菌種選育理論和技術(shù)

關(guān)于菌種選育理論和技術(shù)第1頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六第一節(jié)微生物分離1.1菌種分離的一般過程土樣的采取→預(yù)處理→培養(yǎng)→菌落的選擇→產(chǎn)品的鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實(shí)現(xiàn)目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物問題：第2頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六1.2

采樣時(shí)要注意的問題

氣候、水分、空氣

來源要廣

結(jié)合產(chǎn)品的特點(diǎn)

標(biāo)簽：地點(diǎn)、時(shí)間、氣候等第3頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六

富集的三種方案：

定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的條件，進(jìn)行培養(yǎng)。1.3

目的微生物富集的一些基本方法

富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢(shì)，使篩選變得可能。

當(dāng)不可能采用定向培養(yǎng)時(shí)，則可設(shè)計(jì)在一個(gè)分類學(xué)中考慮。

不能提供任何有助于篩選產(chǎn)生菌的信息，這時(shí)只能通過隨機(jī)分離的辦法。第4頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時(shí)間4、培養(yǎng)溫度等一切能提高目的微生物相對(duì)生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢(shì)。定向培養(yǎng)的方法物理方法：加熱、膜過濾等但主要是通過培養(yǎng)的方法第5頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六1.4

菌落的選出

從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時(shí)以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計(jì)培養(yǎng)基利用簡(jiǎn)單、快速的鑒定方法，如抗生素

從形態(tài)的角度

菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個(gè)重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識(shí)別。第6頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六例：醛肟水解酶的篩選

--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培養(yǎng)基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2-3天移去一半培養(yǎng)物，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基不斷分析樣品，2-3個(gè)月后Z-PAOx降低后，稀釋分離單菌落第7頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六1.5

目的微生物富集方法的研究進(jìn)展

分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段，在微生物鑒別及特定目標(biāo)產(chǎn)物的篩選方面發(fā)揮了著越來越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA雜交技術(shù)等

目前土壤中能夠培養(yǎng)的微生物不到總數(shù)的1%。微生物的多樣性及資源的開發(fā)仍然是今后若干年的研究重點(diǎn)。

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.第8頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六第二節(jié)自然選育2.1定義

利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理，通過分離，篩選排除衰退型菌株，從中選擇維持原有水平的菌株，又稱自然分離。二、菌種退化的原因自發(fā)突變；異核體的存在；突變株不穩(wěn)定第9頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六生產(chǎn)菌種斜面制備單孢子懸浮液

分離出單菌落

斜面種子

高產(chǎn)菌株沙土管菌種斜面種子

搖瓶復(fù)篩

高產(chǎn)純化株

生產(chǎn)試驗(yàn)進(jìn)一步選育或保藏移種搖瓶初篩2.2自然選育流程圖第10頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六第11頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六第三節(jié)誘變育種3.1定義將生物體暴露于物理、化學(xué)或生物誘變劑作用下，促使生物體發(fā)生突變、提高變異幅度，從而選出優(yōu)良菌種的過程。

第12頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六穩(wěn)定性試驗(yàn)、菌種特性考察高產(chǎn)菌株斜面種子

搖瓶復(fù)篩

高產(chǎn)純化株

生產(chǎn)菌種斜面制備單孢子懸浮液

分離出單菌落

斜面種子

誘變處理統(tǒng)計(jì)存活率統(tǒng)計(jì)變異率3.2誘變育種流程圖放大、菌種保藏第13頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六3.3誘變劑

凡能提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱誘變劑。

3.3.1物理誘變劑紫外線、X射線、γ射線、快中子、離子束

UV：260nm，是堿基共軛體系的最高吸收峰引起胸腺嘧啶二聚體的形成和胞嘧啶水合作用生物學(xué)效應(yīng)：DNA鏈的斷裂；DNA分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)；核酸和蛋白的交聯(lián)。

第14頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六

實(shí)驗(yàn)室：15W，253.7nm，燈管與樣品的距離30cm，劑量由時(shí)間（30秒、60秒、90秒、120秒）或能量（格爾）決定。死亡率控制在70~90%。

誘變后注意要避光培養(yǎng)（因?yàn)楣鈴?fù)活現(xiàn)象）。

第15頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六3.3.2化學(xué)誘變劑

烷化劑：如亞硝基胍（NTG）、硫酸二乙酯（DES）、乙烯亞胺（EI）、氮芥作用機(jī)制：使核酸的氮原子上烷基，從而使配對(duì)錯(cuò)誤。堿基類似物：5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，2-氨基嘌呤COBr5-BU:酮式COHBr5-BU:烯醇式第16頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六第17頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六移碼誘變劑：丫啶橙、丫啶黃引起堿基喪失或增加抗癌藥物：絲裂霉素、爭(zhēng)光霉素抑制DNA復(fù)制3.3.3生物誘變劑噬菌體，轉(zhuǎn)座子第18頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六3.4菌種誘變的方法

