定量分析樣品前處理與測定方課件

第四章藥物定量分析與分析方法的驗證【目的要求】1.掌握藥典中常見的一些含鹵素與含金屬的有機藥物的前處理方法與其性質(zhì)的關(guān)系；掌握氧瓶燃燒法的預(yù)處理方法、原理、方法以及在藥物分析中的應(yīng)用；2.掌握分析方法效能指標(biāo)的內(nèi)容，分析方法效能指標(biāo)的確證過程以及不同分析方法對效能指標(biāo)的要求；3.了解定量分析方法的特點?！窘虒W(xué)內(nèi)容】1.

定量分析樣品的前處理方法：不經(jīng)有機破壞的分析方法；經(jīng)有機破壞的分析方法。2.

定量分析方法的特點：準確度、精密度、專屬性、檢測限、定量限、線性與范圍、重現(xiàn)性以及耐用性。3.

藥品質(zhì)量標(biāo)準分析方法驗證。第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法一、概述

1、為什么要對定量分析的樣品進行前處理？含鹵素有機藥物R-X（F，Cl,Br,I）金屬有機藥物R-O-Me（有機酸或酚的金屬鹽；結(jié)合不牢固）

金屬有機藥物有機金屬藥物R-Me（結(jié)合牢固）

2、常用的處理方法不經(jīng)有機破壞的分析方法藥物分析中常用的分析方法經(jīng)有機破壞的分析方法（2）烯丙型鹵和芐鹵活潑（3）鹵代烷型介于兩者之間2.分子中所含鹵原子的個數(shù)分子中所含鹵原子的個數(shù)越多，活潑性越強，特別是同一碳上含多個鹵原子或一個苯環(huán)上含多個鹵原子時，活潑性增強更加明顯3.鹵素的種類I＞Br＞Cl＞F常見的含鹵素有機藥物防腐劑防腐劑廣譜驅(qū)蟲藥諾氟沙星

殺菌劑

醋酸氟輕松

抗炎藥碘他拉酸X線診斷用陽性造影劑

碘番酸X線造影劑

含金屬有機藥物的分析

含金屬的有機藥物：金屬原子不與碳原子直接相連，通常為有機酸及酚的金屬鹽或配位化合物。如酒石酸銻鉀、葡萄糖酸銻鈉、富馬酸亞鐵。

有機金屬藥物：金屬原子直接與碳原子以共價鍵相連，結(jié)合比較牢固。如卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利。（三）經(jīng)氧化還原后測定法1.堿性還原后測定例如：泛影酸的含量測定2.酸性還原后測定例如：碘番酸的含量測定Zn還原后銀量法

三、經(jīng)有機破壞的分析方法

濕法破壞

藥物分析中常用的有機破壞的方法有干法破壞HNO3-HClO4法氧瓶燃燒法(一)濕法破壞HNO3-H2SO4法H2SO4-硫酸鹽法HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2；H2SO4-KMnO4

(二)干法破壞加Na2CO3或MgO以助灰化；溫度控制在420℃氟水氯水-NaOH溶液溴水-NaOH溶液-二氧化硫飽和溶液碘水-NaOH溶液-二氧化硫飽和溶液硫濃過氧化氫溶液與水的混合液磷水-硝酸溶液硒硝酸溶液(1→30)測定氟化物用石英燃燒瓶

一、容量分析法

（一）容量分析法的特點

1、操作簡單、快速；2、比較準確（RSD＜0.2%）；3、儀器普通易得。4、含量較高試樣(原料藥含量測定)（二）容量分析法的計算問題

1.滴定度（T）的概念指每1ml規(guī)定濃度的滴定液所相當(dāng)?shù)谋粶y藥物的質(zhì)量(mg)2.滴定度的計算

aA+bB—cC+dD

T=M×b/a×B

3.百分含量的計算

（1）直接滴定法D%=V×F×T/W×100%

F=實際標(biāo)定的濃度/規(guī)定的濃度

（2）間接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）D%=（VO–VB)×F×T/W×100%例

