生理學(xué)實(shí)驗(yàn)-斑馬魚視動反應(yīng)講義

斑馬魚視動眼動反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模河^察視覺行為學(xué)的表現(xiàn)掌握評判視覺功能的行為學(xué)手段實(shí)驗(yàn)原理：行為學(xué)雖是一門古老的學(xué)科，但至今仍是神經(jīng)生理研究中不可或缺(indispensable)的一個活躍領(lǐng)域。經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)一般不依賴或很少需要精密的測量儀器，而是靠我們?nèi)ビ^察和思考。眼動(optokineticresponse,OKR)和視動(optomotorresponse,OMR)反應(yīng)均是視覺刺激誘發(fā)的運(yùn)動行為。脊椎動物從低等的魚、蛙到高等的靈長類和人都有此行為反應(yīng)。此現(xiàn)象無需學(xué)習(xí)訓(xùn)練就易誘導(dǎo)、較穩(wěn)定、易觀察，所以作為一種客觀指標(biāo)廣泛運(yùn)用于視覺功能的檢測和評價。脊椎動物為了獲得對運(yùn)動圖像刺激在視網(wǎng)膜上穩(wěn)定清晰的成像，通過視覺通路和相應(yīng)的運(yùn)動神經(jīng)參與做出生理性行為的適應(yīng)調(diào)整從而能夠?qū)σ曈X刺激做出良好反應(yīng)，這些表現(xiàn)涉及視動、眼動或視動性頭震顫(Optokineticheadnystagmus,OKHN)。如果行為學(xué)的表現(xiàn)不正常，可以推測它們的固有神經(jīng)連接出現(xiàn)異常。斑馬魚具有脊椎動物類似的視覺通路，經(jīng)典的視覺行為學(xué)有眼動反應(yīng)和視動反應(yīng)。眼動(光動)反應(yīng)：斑馬魚在光適應(yīng)一段時間后會對移動的光柵進(jìn)行注視，試圖確保移動視覺圖像能穩(wěn)定地高分辨地呈現(xiàn)在視網(wǎng)膜上。如果光柵是在一個圍繞幼魚的圓筒上移動時(圖1)，斑馬魚的眼睛就會一直追隨光柵直到其眼睛不能再轉(zhuǎn)動，然后有一個急速的眼顫動(ocularnystagmus)以回復(fù)到最初水平。之后又進(jìn)行下一個追隨反應(yīng)，如此循環(huán)。周圍視覺環(huán)境周期性運(yùn)動時引起的有規(guī)律的眼或頭追蹤運(yùn)動(慢相運(yùn)動)即為眼動反應(yīng)或視動性頭震顫。五天齡(5dpf)的幼魚視覺系統(tǒng)就已非常成熟(viewedinBilotta,2001),適合行為學(xué)檢測。該行為學(xué)指標(biāo)常用于篩選與視功能相關(guān)的不同遺傳背景或操作的幼魚。視動反應(yīng)：視動反應(yīng)是指斑馬魚對移動的目標(biāo)有一種追逐的行為。當(dāng)將成年斑馬魚放在一個圓形光柵的內(nèi)部時，斑馬魚對光柵的追隨行為會表現(xiàn)為一種圓周性運(yùn)動(圖2)。轉(zhuǎn)速顯示照明開關(guān)電機(jī)開關(guān)正反轉(zhuǎn)開關(guān)轉(zhuǎn)速旋鈕通風(fēng)開關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)備：試劑：30mmPetridish，6%methylcellulose（Sigma），Embryomedia，Rearingwater（見附表），海綿，橡皮泥，動脈夾，大頭針，7-9dpf幼魚，成魚，計(jì)時器，燒杯儀器：OKRapparatus（圖3）,體式鏡，視頻攝錄設(shè)備，微波爐，攪拌加熱臺實(shí)驗(yàn)步驟Part1:成魚OKR?1.自制海綿塊(如圖4);?2.將海棉塊放在玻璃杯的底部，倒入少部分的水，擠出海綿中的氣泡;?3.插入第一根針，位置大概在海綿的中間;?4.麻醉成魚，用動脈夾夾住尾巴;?5.將魚背部朝上放在海綿上，一側(cè)的胸鰭放在大頭針的前面;?6.插入第二根針，位置在對側(cè)胸鰭的后面，類似于第一根針;?7.在魚缸的壁上靠近魚尾的位置蘸上一塊橡皮泥，將動脈夾按在橡皮泥? 上;?8.在生殖孔的兩側(cè)分別插入第3、4根大頭針;?9.在第1、2與第3、4之間分別插入第5、6根大頭針;?10.腮部兩側(cè)分別插上第7、8根大頭針;?11.為了防止魚體上浮，第9、10根針在背鰭前部附近斜插跨過魚的身體;?12.倒入養(yǎng)魚水，水深6cm左右;?13.讓斑馬魚蘇醒10min;?14.打開光源，光強(qiáng)度適應(yīng)1min;?15.打開電動機(jī)，光柵刺激適應(yīng)1min;?16.