慢病毒包裝、濃縮、純化、滴度實驗步驟

-.z.一、包裝細胞293T細胞的培養(yǎng)一、293T細胞的凍存1.隨著傳代的次數(shù)增加，293T細胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降，出現(xiàn)突變等。所以要在細胞購進時就進展凍存。2.在細胞對數(shù)生長期進展凍存，增加細胞復蘇成活率。3.倒去細胞上清液，參加D-Hank's液洗去殘留的培養(yǎng)基。4.參加0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。5.鏡下觀察細胞變圓，細胞間間隙加大時，參加新鮮培養(yǎng)基吹打混勻。6.細胞計數(shù)。7.將細胞離心，1000rpm，2min。8.根據(jù)計數(shù)結果參加細胞凍存液〔70%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO〕重懸細胞，密度為3×106個/ml。10.第二天將細胞放入液氮灌，并記錄。二、293T細胞的傳代1.當細胞生長至集合率到達80~90%需要對細胞進展傳代操作，以擴大細胞數(shù)量，維持細胞良好的生長狀態(tài)。2.消化細胞，方法同上。3.細胞離心完畢后，參加完全培養(yǎng)基重懸。密度為3×105個/ml。4.分到10cm培養(yǎng)皿中，10ml/皿。三、293T細胞的復蘇1.當細胞傳代次數(shù)過多〔超過50代〕，細胞狀態(tài)變差時或細胞出現(xiàn)污染事故時，需要丟棄并對開場凍存的細胞進展復蘇。2.翻開水浴鍋，設置溫度為40℃。3.查看細胞庫記錄，根據(jù)記錄從液氮灌中取出凍存的細胞〔需戴上棉手套，防止被凍傷〕，迅速丟入水浴鍋中并快速晃動，在1~2min內使細胞溶液完全溶解。4.將1ml細胞溶液參加9ml完全培養(yǎng)基中并混勻后轉入10cm培養(yǎng)皿。5.放回37℃、3%CO2和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6.第二天觀察細胞存活率。倒掉舊的培養(yǎng)基，參加10ml新鮮培養(yǎng)基。二、慢病毒的包裝、濃縮和滴度測定1.所用病毒檢測引物為WPRE特異引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3'(forwardprimer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3'(reverseprimer)and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3'(probe)2.TaqManUniversalPCRMasterMi*(AppliedBiosystems，cat.no.4304437)3.TaqManDNATemplateReagentKit(AppliedBiosystems，cat.no.401970)4.TaqManRNasePcontrolreagent(AppliedBiosystems，cat.no.4316844)用于包裝的293T細胞的培養(yǎng)用于包裝的293T細胞(ATCCNo.CRL-11268)必需選擇處于生長旺盛期，細胞狀態(tài)較佳，存活率90%以上，細胞邊緣清晰，傳代次數(shù)較低。任何時候細胞集合率都不準到達100%。慢病毒的包裝1.預先準備3個T150瓶的293T細胞，培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS，1%Glutama*，1%青霉素-鏈霉素。2.將細胞分到12分到12個T150瓶中，每瓶的細胞密度是8×106個。3.第二天，鏡下檢查細胞。細胞融合度應大致為30-40%，分布均勻。4.轉染前1小時，取出細胞板，去除原有細胞培養(yǎng)基，參加20ml的Opti-MEM培養(yǎng)基，將細胞送回培養(yǎng)箱。5.取兩支無菌的50ml離心管，其中一支中參加252μgpNL-EGFP/CMV/WPREDU3載體質粒，168μgpCD/NL-BH*DDD包裝質粒和84μgpLTR-G質粒，用Opti-MEM培養(yǎng)基補齊到18ml。另一支中參加500μlTrans-EZ溶液和17.5mlOpti-MEM培養(yǎng)基，用電動移液器輕輕混勻。將Trans-EZ稀釋液滴加到質粒管中，邊加邊輕輕晃勻。關鍵步驟：推薦使用Qiagen質粒大抽試劑盒或相當?shù)脑噭┖兴苽涞馁|粒。6.室溫孵育20分鐘，使DNA和Trans-EZ充分結合形成轉染復合體。7.取1支5ml的移液管，將得到的DNA-Trans-EZ復合體均勻滴參加到細胞培養(yǎng)板中，每板3ml。來回晃動培養(yǎng)板，混勻后放回到5%二氧化碳培養(yǎng)箱。每一皿細胞培養(yǎng)盤不要超過6盤。8.6小時后，移去細胞上清，更換為17ml的DMEM完全培養(yǎng)基。9.轉染后一天觀察細胞，所有的細胞應當都是安康的并且密度接近60-80%。如果所轉染質粒帶有GFP熒光，則這時候可以看到大于95%的細胞都是帶有熒光的。10.將細胞送回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2天〔36-48小時〕。在這個過程中，細胞會逐漸融合形成多核體，大多數(shù)的細胞依然貼壁。11.收集所有的上清，分裝到50ml離心管中。12.4℃，500g離心10分鐘，除去脫落的細胞和大的細胞碎片。13.