基因工程育種(碩士課程)課件

《發(fā)酵工程》碩士研究生課程基因工程育種GeneticEngineeringBreeding

郭麗瓊二0一0年九月二十四日目標(biāo)微生物自然選擇人工誘變代謝調(diào)控育種基因工程育種雜交育種基因工程育種：通過基因工程的手段把外源基因?qū)胨拗骶?xì)胞，有目的地改造宿主菌的遺傳性狀的一種育種手段。主要包括以下環(huán)節(jié)：（1）克隆目的基因；（2）獲得高效表達(dá)元件（如強(qiáng)啟動子等）；（3）構(gòu)建高效表達(dá)載體（包括轉(zhuǎn)化子篩選標(biāo)記）；（4）建立高效轉(zhuǎn)化體系；（5）目的基因的轉(zhuǎn)化和預(yù)期工程菌株的獲得；（6）轉(zhuǎn)基因生物的安全性評價?；蚬こ淘谖⑸镉N的作用（一）藥物的生產(chǎn)：1.治療用藥物：人干擾素，人胰島素，人白細(xì)胞介素，人生長素，動物生長素，松弛素，抑長素，紅細(xì)胞生成素，腫瘤壞死因子，表皮生長因子，集落刺激因子，血小板生長因子，凝血因子，超氧化物岐化酶，尿激酶，葡激酶等。2.疫苗：甲肝疫苗，乙肝疫苗，丙肝疫苗，瘧疾疫苗，傷寒及霍亂疫苗，出血熱疫苗等。3.單克隆抗體及診斷試劑：前列腺磷酸酶，T-細(xì)胞及其亞群，狂犬病毒，風(fēng)疹病毒，沙眼衣原體，T4,IgE,HCG-?,抗肝癌、胃癌、肺癌、白血病等單克隆抗體及診斷試劑。深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司的工作人員在基因制品生產(chǎn)線上進(jìn)行操作。這是亞洲惟一的GMP標(biāo)準(zhǔn)的基因治療產(chǎn)品生產(chǎn)線。

重組人p53腺病毒注射液又叫“今又生”是腫瘤基因治療藥物，由正常人腫瘤抑制基因p53和改構(gòu)的5型腺病毒基因重組而成。前者是今又生發(fā)揮腫瘤治療作用的主體結(jié)構(gòu)，后者主要起載體作用，攜帶治療基因p53進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。

（三）改進(jìn)傳統(tǒng)發(fā)酵工藝好氧微生物在發(fā)酵過程中需要耗掉大量的氧氣，若氧氣不足產(chǎn)量下降。在生產(chǎn)菌株中轉(zhuǎn)化進(jìn)血紅蛋白基因，可提高生產(chǎn)菌對氧氣的耐受能力。舉例：谷氨酸棒桿菌C.glutamicum

發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸和谷氨酰胺；透明顫菌血紅蛋白基因(Vitreoscillahemoglobingene,vgb）增強(qiáng)細(xì)胞攝入氧的能力；結(jié)果表明：在溶氧只有5％的條件下,重組菌比野生菌細(xì)胞干重提高了1.2倍,單位細(xì)胞谷氨酸的生產(chǎn)能力提高了6.5倍,單位細(xì)胞谷氨酰胺的生產(chǎn)能力提高了1.4倍。（北京理工大學(xué)）（五）環(huán)境處理：

構(gòu)建超級菌株

降解質(zhì)粒：（1）石油降解質(zhì)粒；（2）農(nóng)藥降解質(zhì)粒；（3）工業(yè)污染降解質(zhì)粒，如降解氯聯(lián)苯、尼龍低聚體、洗滌劑等；（4）抗金屬離子質(zhì)粒，如汞、砷、鎳、鈷、鎘、銅等根據(jù)特異mRNA分離目的基因（1）差別雜交（differentialhybridization）,

又稱：差別篩選（differentialscreening）（2）縮減雜交（subtractivehybridization），

又稱：縮減cDNA克?。╯ubtractivecDNA

cloning）（3）mRNA差別顯示（mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction,DDRT-PCR）（4）抑制性消減雜交（suppressivesubtractivehybridization，SSH）（5）代表性差異分析（representationaldifferenceanalysis，RDA）（6）cDNA擴(kuò)增片段長度多態(tài)（cDNA-amplifiedfragmentlengthpolymorphisms，cDNA-AFLP）實驗原理：材料準(zhǔn)備舉例：（1）草菇冷誘導(dǎo)基因表達(dá)差異片斷（2）耐藥性微生物的基因表達(dá)差異（3）不同培養(yǎng)基下漆酶基因表達(dá)差異技術(shù)路線一號樣（最優(yōu)）RNA提取二號樣（碳源）三號樣（Cu2+）cDNA雙鏈合成及純化TaqI酶切TaqI接頭連接漆酶酶活測定酶活變化最大時差異片斷的分離、回收、純化

