版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子鑒定的基本原理和操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理感受態(tài)細(xì)胞(CompetentCells):受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,能允許外源DNA分子進(jìn)入。轉(zhuǎn)化(Transformation):將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。目前常用的轉(zhuǎn)化方法為電轉(zhuǎn)化法和化學(xué)轉(zhuǎn)化法,電轉(zhuǎn)化法簡(jiǎn)便易行,轉(zhuǎn)化效率高,但需要專門(mén)的電轉(zhuǎn)化儀;化學(xué)轉(zhuǎn)化不需要額外的設(shè)備,成本較低。致敏過(guò)程:用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作;細(xì)菌處于00C,CaCl2低滲溶液中,菌細(xì)胞膨脹成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸鹽混合物黏附于細(xì)胞表面,經(jīng)短時(shí)間420C熱激處理,促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物;復(fù)蘇:細(xì)菌在非選擇性培養(yǎng)基上保溫一段時(shí)間,使抗性的表型表達(dá)后再轉(zhuǎn)到含抗性的選擇性培養(yǎng)基上,長(zhǎng)出來(lái)的菌落即為轉(zhuǎn)入了外源基因的菌落;影響轉(zhuǎn)化效率的因素細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)(5x107個(gè)/mL)感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量試劑的質(zhì)量外源DNA的質(zhì)量與數(shù)量器皿的潔凈度污染—盡量所有打開(kāi)器皿蓋的操作都在超凈臺(tái)中進(jìn)行三、器材與試劑1.材料大腸桿菌菌株Top10、重組質(zhì)粒。2.設(shè)備恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、臺(tái)式高速離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、低溫冰箱、恒溫水浴鍋、分光光度計(jì)、微量移液槍、1.5mL離心管。3.試劑LB液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素母液(Ampicillin,Amp)、含Amp的LB固體培養(yǎng)基、0.1mol/LCaCl2滅菌溶液,IPTG,x-gal。
四、實(shí)驗(yàn)流程(一)感受態(tài)細(xì)胞的制備:1.預(yù)培養(yǎng):接一單菌落到3mLLB培養(yǎng)基中,370C、190rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;2.取0.4mL預(yù)培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含40mLLB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,370C、250rpm振蕩培養(yǎng)2.5~3小時(shí)(OD6000.4~0.5);3.將菌液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中,冰上放置10min;4.離心5000rpm,40C,5min;5.倒出培養(yǎng)液,將管倒置,使培養(yǎng)液流盡;6.菌體加入預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl21.0mL,輕吹并懸浮細(xì)胞,冰上10min;7.離心5000rpm,40C,5min,去上清;8.用冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2100μL用槍輕吹懸浮細(xì)胞,冰上操作;9.此為感受態(tài)細(xì)胞,若儲(chǔ)存則需加入15~30%甘油,可在-700C或-200C凍存。(二)轉(zhuǎn)化及復(fù)蘇:1.取100μL感受態(tài)細(xì)胞,加入重組DNA20μL
(50ng);
取100μL感受態(tài)細(xì)胞,加入20μL無(wú)菌水(陰性對(duì)照1);取100μL感受態(tài)細(xì)胞,加入對(duì)照DNA20μL
(陰性對(duì)照2)
用槍頭混勻,冰上放置20min。陰性對(duì)照的目的?2.420C循環(huán)水浴熱激90秒3.冰浴2分鐘4.每管加800μLLB液體培養(yǎng)基,370C慢搖40min(120~140rpm)5.40C,5000rpm離心2min,棄去600μL,取
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 橡膠壩施工方案
- 新零售門(mén)店數(shù)字化改造升級(jí)方案
- 健康產(chǎn)業(yè)健康管理及醫(yī)療服務(wù)創(chuàng)新方案設(shè)計(jì)
- 農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈項(xiàng)目投資合同
- 醫(yī)療美容手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)告知及服務(wù)效果免責(zé)協(xié)議
- 外架班組施工質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)制定
- 旅游度假灰土工程協(xié)議
- 電影院監(jiān)理工程師招聘合同
- 翻譯團(tuán)隊(duì)合租民居租賃協(xié)議
- 城市道路排水系統(tǒng)建設(shè)合同樣本
- 2024年度5G網(wǎng)絡(luò)覆蓋建設(shè)項(xiàng)目承包合同3篇
- 十四五規(guī)劃在醫(yī)療行業(yè)
- 2024年度特許經(jīng)營(yíng)合同連鎖酒店品牌授權(quán)與管理2篇
- 【MOOC】計(jì)算機(jī)組成原理-電子科技大學(xué) 中國(guó)大學(xué)慕課MOOC答案
- 廣東省潮州市2023-2024學(xué)年高二上學(xué)期期末考試 數(shù)學(xué) 含解析
- 2024年度技術(shù)咨詢合同:某科技公司與某政府機(jī)構(gòu)關(guān)于技術(shù)咨詢服務(wù)的協(xié)議(2024版)2篇
- 老年緩和醫(yī)療
- 醫(yī)療科研配色
- 2024年保安員資格考試題目及答案(共60題)
- 期末復(fù)習(xí)基礎(chǔ)卷(試題)-2024-2025學(xué)年一年級(jí)上冊(cè)數(shù)學(xué)人教版
- 急性胰腺炎的急救處理與家庭護(hù)理要點(diǎn)課件
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論