誘變育種包括出發(fā)菌種選擇、誘變處理和篩選突變株三個(gè)部分。

3.4.1出發(fā)菌種選擇原則：選取純種作為出發(fā)菌株選擇具有優(yōu)良性狀的菌株對(duì)誘變劑敏感的菌株第19頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六

處理單孢子（或單細(xì)胞）懸液：芽孢桿菌應(yīng)處理芽孢放線菌，霉菌應(yīng)處理孢子細(xì)菌指數(shù)期，放線菌、霉菌要稍加萌發(fā)后使用出發(fā)菌株應(yīng)制成均勻懸液第20頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六誘變劑的使用：劑量以誘變劑濃度和處理時(shí)間來表示合適劑量：能擴(kuò)大變異幅度又能促使變異移向正變范圍的劑量

3.4.2誘變處理還可加誘變?cè)鰪?qiáng)劑:如LiCl第21頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)兩種或多種誘變劑先后使用同種誘變劑重復(fù)使用兩種或多種誘變劑同時(shí)使用第22頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六3.4.3突變株的選擇3.4.3.1隨機(jī)篩選搖瓶篩選法瓊脂塊篩選法篩選自動(dòng)化和篩選工具微型化第23頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六一個(gè)出發(fā)菌株誘變劑處理選出200個(gè)單孢子菌菌株初篩（每株1瓶）選出50株第一輪第二輪五個(gè)出發(fā)菌株初篩（每株1瓶）選出50株復(fù)篩（每株4瓶）誘變劑處理選出5株40株40株40株40株40株復(fù)篩（每株4瓶）選出5株高效搖瓶篩選方案第24頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六誘變春日霉素產(chǎn)生菌的孢子懸液·含供試菌種（拮抗對(duì)象）的瓊脂平板

瓊脂塊培養(yǎng)篩選法

春日霉素高產(chǎn)菌種第25頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六3.4.3.2理性化篩選初級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選①篩選營養(yǎng)缺陷型若分別篩選Ｄ、Ｅ高產(chǎn)菌株，根據(jù)下列代謝途徑，應(yīng)：ABCDEABCDEF篩選E缺陷型篩選F缺陷型第26頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六②篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株篩選油酸缺陷型或甘油缺陷型

③篩選結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株結(jié)構(gòu)類似物一方面與代謝物結(jié)構(gòu)相似，有相似的反饋調(diào)節(jié)作用；一方面不同于代謝物不具有正常的生理功能，使細(xì)胞死亡。添加此類物質(zhì)，大部分細(xì)胞缺少該種初級(jí)代謝物而死亡，生長下來的菌株對(duì)此結(jié)構(gòu)類似物不敏感，不受此反饋調(diào)節(jié)抑制。第27頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸的合成調(diào)節(jié)機(jī)制

HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶結(jié)構(gòu)類似物抗性：Lys的類似物AEC,Thr的類似物AHV營養(yǎng)缺陷型：如Thr缺陷型第28頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六黃色短桿菌F9-50的誘變譜系BervibacteriumflavumAs1.495(Ile-)lys.HCl2.1g/lF6-16(Ile-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l第29頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六④利用回復(fù)突變篩選抗反饋突變株先選對(duì)產(chǎn)物敏感的菌株，再誘變處理得到恢復(fù)突變株（改變酶的調(diào)節(jié)位點(diǎn)，不受產(chǎn)物的反饋抑制）。第30頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六

次級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選①篩選營養(yǎng)缺陷型②篩選負(fù)變株或零變株的回復(fù)突變株③篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株磷酸鹽對(duì)許多抗生素的生物合成有抑制作用第31頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六④篩選去除碳源分解代謝突變株能被菌快速利用的碳源在被代謝后，對(duì)其他代謝途徑的酶有抑制作用，例葡萄糖效應(yīng)。

