植物轉(zhuǎn)基因的花序浸潤(rùn)法

植物轉(zhuǎn)基因的花序浸潤(rùn)法自從1984年首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草以來(lái)，植物基因工程取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了日益廣泛的應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因作物在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用。但是，在大多數(shù)植物中還存在轉(zhuǎn)化率低、轉(zhuǎn)基因植株再生和鑒定難、操作周期長(zhǎng)等問(wèn)題，獲得大量轉(zhuǎn)基因植株仍然比較困難。目前，植物遺傳轉(zhuǎn)化最常用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法，存在著依賴于組織培養(yǎng)，操作復(fù)雜，過(guò)多的處理常引起受體組織的突變，以及轉(zhuǎn)化植株中常出現(xiàn)基因沉默等不足。而非組培植物基因轉(zhuǎn)化方法中，農(nóng)桿菌真空滲透法雖然無(wú)須經(jīng)過(guò)植物組織培養(yǎng)或再生，但是真空滲透過(guò)程很費(fèi)力。為此，在真空滲透法的基礎(chǔ)上又發(fā)展了花序浸潤(rùn)法(flora／dip)?；ㄐ蚪?rùn)法轉(zhuǎn)化首先在擬南芥中獲得成功，隨后對(duì)蘿卜、甘藍(lán)型油菜的轉(zhuǎn)化也獲得了成功?；ㄐ蚪?rùn)法轉(zhuǎn)化不需要進(jìn)行真空處理．只需將發(fā)育的花組織簡(jiǎn)單地浸泡在農(nóng)桿菌液中，大大簡(jiǎn)化了轉(zhuǎn)化程序，對(duì)其他物種的遺傳轉(zhuǎn)化也有很好的借鑒價(jià)值。結(jié)合筆者的實(shí)踐體會(huì)，本文以擬南芥為例介紹花序浸潤(rùn)法轉(zhuǎn)化的操作要點(diǎn)及其注意事項(xiàng)。花序浸潤(rùn)法轉(zhuǎn)化的操作要點(diǎn)1．1植株的培養(yǎng)擬南芥植株在植物生長(zhǎng)室或人工氣候箱中生長(zhǎng)至開(kāi)花階段，培養(yǎng)條件為16h光照/8h黑暗，在室外光照水平低于 14000LX時(shí)白天輔以18h高壓鈉光，濕度為80％。在盛有潮濕的培養(yǎng)土的25cm3容器中種植1?2株，或64cm3容器中種植6?20株。為了防止容器中的土在浸潤(rùn)時(shí)灑落進(jìn)接種介質(zhì)，土隆起至略微高出容器中的邊沿，播種后用尼龍窗紗或紗布織品覆蓋在土上并用橡皮帶固定。為了在每個(gè)植株上得到較多的花芽，當(dāng)大多數(shù)植株第一個(gè)花薹形成后剪去第一個(gè)花薹，解除頂端優(yōu)勢(shì)，促使多個(gè)次生花薹的同步出現(xiàn)。當(dāng)大多數(shù)花序約1?10cm高（剪主薹后4?8d）時(shí)開(kāi)始浸潤(rùn)。1．2農(nóng)桿菌的培養(yǎng)取出保種的農(nóng)桿菌菌液活化后，挑取農(nóng)桿菌單菌落接入10mL無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基中（一般含75mg/L利福平、100mg/L鏈霉素和100mg/L卡那霉素），28C恒溫下250r/min振搖過(guò)夜培養(yǎng)。再將所得到的菌液按1%?2%接入200mL同樣含上述抗生素LB液體培養(yǎng)基中，28C恒溫振搖使農(nóng)桿菌的濃度達(dá)到 OD600=18,然后在4C下3000r/rain離心15min,棄去上清液后用浸潤(rùn)培養(yǎng)基（1/2XMS大量+1xMS微量+1xMS鐵鹽+1xMS肌醇+1xMS維生素+0.5g/LMES+%蔗糖，pH值為5.7,高壓滅菌）重新懸浮農(nóng)桿菌，懸浮至0D600約0.80,且在浸潤(rùn)培養(yǎng)基中加入蔗糖和表面活性劑SilwetL-77,使之含有5．0%的蔗糖和0．05%（500卩L/L）的SilwetL-77 。1．3花序的浸潤(rùn)種菌加入大口容器中，每2?3個(gè)口徑9cm的容器用400?500mL用于浸染。