總的上清約為204ml，用250-ml0.45μmPVDF過濾裝置過濾。如果發(fā)現(xiàn)濾膜被堵住，表現(xiàn)為過濾速度變慢，更換新的濾器。慢病毒的濃縮與純化方法一超速離心沉淀法1.取6個Ultra-clearSW28離心管，用70%乙醇消毒后，放在超凈工作臺中翻開紫外燈繼續(xù)消毒30分鐘。2.每個Ultra-clearSW28離心管中參加約32ml的預先處理的病毒上清液。3.取一支10ml的移液管，吸取12ml20%的蔗糖溶液。將移液管一直插入到離心管的底部，緩慢將蔗糖溶液打出4ml。同樣地，將剩下8ml的蔗糖溶液分別參加到另兩個離心管中。另取一支干凈的移液管，對剩下3管進展同樣處理。4.用PBS調整各管的重量，使對應的離心管之間的重量相差不超過0.1g。5.按次序將所有6個離心管放入BeckmanSW28超速離心轉頭中。7.小心將管子從轉頭中取出。倒掉上清，將離心管倒扣在紙巾上放置10分鐘使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底應當有可見的沉淀。8.每管中參加100ml不含鈣和鎂的PBS洗下沉淀。9.將SW28超速離心管插入到50ml錐底離心管中，蓋上蓋子。10.在4℃溶解2小時，每隔20分鐘輕輕震蕩。11.4℃，500g離心1分鐘，使溶液集中于管底。12.用200μl移液器輕柔吹打使沉淀重懸。防止產(chǎn)生泡沫。將所有管中的液體集中到一個SW28離心管中。13.集中后的病毒懸液分裝成50μl每份，保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲存在-80℃。方法二PEG-8000濃縮法PEG〔聚乙二醇〕是高分子聚合物，具有高親水性，在溶液中會吸收大量水分，減少病毒之間的距離，使病毒與病毒能夠很容易的聚合在一起，病毒的相對濃度提高，到達沉淀濃縮的目的。5*PEG8000+NaCl配制稱取NaCl8.766g;PEG800050g溶解在200mlMilli-Q純水中；121攝氏度30min濕熱滅絕30min；保存在4℃。1.使用0.45μm濾頭過濾慢病毒上清液；3.每20～30min混合一次，共進展3-5次；4.4度放置過夜；5.4度，4000g，離心20min；6.吸棄上清，靜置管子1～2分鐘，吸走剩余液體；7.參加適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；8.集中后的病毒懸液分裝成50μl每份，保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲存在-80℃病毒滴度的測定稀釋計數(shù)法滴度單位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。〞TU〞為〞transducingunits〞的縮寫，中文為"轉導單位〞，表示可以感染并進入到靶細胞中的病毒基因組數(shù)。第一天細胞準備將生長狀態(tài)良好的293T細胞消化計數(shù)后稀釋至1×105/ml，參加96孔板，100μl/孔，為每個病毒準備10個孔。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)10個稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準備10個1.5mlEP管，每管參加90μl培養(yǎng)液，往第一個管中參加10μl病毒原液，混勻后，吸取10μl參加第二個管混勻。依此類推，做十個稀釋度〔10~10-8〕。吸取96孔板中原有的培養(yǎng)基，參加含稀釋好的病毒液。并做好標記。第三天追加培養(yǎng)液在每個孔再參加100μl完全培養(yǎng)液，利于細胞的生長。第五天觀察結果并計算滴度在熒光顯微鏡下觀察結果，并數(shù)出最后兩個有熒光的熒光細胞克隆數(shù)。假設為*和Y，則滴度〔TU/ml〕=〔*+Y*10〕*1000/2/*孔的病毒液的含量〔μl〕。定量PCR法病毒感染1天前，取6孔板接種HOS細胞。每孔細胞為5×104個。接種細胞24小時后，取兩個孔的細胞用血球計數(shù)板計數(shù)，確定感染時細胞的實際數(shù)目，記為N。棄去其他培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，更換為含有5μg/mlpolybrene的新鮮培養(yǎng)基。將濃縮病毒用培養(yǎng)基稀釋200倍，也就是取1μl病毒參加到199μl的培養(yǎng)基中。在3個培養(yǎng)孔中分別參加0.5μl，5μl和50μl的稀釋病毒。感染開場后20小時，除去培養(yǎng)上清，換為500μl含DNaseI(TakaraMirusBio，終濃度為10U/ml)的新鮮培養(yǎng)基。在37℃消化15分鐘，這一步是要除去剩余的質粒DNA。然后換為2ml正常的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。用0.5ml0.25%胰酶-EDTA溶液消化細胞，在37℃放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗下，離心收集細胞。按照DNeasy試劑盒的說明抽提基因組DNA。每個樣品管中參加200μl洗脫液洗下DNA。用DNA定量試劑盒定量〔Bio-Rad〕?；蚪MDNA可以穩(wěn)定保存在-20℃至少2個月。準備PCR所需的試劑和樣品。為病毒序列檢測引物配總管Ⅰ：2×TaqManMasterMi*25μl×n