非那西丁含量測定：精密稱取本品0.3630g加稀鹽酸回流1小時后，放冷，用亞硝酸鈉液（0.1010mol/L）滴定，用去20.00m1。每1ml亞硝酸鈉液（0.1mol/L）相當(dāng)于17.92mg的C10H13O2N。計算非那西丁的含量為（E）A.95.55%B.96.55%C.97.55%D.98.55%E.99.72%例：維生素C注射液（規(guī)格2ml：0.1g）的含量測定：精密量取本品2ml，加水15ml與丙酮2ml，搖勻，放置5分鐘，加稀醋酸4ml與淀粉指示液1ml，用碘滴定液（0.1003mol/L）滴定，至溶液顯蘭色并持續(xù)30秒鐘不褪，消耗10.56ml。每1ml碘滴定液（0.1mol/L）相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6。計算維生素C注射液的標(biāo)示量%。例：取司可巴比妥鈉膠囊（標(biāo)示量為0.1g）20粒，除去膠囊后測得內(nèi)容物總重為3.0780g，稱取0.1536g，按藥典規(guī)定用溴量法測定。加入溴滴定液（0.05mol/L）25ml，剩余的溴滴定液用硫代硫酸鈉滴定液（0.1025mol/L）滴定到終點時，用去17.94ml?？瞻自囼炗萌チ虼蛩徕c滴定液25.00ml。按每1ml溴滴定液（0.05mol/L）相當(dāng)13.01mg的司可巴比妥鈉，計算該膠囊中按標(biāo)示量表示的百分含量。

二、光譜分析法

（一）紫外-可見分光光度法（200nm～760nm)靈敏度高，可達10-4g/ml～10-7g/ml1.特點準確度高，SRD（%）為2%～5%儀器價格低廉，操作簡單，易普及應(yīng)用范圍廣。

2.朗伯-比耳定律

A=ECL

當(dāng)溶液濃度為1%(g/ml)，溶液厚度為1㎝時的吸收度C:每100ml溶液中所含被測物質(zhì)的重量(按干燥品或無水物計算，g)4.對溶劑的要求:

220～240nm241～250nm251～300nm300nm以上

溶劑+吸收池A

＜0.41＜0.20＜0.10＜0.05

5.測定方法

要求供試品溶液的A應(yīng)在0.3～0.7對照品比較法：Cx=(Ax/Ar)Cr;含量%=Cx×D/W×100%常用方法吸收系數(shù)法：含量%=(E1%1cm

)x/(E1%1cm

)r×100%計算分光光度法：VA的三點校正法例：用異煙肼比色法測定復(fù)方己酸孕酮注射液的含量。當(dāng)己酸孕酮對照品的濃度為50g/ml，按中國藥典規(guī)定顯色后在380nm波長處測得吸收度為0.160。取標(biāo)示量為250mg/ml(己酸孕酮)的供試品2ml配成100ml溶液，再稀釋100倍后，按對照品顯色法同樣顯色，測得吸收度為0.154。求供試品中己酸孕酮的含量為標(biāo)示量的多少？

例．對乙酰氨基酚的含量測定方法為：取本品約40mg，精密稱定，置250ml量瓶中，加0.4%氫氧化鈉溶液50ml溶解后，加水至刻度，搖勻，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加0.4%氫氧化鈉溶液10m1，加水至刻度，搖勻，照分光光度法，在257nm的波長處測定吸收度，按C8H9NO2的吸收系數(shù)()為715計算，即得。若樣品稱樣量為m(g)，測得的吸收度為A，則含量百分率的計算式為：例．中國藥典（1990年版）規(guī)定維生素B12注射液規(guī)格為0.1mg／m1，含量測定如下：精密量取本品7.5m1，置25ml量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，混勻，置lcm石英池中，以蒸餾水為空白，在361±1nm波長處吸收度為0.593，按為207計算維生素B12按標(biāo)示量計算的百分含量為（C）A.90％B.92.5％C.95.5％D.97.5％E.99.5％

（二）熒光分光光度法靈敏度高，可達10-10g/ml～10-12g/ml在低濃度進行測定，防止F與C不成正比及自熄滅作用1.特點用基準物溶液校正儀器靈敏度，防止樣品液熒光衰減靈敏度高，但干擾因素多。制備熒光衍生物，可提高其靈敏度和選擇性。用樣品量少，操作簡單，方法快速，應(yīng)用范圍較廣。

三、色譜分析法

按分離原理分為：吸附；分配；離子交換；排阻色譜方法分類按分離方法分為：PC；TLC；柱色譜；GC，HPLC。

（一）HPLC法

1.對HPLC儀器一般要求色譜柱、流動相按品種項下要求。色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)22.系統(tǒng)性試驗分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5拖尾因子：T=W0.05h/2d1應(yīng)在0.9～1.05

內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量3.測定方法標(biāo)準曲線法外標(biāo)法測定供試品中主成分含量外標(biāo)一點法應(yīng)用示例：

RP-HPLC法測定鹽酸黃酮哌酯片含量，用標(biāo)準曲線法如頭孢拉??；頭孢羥氨芐；頭孢唑啉鈉用外標(biāo)一點法

（二）GC法

1.對GC儀器一般要求載氣為氮氣；色譜柱為填充或毛細管柱色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)22.系統(tǒng)性試驗分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5拖尾因子：T=W0.05h/2d1應(yīng)在0.9～1.05內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量