選擇性擴(kuò)增PCR預(yù)擴(kuò)增PCR

片斷連接轉(zhuǎn)化、測序差異顯示

測序結(jié)果的BLAST比對和序列分析PCR條件優(yōu)化接頭的設(shè)計原則：（1）選擇限制性酶：如EcoRI（5’-GAATTC-3’)（2）PCR引物設(shè)計原則引物的設(shè)計（1）預(yù)擴(kuò)增引物設(shè)計（2）選擇性擴(kuò)增引物設(shè)計預(yù)擴(kuò)增結(jié)果選擇性擴(kuò)增的優(yōu)化結(jié)果片斷的分析利用同源序列分離目的基因（同源克隆法）目的基因相關(guān)同源序列PCR擴(kuò)增保守序列篩選基因文庫目的基因全長三.基因工程載體(一）質(zhì)粒載體的組成

克隆質(zhì)粒載體：含抗性基因、自主復(fù)制序列（ori）常用克隆質(zhì)粒載體（1）pUC系列（含ampr、

lacZ、Mutiplecloningsite）（2）pBR322(含ampr、tetr、Mutiplecloningsite)（3）BluescriptM13系列（含ampr、lacZ、Mutiple

cloningsite）（4）λ噬菌體載體表達(dá)質(zhì)粒載體:組成：啟動子，終止子，目的基因，抗性篩選標(biāo)記基因。限制性內(nèi)切酶及其酶切位點種類：I類、II類、III類。I類和III類限制性內(nèi)切酶兼有修飾（甲基化）作用以及依賴于ATP的切割活性。主要存在于生物DNA損傷修復(fù)以及抵制入侵DNA?；虿僮鞒Ｓ玫南拗菩詢?nèi)切酶是II類。II類限制性內(nèi)切酶特點：（1）識別4-6bp的特異核苷酸序列；（2）產(chǎn)生特異的末端：粘性末端、平端如:EcoRI5’-G

AATTC-3’3’-CTTAA

G-5’PstI5’-CTGCA

G-3’3’-G

ACGTC-5’HaeIII5’-GG

CC-3’3’-CC

GG-5’表達(dá)載體構(gòu)建啟動子選擇（1）原核生物常用啟動子：σ70啟動子（2）植物常用啟動子：35S啟動子（3）食用菌常用啟動子：食用菌常用啟動子：1）ras（Le.ras.gene）啟動子；2）gpd(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase)啟動子；3）spr1(serineproteinasegene)啟動子；4）trp1（tryptophansynthetasegene）啟動子；5）其他：cel1(cellulose-growth-specificgene)啟動子、cel3啟動子、cel4啟動子、pri(primasegene)啟動子、gla1(glu-coamylasegene)啟動子等。篩選標(biāo)記

（1）營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記：營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)標(biāo)記基因有:A)ural（二氫乳清酸）基因，楊樹菇轉(zhuǎn)化;B)pabl(p-氨基苯甲酸)基因，鬼傘、蘑菇遺傳轉(zhuǎn)化；C）trp2(色氨酸)基因，鬼傘、蘑菇遺傳轉(zhuǎn)化;D）銀耳肌醇營養(yǎng)缺陷型菌株。（2）抗生素抗性篩選標(biāo)記：抗生素抗性篩選標(biāo)記已在植物、真菌遺傳轉(zhuǎn)化子的篩選上廣泛使用。主要有：卡那霉素抗性基因（kan+）;氨芐青霉素抗性基因（Amp+)潮霉素抗性基因（Hyg+）;腐草霉素抗性基因（Phl+）;博來霉素抗性基因（Ble+）。在培養(yǎng)基中添加抗生素進(jìn)行篩選。（3）除草劑和殺菌劑抗性篩選標(biāo)記：A)如Bialaphos抗性基因;B)殺菌劑Carboxin抗性基因（CbxR）;（4）代謝產(chǎn)物抗性篩選標(biāo)記