葡萄糖效應(yīng)：培養(yǎng)基中同時(shí)含有葡萄糖和乳糖，微生物先利用葡萄糖、葡萄糖利用完后才利用乳糖，出現(xiàn)兩次菌體生長旺盛時(shí)期，若加入乳糖酶誘導(dǎo)物，也不產(chǎn)生乳糖酶，而是在葡萄糖利用完后才產(chǎn)生。方法：將菌在含有葡萄糖和以組氨酸為唯一氮源的培養(yǎng)基連續(xù)傳代。⑤篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株許多抗生素和氨基酸有共同的前體第32頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六⑥篩選二價(jià)金屬離子抗性突變株二價(jià)金屬離子可與產(chǎn)物或其中間體結(jié)合，抑制產(chǎn)物合成⑦篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株前體或前體結(jié)構(gòu)類似物對(duì)菌體的生長和抗生素的生物合成有抑制作用⑧篩選自身所產(chǎn)抗生素抗性突變株第33頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六第四節(jié)雜交育種4.1定義

將兩個(gè)基因型不同的菌株經(jīng)吻合或接合使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的菌株。

4.2舉例一株大腸桿菌A-B+Lac-SMrT1s

另一株大腸桿菌A+B-Lac+SMsT1r

混合培養(yǎng)后，長出少數(shù)菌落。第34頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六4.2.1細(xì)菌雜交

在細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)雜交的種類尚不多，主要是大腸桿菌，其他還有鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、淋病奈氏球菌等。大腸桿菌中存著致育因子F，有F因子為F+，沒有F因子稱F-。整合狀態(tài)為Hfr。

F因子有明顯的感染性，大腸桿菌的接合，實(shí)質(zhì)上是F因子的轉(zhuǎn)移，所以F+和Hfr稱供體菌，而F-稱受體菌。第35頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六

酵母雜交育種技術(shù)

酵母繁殖方式：酵母為單細(xì)胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情況下，繁殖體為雙倍體，但經(jīng)過特定條件的誘導(dǎo)，可使其產(chǎn)生單倍體孢子并可出芽產(chǎn)生單倍體繁殖體。

單倍體細(xì)胞具α及ε2兩種交配型。兩種交配型細(xì)胞經(jīng)其細(xì)胞壁上特定的凝聚因子誘導(dǎo)而進(jìn)行交配，恢復(fù)為雙倍體；同一交配型細(xì)胞之間，則因細(xì)胞壁上凝集因子的存在而不能進(jìn)行交配。在生活過程中，酵母細(xì)胞還可以形成三倍體、四倍體、多倍體或非整倍體細(xì)胞。第36頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六

一般而言，雜交育種運(yùn)用了酵母的單雙倍生活周期，將不同基因型和相對(duì)的交配型的單倍體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)雜交而形成二倍體細(xì)胞，經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀。

第37頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六第五節(jié)原生質(zhì)體技術(shù)

菌體經(jīng)溶菌酶處理后，去掉了細(xì)胞壁，露出球形且特別脆弱的原生質(zhì)體。它對(duì)滲透壓、振蕩、離心等十分敏感。但由于原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)與生理活性均未發(fā)生改變，故在適宜的條件下，可以再生出細(xì)胞壁進(jìn)行細(xì)胞分裂。第38頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六原生質(zhì)體制備和再生的過程

培養(yǎng)菌絲(細(xì)胞)

洗滌菌絲溶菌酶處理菌絲形成原生質(zhì)體、離心

用高滲溶液洗滌原生質(zhì)體過濾顯微計(jì)數(shù)原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體再生融合子的選擇第39頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六第六節(jié)分子育種6.1提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量基因工程技術(shù)提高抗生素產(chǎn)量的主要手段1.增加限速酶的基因拷貝數(shù)2.增加正調(diào)節(jié)基因,去除負(fù)調(diào)節(jié)基因3.增加抗性基因的拷貝數(shù)第40頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六6.1.1增加限速酶的基因拷貝數(shù)原理：EaEbEcEd

ABCDE(代謝產(chǎn)物）

限速酶

Rate-limitingenzyme(Bottleneck)例1:起始原料EaEbEc

-aminoadipicacidACV三肽異青霉素N青霉素L-cysteine

L-valineEa:ACV合成酶（限速酶）Eb:異青霉素N合成酶Ec:異青霉素N?；饷?/p>

第41頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六例2.頭孢菌素C生物合成的限速酶

在頭孢菌素C的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，人們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵結(jié)束后在得到的發(fā)酵液中，除了主要產(chǎn)物是頭孢菌素C外，在發(fā)酵液中還積累另一種產(chǎn)物-青霉素N。問題：積累中間產(chǎn)物-青霉素N

原因：下一步反應(yīng)為限速酶反應(yīng)解決：導(dǎo)入額外的擴(kuò)環(huán)酶/羥化酶基因結(jié)果：使頭孢菌素C的產(chǎn)量提高25-50%，積累的青霉素N消失。

