因，對于已經(jīng)清洗的器皿要進展滅菌處理，常用的方法是高溫濕熱滅菌和高溫干熱消毒兩種方法。(1)高溫濕熱滅菌。此法是最常用的滅菌方法，對生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類、物、玻璃器皿、金屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。不同壓力蒸氣的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時間不同。從壓力蒸氣消毒器中取出消毒好的物品〔不包括液體〕，應(yīng)立即放到60-70℃烤箱內(nèi)烘干，再貯存?zhèn)溆?，否那么，潮濕的包裝物品外表容易為微生物污染。(2)高溫干熱滅菌。此法主要是將物品放入電熱烤箱內(nèi)加熱到160℃以上，并保持90-120min，殺死細菌和芽孢，到達滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿〔如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶〕、金屬器皿以及不能與蒸氣接觸的物品〔如粉劑、油劑〕。干熱滅菌后要關(guān)掉開關(guān)并使物品逐漸冷卻后再翻開，切忌立即翻開，以免溫度驟變而使箱內(nèi)的玻璃器皿破裂。電熱箱內(nèi)物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。4.3培養(yǎng)試劑的分裝與保存培養(yǎng)液和胰酶的配制用水是三蒸水或符合培養(yǎng)細胞標準的水。試劑的除菌方法采用過濾除菌法，最好使用一次性的濾器和濾膜，如果是反復(fù)使用的濾器那么應(yīng)在過濾前先將濾器和濾膜高壓滅菌，而后在無菌操作臺內(nèi)進展過濾分裝，接收濾液的容器也需事先高壓滅菌。配制好的培養(yǎng)液經(jīng)測試確認沒有污染方可用于培養(yǎng)細胞。配好的試劑于４℃保存。培養(yǎng)細胞所用的血清必須儲存于-20-70℃，但不能超過１個月，解凍時在-20℃或-70-4℃冰箱溶解1天，至室溫下全溶后再分裝，在溶解過程中要規(guī)那么搖晃均勻，使溫度與成分均一，這樣可以減少沉淀。最好不要直接在37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。4.4對操作者的要求有很多污染的發(fā)生都與實驗操作人員操作不當有關(guān)，細胞培養(yǎng)實驗的操作應(yīng)是嚴格的無菌操作。首先實驗進展前，無菌操作臺面、手術(shù)器械、廢液缸及實驗用品均應(yīng)用紫外燈照射30-60min滅菌；以70％酒精擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風扇運轉(zhuǎn)10min后，方可開場實驗操作。實驗操作人員進培養(yǎng)間之前，須先洗手，在緩沖間換穿專用實驗服和拖鞋，準備好與細胞培養(yǎng)操作實驗有關(guān)的所有試劑和用品，嚴禁在實驗進展時頻繁出入培養(yǎng)間。在無菌操作臺開場操作前須戴一次性乳膠手套，并用70％酒精擦拭、擦瓶口和燒灼瓶口。在實驗過程中，要求實驗人員標準操作，嚴格遵守無菌工作流程。操作者動作要輕，安裝吸管帽、翻開或封閉瓶口等操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過燒灼進展。操作時盡量不要談話、咳嗽，以防止來自唾沫和呼出的氣流所造成的污染。使用培養(yǎng)液前不宜過早開瓶，開瓶后的培養(yǎng)液應(yīng)保持斜位，防止直立，以防止下落細菌的污染。不再使用的培養(yǎng)液應(yīng)立即封閉瓶口，培養(yǎng)的細胞在處理之前勿過早暴露在空氣中。吸取培養(yǎng)液和細胞懸液時，應(yīng)專管專用，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去，以防止污染擴大或造成培養(yǎng)物之間的穿插污染。做完實驗后應(yīng)將實驗產(chǎn)生的廢物和廢液及時移出培養(yǎng)間，并用消毒水浸泡的紗布擦拭臺面，保證工作臺清潔無菌。5結(jié)語動物細胞培養(yǎng)作為現(xiàn)代多個學科領(lǐng)域