3.測定方法標(biāo)準曲線法外標(biāo)法測定供試品中主成分含量外標(biāo)一點法應(yīng)用示例：

Ch.P(2000)收載的月桂卓酮、維生素E及其片劑、注射劑、甲酚皂溶液等均采用GC法中的內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定含量。

一、準確度是指用該方法測定結(jié)果與真實值接近的程度，用回收率表示（一）含量測定方法的準確度

1.原料藥可用已知純度對照品或樣品進行測定；或與已建準確度的另一方法測定的結(jié)果進行比較。

2.制劑要考察輔料對回收率的影響。采用在空白輔料中加入原料對照品的方法作回收率試驗，然后計算RSD。

具體做法：測定高、中、低三個濃度，n=3,共9個數(shù)據(jù)來評價回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC發(fā)時，一般回收率可達98%～102%；容量法可達99.7%～100.3%

第三節(jié)藥品分析方法驗證（二）數(shù)據(jù)要求

回收率%=（測定平均值—空白值）/加入量×100%

要求制備高、中、低三濃度的樣品，各測定3次。應(yīng)報告已知加入量的回收率，或測定結(jié)果平均值與真實值之差及其可信限。

二、精密度是指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻樣品，經(jīng)多次測定結(jié)果之間的接近程度。（一）精密度表示方法1.偏差(deviation,d)

d=測得值-平均值=Xi-X

2.標(biāo)準偏差（standarddeviation,SD或S）

S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/2

3.相對標(biāo)準差(relativestandarddeviation,RSD)也稱變異系數(shù)(coefficientofvariation,CV)RSD=標(biāo)準偏差/平均值×100%=S/X×100%（二）重復(fù)性、中間精密度及重現(xiàn)性

1.重復(fù)性在相同條件下,由一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度.2.中間精密度在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果的精密度。3.重現(xiàn)性在不同實驗室由不同分析人員測定結(jié)果的精密度。（三）數(shù)據(jù)要求應(yīng)報告S或SD、RSD和可信限。用統(tǒng)計學(xué)的可信性分析(t或f）。三、專屬性

是指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準確測定出被測物的特性。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性。（一）鑒別反應(yīng)應(yīng)能與其它共存的物質(zhì)或相似化合物區(qū)分，不含被測組分的樣品均應(yīng)呈現(xiàn)負反應(yīng)。（二）含量測定和雜質(zhì)測定

色譜法和其他分離法，應(yīng)附代表性的圖譜，以說明專屬性。圖中應(yīng)注明各組分的位置，色譜法中分離度應(yīng)符合要求。在能獲得雜質(zhì)的情況下，可加到試樣中，考察對結(jié)果的干擾。在雜質(zhì)和降解物不能獲得的情況下，可用以驗證方法和藥典方法進行對照；也可用對試樣加速破壞的方法，比較兩種方法。

四、檢測限（limitofdetection,LOD)是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量，是限度檢驗指標(biāo)。它無需測定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。（一）常用的方法1.非儀器分析目視法用已知濃度被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。

2.儀器分析方法

UV法：LOD=f.3S空=C樣/A樣×3S空Flu法：LOD=f.3S空=C樣/(F樣-F空)×3S空

GC和HPLC法：

LOD=S/N=2或3

（二）數(shù)據(jù)要求

應(yīng)附測試圖，說明測試過程和檢測限結(jié)果。

五、定量限（limitofquantitation,LOQ)是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具一定準確度和精密度。雜質(zhì)和降解產(chǎn)物進行定量測定時，要求LOQ.常用信噪比法確定定量限，一般以S/N=10時相應(yīng)的濃度進行測定。六、線性

是指在設(shè)定的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。

UV法：首先制備一個標(biāo)準系列，濃度點n=5;A=0.3～.0.7建立回歸方程C=aA+b;r＞0.9999。

HPLC法：制備一個標(biāo)準系列，濃度點n=5～7;以C對h或A或與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比，建立回歸方程r＞0.9999。

七、范圍

是指達到一定精密度、準確度和線性、測試方法適用的高低限度或量的區(qū)間。

原料藥和制劑含量測定：范圍應(yīng)為測試濃度的80%-～120%。

制劑含量均勻度檢查：范圍應(yīng)為測試濃度的70%-～130%。

溶出度或釋放度中的溶出量測定：范圍應(yīng)為限度的±20%。八、耐用性是指在測定條件下有效的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度。典型的變動因素有：被溶液的穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時間等。

HPLC法變動因素有：流動相組成與pH，色