如從鬼傘中分離得到的trp3iar基因。該基因是抗氟基吲哚（5-fluoroindole,5-FL）代謝的，草菇和平菇對潮霉素不敏感，而對5-FL十分敏感，當(dāng)把trp3iar轉(zhuǎn)入草菇和平菇時，這兩種食用菌就能對5-FL產(chǎn)生抗性，達(dá)到篩選的目的。載體構(gòu)建策略（１）選擇合適的表達(dá)載體:含啟動子、篩選標(biāo)記、終止子（２）選擇合適的限制性內(nèi)切酶及其酶切位點舉例說明食用菌啟動子功能檢測載體構(gòu)建過程四．遺傳轉(zhuǎn)化方法原核生物遺傳轉(zhuǎn)化熱激法電擊法真菌遺傳轉(zhuǎn)化(一）PEG法PEG(polyethyleneglycol)法最早是由Davey等以矮牽牛懸浮細(xì)胞的原生質(zhì)體為受體、Krens等以煙草無菌苗分離的原生質(zhì)體為受體，在PEG的協(xié)助下開創(chuàng)性地把裸露的DNA直接轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體而創(chuàng)立的，他們的研究結(jié)果為基因直接轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。主要原理：PEG能使細(xì)胞膜之間或DNA與膜之間形成分子橋，促使細(xì)胞間的接觸和粘連，或是通過引起表面電荷的紊亂，干擾細(xì)胞間的識別，而有利于細(xì)胞間的融合或外源DNA的進(jìn)入。主要應(yīng)用：酵母、蘑菇、平菇、草菇、鬼傘等（二）電激法電激法是利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上“電激穿孔”（Electroporation）形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA的攝取。該法自1979年Zimmerann發(fā)明以來，經(jīng)過多年的研究和改進(jìn)，已廣泛應(yīng)用于動物、植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究上。1991年，RoyerJC等首先采用電激法把編碼二氫乳清酸脫氫酶基因URA1導(dǎo)入同源的楊樹菇營養(yǎng)缺陷型突變菌株中，獲得正常表達(dá)的楊樹菇，接著蘑菇、平菇、草菇等也用該法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化子。

（三）基因槍法基因槍法又稱微彈轟擊法（Microprojectilebombardment）,自KleinTM等1987年首次利用鎢粒對洋蔥的組織進(jìn)行轟擊試驗以來，已被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化。主要原理：將外源DNA包被在微小的金?；蜴u粒表面，然后在高氣壓下微粒被高速射入受體細(xì)胞或組織。微粒上的外源DNA也隨之被帶入細(xì)胞并整合到植物染色體上，得到表達(dá)，從而實現(xiàn)了基因的轉(zhuǎn)化。應(yīng)用：絲狀真菌、蘑菇、草菇。（四）限制性酶介導(dǎo)的DNA整合法

這是九十年代發(fā)展起來的一種能較大幅度提高轉(zhuǎn)化率的方法，其英文為RestrictionEnzyme-MediatedDNAIntegration，簡稱REMI。它是由SchiestlRH等于1991年第一次在釀酒酵母菌（S.cerevisiae）上創(chuàng)立使用[29]，1992年KuspaA等在網(wǎng)柄菌（Dictyosteliumdiscoideum）上發(fā)展了該法。此法應(yīng)用于旋孢菌（Cochliobolusheterosporus）、白色念球菌（Candidaalbicans）和食用菌上的鬼傘（Coprinuscinereus）、香菇（L.edodes）等的遺傳轉(zhuǎn)化均能有效地提高轉(zhuǎn)化率。

主要原理：限制酶穿透細(xì)胞膜和核膜，在特異的酶切位點活體切斷染色體DNA，產(chǎn)生的染色體DNA末端就會在宿主細(xì)胞酶系的作用下與限制酶切斷的線性化的質(zhì)粒DNA相連接。該法亦可作為REMI標(biāo)簽對功能基因進(jìn)行分離。

（五）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）是一種革蘭氏陰性的土壤桿菌，它侵染雙子葉植物的受傷部位并形成冠癭瘤，在冠癭瘤的形成中，農(nóng)桿菌只留在植物細(xì)胞間隙中，其環(huán)狀質(zhì)粒Ti上的T-DNA在細(xì)菌內(nèi)被加工、剪切、復(fù)制后轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞并隨機(jī)插入到植物的基因組中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是一種天然有效的遺傳工程系統(tǒng)，已廣泛應(yīng)用于雙子葉植物和單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究上。應(yīng)用：1998年deGrootMJA等首先把農(nóng)桿菌介導(dǎo)法應(yīng)用于真菌的遺傳轉(zhuǎn)化，他以真菌的分生孢子和菌絲為受體成功地把T-DNA轉(zhuǎn)入曲霉（A.awamori）、木霉（Trichodermaharzianum）、鏈孢霉（Neurosporacrassa）、雙孢蘑菇（A.bisporus）、草菇中。五.基因定位誘變定位誘變方法刪除法：在目的基因中刪除一個或若干個堿基序列，使基因發(fā)生重排而造成其性狀的改變。如啤酒酵母的蛋白酶A基因。插入法：在目的基因中插入單個或多個核苷酸序列，使原基因發(fā)生改變進(jìn)而改變基因產(chǎn)物。取代法：將目的DNA的某個堿基進(jìn)行置換，使置換處編碼的氨基酸發(fā)生改變。特定的G:C變A:T