第42頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六例3：

十一烷基靈菌紅素產(chǎn)生菌:天藍(lán)色鏈霉菌S.colicolorA3(2)acetylCoApolyketidepathway

氧甲基轉(zhuǎn)移酶S-腺苷甲硫氨酸構(gòu)建重組質(zhì)粒(帶甲氧基轉(zhuǎn)移酶)轉(zhuǎn)化到氧甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷變株

轉(zhuǎn)化菌株十一烷基靈菌紅素產(chǎn)量提高5倍第43頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六6.1.2增加正調(diào)節(jié)基因,去除負(fù)調(diào)節(jié)基因

調(diào)節(jié)基因根據(jù)其作用的不同分為正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)。正調(diào)節(jié)促進(jìn)生物合成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，負(fù)調(diào)節(jié)阻扼結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。

第44頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六

次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇內(nèi)的正負(fù)調(diào)節(jié)基因

基因

效應(yīng)

菌株

次級(jí)代謝產(chǎn)物

功

能

brpA

正

吸水鏈霉菌Bialaphos激活bar(Bialaphos抗性)基因和

6個(gè)bap

(生物合成)基因的轉(zhuǎn)錄

tylG

正

弗氏鏈霉菌

泰洛星

激活tylF(

編碼MOMT)

和其它tyl

生物合成基因的表達(dá)

actII

正

天藍(lán)色鏈霉菌

放線紫紅素

能使act菌株放線紫紅素的產(chǎn)

量增加30～

40倍

mmy

負(fù)

天藍(lán)色鏈霉菌

次甲霉素

該基因的插入失活導(dǎo)致次甲霉

素過量生產(chǎn)

strR

正

灰色鏈霉菌

鏈霉素

調(diào)節(jié)鏈霉素的生物合成

.

第45頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六去除負(fù)調(diào)節(jié)基因使結(jié)構(gòu)基因超量表達(dá)Methylenomycin（次甲霉素）次甲霉素是由天藍(lán)色鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素，研究結(jié)果表明，次甲霉素是由天藍(lán)色鏈霉菌攜帶的質(zhì)粒SCPI編碼的。在其生物合成結(jié)構(gòu)基因的上游，存在一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)基因-mmy。

克隆到質(zhì)粒上轉(zhuǎn)化變青鏈霉菌轉(zhuǎn)化子（次甲霉素高產(chǎn)表達(dá)）mmy第46頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六6.1.3增加抗性基因的拷貝數(shù)

抗性基因的作用是避免抗生素產(chǎn)生菌被自身產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物所殺滅。其作用可通過三條途徑實(shí)現(xiàn)：抗性基因產(chǎn)物(酶)將抗生素作用的底物加以修飾;將抗生素的分子結(jié)構(gòu)加以修飾,使其失活;將抗生素分子排出細(xì)胞外。

第47頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六例1.DaviesJ.利用鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702從卡那霉素產(chǎn)生菌克隆了6’-N-氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC6’的基因(aacA),該基因產(chǎn)物在乙酰輔酶A的存在下,可將氨基糖苷類抗生素的氨基糖6’乙?；acA基因轉(zhuǎn)入新霉素和卡那霉素的產(chǎn)生菌中,結(jié)果顯著提高了抗生素的產(chǎn)量.

轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化子-鏈霉菌細(xì)胞氨基糖苷類抗生素產(chǎn)量提高第48頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六卡那霉素6’-乙酰轉(zhuǎn)移酶[AAC（6’）]

的作用第49頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六例2.

螺旋霉素抗性基因srmB

重組質(zhì)粒

轉(zhuǎn)化S.ambofaciens（生二素鏈霉菌）轉(zhuǎn)化子使螺旋霉素產(chǎn)量提高。

第50頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六6.2改進(jìn)代謝產(chǎn)物的組分

鏈霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物常常是一組結(jié)構(gòu)相似的混合物。每個(gè)化合物稱為它的一個(gè)組分。多組分產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)是因?yàn)榇渭?jí)代謝產(chǎn)物的合成酶對(duì)底物的選擇性不強(qiáng)以及合成途徑中分支途徑的存在。通過基因工程手段，滅活某分支途徑的酶，就可以去除該分支途徑的產(chǎn)物。此策略常用來去除發(fā)酵產(chǎn)物中的無用組分，提高有用組分的含量。第51頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六

只產(chǎn)Avermectin“2”組分基因工程菌的構(gòu)建

aveC脫水酶阿維菌素“2”組分阿維菌素“1”組分第52頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六aveC基因在染色體上的位置第53頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六重組質(zhì)粒的構(gòu)建

第54頁，共60頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分