Forwardprimer(100pmolml-1)0.1μl×nReverseprimer(100pmolml-1)0.1μl×nProbe(100pmolml-1)0.1μl×n

H2O

19.7μl×n

n=numberofreactions.例如：總反響數(shù)為40，將1ml2×TaqManUniversalPCRMasterMi*，4μlforwardprimer，4μlreverseprimer，4μlprobe和788μlH2O混和。震蕩后放在冰上。為人基因組序列檢測引物配總管Ⅱ：2×TaqManMasterMi*25μl×n

10×RNasePprimer/probemi*2.5μl×n

H2O

17.5μl×n

n=numberofreactions.例如：總反響數(shù)為40，將1ml2×TaqManUniversalPCRMasterMi*，100μl10×RNasePprimer/probemi*和700μlH2O混和。震蕩后放在冰上。在預冷的96孔PCR板上完成PCR體系建立。從總管Ⅰ中各取45μl參加到A-D各行的孔中，從總管Ⅱ中各取45μl參加到E-G各行的孔中。分別取5μl質粒標準品和待測樣品基因組DNA參加到A-D行中，每個樣品重復1次。另留1個孔參加5μl的水做為無模板對照〔no-templatecontrol〕。分別取5μl基因組標準品和待測樣品基因組DNA參加到E-G行中，每個樣品重復1次。另留1個孔參加5μl的水做為無模板對照〔no-templatecontrol〕。所使用定量PCR儀為ABIPRISM7000定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設定為：50℃2分鐘，95℃10分鐘，然后是95℃15秒，60℃1分鐘的40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析：測得的DNA樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標定，得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。滴度〔integrationunitsperml，IUml-1〕的計算公式如下：IUml-1=(C×N×D×1000)/V其中：

C=平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)

N=感染時細胞的數(shù)目〔約為1×105〕

D=病毒載體的稀釋倍數(shù)

V=參加的稀釋病毒的體積數(shù)慢病毒的儲存與稀釋慢病毒的儲存1.病毒的運輸采用干冰保溫，收到病毒液后假設幾天內用于實驗，可于4℃保存〔于一周內用完〕。2.假設病毒量較大，需長期保存。則根據(jù)每次實驗用量分裝后放于-80℃冰箱。一般病毒可以放于-80℃約12個月以上，但假設超過6個月后使用，請重新檢測病毒滴度。3.防止反復凍融，否則會降低病毒滴度。每次凍融會降低病毒滴度10%。慢病毒的稀釋需要稀釋病毒時，將病毒取出后置于冰上融解，用細胞培養(yǎng)用D-Hank's、PBS或培養(yǎng)基稀釋到所需濃度后混勻分裝后4℃保存，并盡快用于實驗〔于一周內用完〕。慢病毒在細胞水平的使用什么是MOI？"MOI〞為〞multiplicityofinfection〞的縮寫，中文為"感染復數(shù)〞或"復感染指數(shù)〞，含義為感染時病毒和細胞數(shù)量的比值，即平均每個細胞感染的病毒活性單位數(shù)〔TUnumber/cell〕。在實驗中將*種細胞感染到達80%時的MOI定義為這種細胞的MOI。MOI與整合事件以及目的基因的表達相關。一定范圍內，表達水平和MOI呈正相關。MOI取決于多種因素，如細胞狀態(tài)，目的基因的大小與性質，細胞的感染效率等。所以，實驗前需查閱相關文獻，確定慢病毒對目的細胞的親嗜性、MOI以及在體〔invivo〕注射所需病毒量。假設無文獻支持，可以通過預實驗得到適宜的MOI。實際上，即使有文獻支持，但由于所用細胞代數(shù)、細胞狀態(tài)以及目的基因的差異，實際的MOI和文獻報道也會不同，所以要安排預實驗以確定所需MOI以及病毒對細胞生長的影響。目的細胞感染預實驗及實驗體系的放大實驗目的：確定細胞感染所需的MOI，以及是否需要添加感染增強劑Polybrene。實驗材料：96孔板，1.5mlEP管，長勢良好的目的細胞一瓶，滴度的慢病毒溶液，Polybrene〔10mg/ml〕，目的細胞培養(yǎng)基等。第一天：細胞準備將長勢良好的目的細胞接種到96板，消化好細胞〔懸浮細胞不需要消化，直接離心收集細胞后加新鮮培養(yǎng)基重懸即可〕后把濃度調為3×104~5×104個/ml，按90μl/孔參加。接種細胞數(shù)量因細胞的生長速度而略有不同，一般是保證第二天進展病毒感染時細胞集合率介于30~50%之間。第二天：病毒感染感染實驗分兩組，一組直接添加病毒液，一組同時添加Polybrene。病毒稀釋方法同病毒滴度測定時方法，10倍倍比稀釋，共三個稀釋度，MOI值依次為100，10和1〔細胞經(jīng)過一天的生長數(shù)量約為1×104個/孔，對應的病毒數(shù)量為1×106TU、1×105TU和1×104TU〕。每個MOI值加兩個孔，取出一組參加感染增強劑，比例為1：2000，終濃度為5μg/ml。第二天：換液感染實驗同一天，8-12小時后，棄去上清液，更換為新鮮培養(yǎng)基，100μl/孔。