錯配取代將變異基因送回染色體

1）體內(nèi)自發(fā)的同源重組；2）定位整合作用六.基因工程育種實例耐寒凍轉(zhuǎn)基因草菇的培育草菇的特點：1.草菇是典型的高溫型食用菌，不耐低溫,菌絲在4℃低溫下2d即自溶而死亡；2.子實體在4℃低溫下24h后即液化、腐爛；3.采收后的子實體容易開傘，營養(yǎng)價值下降，口感差，商業(yè)價值低

4.草菇生物轉(zhuǎn)化率低：20-30%5.常規(guī)的雜交育種培育抗寒的草菇菌株十分困難抗冷凍蛋白基因mRNART-PCRafpgenepGafpmfc基因的克隆實驗方案表達(dá)載體pvg-afp表達(dá)載體pgVvs-mfcPEG介導(dǎo)共轉(zhuǎn)化草菇菌絲原生質(zhì)體

PCR與Southern雜交鑒定含有mfc基因的轉(zhuǎn)基因草菇轉(zhuǎn)基因草菇后代遺傳穩(wěn)定性分析

擬轉(zhuǎn)化子的篩選草菇對0℃低溫致死時間的確定多功能纖維素酶酶活測定

表達(dá)載體（pgVvs-mfc）的構(gòu)建

目的條帶圖2PCR鑒定圖3酶切鑒定ACCCGCCAAAAAGCACAGAGGGCATGCGCTTGACTGAAGCGTCGACGAATCACTAGTGATTTATGCTGGTTATCTGAGCGGGCCCGTATCCTATCGGCGTTAGAGTGCAGTCGGAGAGCCGCATGTATCACGGAAAGGACTCGAACAGGGAGTTTTATCTATTTTTATTGGTCGATATCAGTCAGATTGTCAGTGCGTCAAAGTTGCATCCATAAGGCTACTACGGTGAAACCGGTGTATCCTGGGATATCATGAAATGGCTGTATGCAGAAGATAAGAATGAGAGTAGTTCTAGAACAACAAACCCAGGCCAGGGAGGAAGCTGTAGCATTTGCAAGACTTTGCAGGGCCTTTCAAAGGCACTTCCATCCAAAGCTCGAGCACGGTTCCAGGCAACCTTAGTCATGGGGCGATAGAACTGAAGAACGTTTGCTGATTGGCAGTCCATCCCAAAGGACTCGGCCAATAAATCCTACCCAATCGCAGGTCCGAGGTACTAAAGTGTTTTAAGGTCTAGACTTTTAGGGCTATTGTCGAAGTCACAACATCACGCAATCAAGATTTGACTGAAGCGCGATTATCTATAAAAGGATCAGTTGTGTTTTTCGTCCGCATCTTTTCCTTGTTCCACAACCTTCGATTCTAAATACACTCCAATCCATTGACTGCTTGAATAATCGAATTCCCGCGGTGGAGCTCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGA圖4表達(dá)載體pgVvs-mfc測序結(jié)果圖表達(dá)載體pvg-afp草菇原生質(zhì)體的制備與再生圖5草菇V23原生質(zhì)體含D-甘露醇的PDA培養(yǎng)基上再生

草菇原生質(zhì)體再生菌絲0℃低溫致死時間的確定

致死時間

24h48h72h84h96h108h120h132h144h恢復(fù)生長情況RGRGRDRDRDRDDDD表1草菇菌絲0℃致死時間的測定

注：RG為33℃培養(yǎng)能恢復(fù)生長；D為33℃培養(yǎng)不能恢復(fù)生長0℃低溫篩選獲得草菇擬轉(zhuǎn)化子

圖6擬轉(zhuǎn)化子0℃低溫處理后恢復(fù)生長情況草菇擬轉(zhuǎn)化子的PCR檢測

圖7草菇擬轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖未全附）

陽性質(zhì)粒V23-CK水對照草菇擬轉(zhuǎn)化子的Southern雜交鑒定基因組DNA的提取

圖8草菇轉(zhuǎn)化子基因組DNA凝膠電泳結(jié)果

基因組DNA的酶切

圖9草菇轉(zhuǎn)化子基因組DNA的酶切結(jié)果

Southern雜交分析

圖10轉(zhuǎn)化子基因組DNA的Southern雜交結(jié)果M為DNAMarkerλ-HindⅢ；ck-為轉(zhuǎn)化的草菇；ck+為質(zhì)粒pgVvs-mfc；（a）1-7分別為TVM23-8、TVM23-1、TVM23-10、TVM23-11、TVM23-12、TVM23-13、TVM23-14；（b）1-7分別為TVM23-2、TVM23-3、TVM23-4、TVM23-5、TVM2