記錄眼動反應(yīng)。注意事項(xiàng):大頭針的目的只是為了固定住斑馬魚，因此只要能達(dá)到這個目的，大頭針沒有必要太緊以影響到魚的正常呼吸和生理功能;用以小片紗布裹住魚的尾巴，然后再用動脈夾夾住可以減少尾巴斷裂的可能性;腮部旁邊的兩個大頭針不能阻擋它對光柵的視野。Part2:幼魚OKRA.甲基纖維素幼魚的固定是用甲基纖維素來進(jìn)行的，一般常用的是6%的，配制如下1.將140mlddH2O放進(jìn)微波爐中高檔加熱3min;在玻璃燒杯中加入60ml的ddH2O，并放入冰箱中冰凍；將沸騰的熱水轉(zhuǎn)移到熱臺上并攪拌;稱取12gmethylcellulose,緩慢的倒進(jìn)沸水當(dāng)中，當(dāng)甲基纖維素在表面逐漸成塊的時候可以用玻璃棒在水面輕微攪動以促進(jìn)其溶解；繼續(xù)攪拌3min直到methylcellulose充分分散開來,加入3~5滴NaOH(1mol/L)并繼續(xù)攪拌3~5min;將上述容易轉(zhuǎn)移進(jìn)一個塑料的燒杯中，然后加入60ml的冰塊迅速冷卻;當(dāng)溶液因快速冷卻而變得透明的時候?qū)⑵浞胚M(jìn)冰箱，靜置2h后可用。為了防止劇烈的冷卻對玻璃燒杯的損傷，可以將熱的溶液轉(zhuǎn)移進(jìn)塑料燒杯中進(jìn)行;當(dāng)冰塊加入之后溶液變得透明，還應(yīng)繼續(xù)在冰箱中保持2h以上，否則不會形成粘稠樣液體。B.幼魚準(zhǔn)備前一天下午五點(diǎn)將一雌二雄配對在繁殖缸中，第二天早上抽板并在1h后收集魚卵;魚卵用embryomedium在28.5°C孵育，光照/黑暗周期為14:10h;魚卵按正常飼養(yǎng)方法進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)選取的是5dpf的幼魚。C.實(shí)驗(yàn)步驟在55-mmpetridish中加入20ml6%的methycellulose,防止有氣泡產(chǎn)生；放進(jìn)幾條幼魚在培養(yǎng)皿中，將它們擺成一排;將裝置放在體式鏡下面并打開光源;在魚的尾巴部位添加一個小氣泡，這個小氣泡有助于反射周圍的光柵運(yùn)動;轉(zhuǎn)動光柵并記錄他們的眼動反應(yīng)。Part3:成魚OMR成魚的OMR也可以在此裝置中進(jìn)行，不同的是在fishchamber中心放置一個圓柱以阻止斑馬魚在運(yùn)動過程中從中心穿過。撈一條成魚在fishchamber中并加入6cm高的養(yǎng)魚水；將一個直徑2cm的圓柱立在fishchamber的中央；光強(qiáng)度與光刺激適應(yīng)各1min;打開攝像機(jī)并記錄相關(guān)的行為。思考題：1、 如果斑馬魚幼魚不用甲基纖維素而用養(yǎng)魚水會怎樣?那為何用甲基纖維素較理想?2、 在OKR中，除了眼睛的運(yùn)動還會有什么部位會有運(yùn)動，為什么？3、 猜想視神經(jīng)損傷后對于眼動或是視動反應(yīng)具有什么影響？注意事項(xiàng)：妥善保管數(shù)碼相機(jī),以防摔落;當(dāng)心玻璃器皿,尤其是儀器上匹配的玻璃裝置;切記防止水潑入儀器;操作體視鏡獲取視頻時動作輕柔;實(shí)驗(yàn)后,歸還斑馬魚于指定容器.參考文獻(xiàn)：鄒蘇琪，殷梧，胡兵．斑馬魚行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用．生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展2009，36(1):5~12附表:1LEmbryomedium:10.0mlHank'sStock#11.0mlHank'sStock#210.0mlHank'sStock#4959.0mlddH2O10.0mlHank'sStock#510.0mlfreshHank'sStock#6Useabout10drops1MNaOHtoPh7.2Stock#18.0gNaCl 0.4gKCl,in100mlddH2OStock#20.358gNa2HPO4Anhydrous0.60gKH2PO4,in100mlddH2OStock#40.72gCaCl2,in50mlH2OStock#51.23gMgSO4-7H2O,in50mlddH2OStock#6(fresh)0.35gNaHCO3,in10mlddH2ORearingwaterIngeneral,adultscanbemaintainedintapwater，Ifthereisanyquestionaboutwaterquality，usedeionizedordistilledwaterwith