將植株倒轉(zhuǎn)，使地上組織全部浸沒(méi)在農(nóng)桿菌懸浮液中2?3s，并要輕輕攪動(dòng)。浸潤(rùn)后植株上應(yīng)該有一層液體膜。浸潤(rùn)過(guò)的植株放在塑料盤(pán)中，用干凈的塑料或保鮮膜覆蓋以保濕，然后放置在弱光或暗處過(guò)夜，第二天放回溫室，注意小心防止陽(yáng)光直射植株。處理后約24h去掉覆蓋。正常地澆水和培養(yǎng)植株，植株進(jìn)一步生長(zhǎng)3?5周，直至角果變褐變干。收獲種子，并將種子用離心管在4C下干燥貯存。1．4轉(zhuǎn)化株的抗生素標(biāo)記選擇種子采用液體消毒，首先用95%的乙醇處理30?60s,接著用含0.05%吐溫(Tween20)的50%漂白劑(2.62%次氯酸鈉，最后體積)處理5min，然后用無(wú)菌水漂洗4?5次。為了選擇轉(zhuǎn)化植株，消過(guò)毒的種子懸浮在0．1%無(wú)菌瓊脂糖中，并以每個(gè)150mrhC15mm卡那霉素盤(pán)中覆3000粒(40mg)種子的方式播種，4C下冷處理2d,接著在24C(2和2800?5600Lx光照23h生長(zhǎng)7?IOd。選擇盤(pán)含有1/2xMS0.8%瓊脂粉和50g/mL卡那霉素。生長(zhǎng)的第一周培養(yǎng)皿和蓋子用封口膜密封,生長(zhǎng)過(guò)程中過(guò)多的水分通過(guò)簡(jiǎn)單地開(kāi)蓋從蓋子上抖落除去。在選擇培養(yǎng)基上長(zhǎng)出綠葉和完好的根系的抗卡那霉素苗即可確定為轉(zhuǎn)化株。在有3?5片成熟葉片后,轉(zhuǎn)化株移植至濕潤(rùn)的容器土中生長(zhǎng)至成熟,得到的抗性植株即可用于進(jìn)一步的分子檢測(cè)和性狀鑒定?；ㄐ蚪?rùn)法轉(zhuǎn)化應(yīng)注意的問(wèn)題2.1生長(zhǎng)狀態(tài)植物的生長(zhǎng)狀態(tài)是影響轉(zhuǎn)化成敗的一個(gè)重要因素，健康的生殖能力旺盛的植物有利于提高轉(zhuǎn)化效率。因?yàn)槿绻仓赀^(guò)于老熟，細(xì)胞對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性降低，而過(guò)于嫩弱的植株則容易受到傷害而難以收到一定數(shù)量的種子，轉(zhuǎn)化效果都不好。2．2修剪修剪第一個(gè)花薹促發(fā)許多次級(jí)花薹的增殖，而修剪可以反復(fù)進(jìn)行，以推遲植株的處理時(shí)間。最佳的植株應(yīng)有許多花序和許多未成熟的已受精角果。轉(zhuǎn)化之前要將已經(jīng)授粉的花和果莢除去，因?yàn)樗鼈儾豢赡鼙晦D(zhuǎn)化。所結(jié)的種子中不可能有轉(zhuǎn)化子存在，除去可以免去不必要的篩選工作。2．3浸潤(rùn)處理農(nóng)桿菌的重復(fù)使用可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，植株可以浸潤(rùn)2次或3次。擬南芥修剪后2d浸潤(rùn)1次，1周后浸潤(rùn)第二次。兩次浸潤(rùn)以間隔7d為宜，不要少于6d的間隔。但不同的作物在不同的生長(zhǎng)環(huán)境條件下生長(zhǎng)發(fā)育快慢不同，間隔處理的時(shí)間也應(yīng)作相應(yīng)改變。2．4蔗糖和表面活性劑蔗糖和表面活性劑是花序浸潤(rùn)法成功的關(guān)鍵，而 MS鹽和激素等沒(méi)有影響，細(xì)菌的0D也不會(huì)有很大影響。僅在浸染前加SilwetL-77至0.05%(500卩L/L)并混合好。如果有SilwetL-77的毒性問(wèn)題，采用0．02％或低至0．005％。2.5濕度接種后覆蓋植物保濕也能提高轉(zhuǎn)化效率。將浸潤(rùn)過(guò)的植株置于一個(gè)穹頂狀物或覆蓋下約24h以維持高濕度.但不要暴露于過(guò)強(qiáng)的陽(yáng)光下，因?yàn)轳讽敔钗锵碌目諝饪赡茏儫?。展望近年?lái)有關(guān)花序浸潤(rùn)法轉(zhuǎn)基因的報(bào)道逐漸增多，對(duì)于功能基因組的研究和分子育種，由于不需要植物組織培養(yǎng)、芐基腺嘌呤激素和pH值調(diào)節(jié)等，因此花序浸潤(rùn)法具有簡(jiǎn)單、快速、高效和實(shí)用等特點(diǎn)。隨著該方法的進(jìn)一步完善，它在植物