流式細(xì)胞20131101課件

第七章組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)定量分析技術(shù)顯微圖像分析流式細(xì)胞術(shù)激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)第二節(jié)流式細(xì)胞術(shù)1930年，Casperrsson和Thorell開始致力于細(xì)胞的計數(shù)；1949年，Coulter提出在懸液中計數(shù)粒子的方法并獲得專利；1969年，VanDillaFulwyler及其同事們在

LosALmos，NM（即現(xiàn)在的NationalFlowCytometryResourceLabs）發(fā)明第一臺熒光檢測細(xì)胞計；2010初流式細(xì)胞術(shù)(FCM)定義流式細(xì)胞術(shù)：利用流式細(xì)胞儀對處于快速流動的細(xì)胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速的定量分析及分選的技術(shù)激光技術(shù)+流體力學(xué)+光電測量技術(shù)+計算機技術(shù)+細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)+單克隆抗體技術(shù)FCM的特點測量速度快：最快可在1秒鐘內(nèi)檢測上萬個細(xì)胞可進行多參數(shù)測量：可以對同一個細(xì)胞做有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測量具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義：提供細(xì)胞群體的均值和分布情況高分辨率(CV<2%)、高靈敏度(熒光檢測靈敏度≤100MESF，前向角散射光檢測靈敏度(0.2－0.5um)既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)，分選純度可達99%以上流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀組成液流系統(tǒng)：依次傳送待測樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)。光路系統(tǒng)：細(xì)胞由激光激發(fā)，通過光學(xué)濾片產(chǎn)生光信號，并傳送到相應(yīng)的探測器。電系統(tǒng)：把光信號轉(zhuǎn)換為電信號。對于有分選裝置的儀器，電系統(tǒng)可初始化分選條件。分析系統(tǒng)

熒光檢測器光學(xué)系統(tǒng)激光、透鏡組、光電倍增管（PMT）等。Laser大小內(nèi)部結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀的熒光檢測信號使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細(xì)胞抗原的表達含量熒光信號-熒光素種類FITC(異硫氰酸熒光素）：綠色530nmPE（藻紅蛋白）：橙黃色575nmPerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：深紅色675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm 488nm波長的氬離子激光激發(fā)APC(別藻蘭蛋白）：紅色660nm630nm波長的氦氖激光或紅色二極管激光激發(fā)PE最強，適用于弱表達抗原FITC最便宜，適用于強表達抗原，適用范圍廣biotin-avidin不適合弱抗原的檢測抗體的選擇流式細(xì)胞術(shù)的常用樣品制備方法單層培養(yǎng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備

胰酶消化；PBS液,用吸管反復(fù)吹打,使其分散為單個細(xì)胞懸液,移入離心管中；離心,去掉上清液,加入約0.5mlPBS液,用振蕩器使細(xì)胞分散；將細(xì)胞迅速注入4℃70%乙醇中，保存于4℃冰箱中備用。實體組織單細(xì)胞懸液的制備機械法剪碎勻漿抽吸過濾酶處理法組織剪成小塊酶消化過濾離心PBS石蠟包埋組織的流式細(xì)胞樣品制備

二甲苯脫蠟蒸餾水洗1%胃蛋白酶消化離心樣品制備注意去除死細(xì)胞免疫熒光染色的注意事項及其處理細(xì)胞分選或檢測細(xì)胞存活率時，要保持細(xì)胞新鮮。標(biāo)本的保存和固定：未染色培養(yǎng)細(xì)胞可常規(guī)凍存。不需排除死細(xì)胞可進行染色前固定。若要排除死細(xì)胞、染色后長時間存放、或標(biāo)本具有傳染性，需要染色后固定。表達來自同一細(xì)胞兩個參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量間的關(guān)系。X坐標(biāo)為該細(xì)胞一參數(shù)的相對含量，Y坐標(biāo)為該細(xì)胞另一參數(shù)的含量，可以將各細(xì)胞亞群區(qū)分開。流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)處理與分析-二維點圖綠色熒光強度紅色熒光強度CD3CD4FCM的應(yīng)用分類細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大??；細(xì)胞顆粒度；細(xì)胞表面面積；核漿比例DNA、RNA含量及細(xì)胞周期分析免疫學(xué)分析淋巴細(xì)胞亞群；白血病/淋巴瘤免疫分型；檢測細(xì)胞特異性標(biāo)記物；細(xì)胞絕對計數(shù)；細(xì)胞功能分析細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原；細(xì)胞活性；細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子；酶活性；激素結(jié)合位點；細(xì)胞受體細(xì)胞凋亡研究鑒別凋亡與壞死；測定凋亡率；腫瘤基因表達產(chǎn)物的檢測利用GFP或YFP為探針檢測基因轉(zhuǎn)染;死、活細(xì)胞鑒定：透過活細(xì)胞膜進入細(xì)胞內(nèi)發(fā)出黃綠色熒光的醋酸酯熒光素（FDA）；對固定細(xì)胞及膜破損細(xì)胞的核進行染色，如碘化丙啶（PI）和溴化乙錠（EB）。1細(xì)胞結(jié)構(gòu)2.細(xì)胞周期NormalCellCycle0

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontent(flurorescencintensity)2N4NcountDNA分析的臨床意義DNA分析診斷腫瘤DNA非整倍體細(xì)胞峰突出的四倍體細(xì)胞峰增殖狀態(tài)分析 反映了腫瘤的生長速度和侵襲性凋亡細(xì)胞DNA含量較少，在G0-G1期前有一個亞二倍體峰，是凋亡細(xì)胞。死亡細(xì)胞DNA含量也減少，死亡細(xì)胞峰離G0-G1期峰較遠。該法難于區(qū)分凋亡和死亡的細(xì)胞。FCM對細(xì)胞凋亡的分析

DNACycle細(xì)胞數(shù)目PI的熒光強度GO/G1G2/MS干細(xì)胞中的研究應(yīng)用

-Hoechst33342sidepopulation干細(xì)胞能表達ABCG2泵蛋白，在HOECHST33342染色時能將該染料泵出，因此分析不能被該染料染色的細(xì)胞群時可以發(fā)現(xiàn)一群不能染色的細(xì)胞既是干細(xì)胞，因此能夠在眾多腫瘤細(xì)胞中區(qū)分出腫瘤干細(xì)胞。QUANTA檢測SP細(xì)胞群陽性對照使用已知陽性樣本，幫助排除試劑的質(zhì)量、濃度、特異性以及染色方法等因素陰性對照空白對照(自發(fā)熒光）直接染色法時，用PBS代替熒光單克隆抗體。間接染色法時，PBS代替第一抗體和熒光第二抗體。同型對照（自發(fā)熒光＋非特異熒光）非特異性抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg）代替特異性單克隆抗體。選擇與實驗用單克隆抗體亞類一致的MsIg，即MsIgG或MsIgM。直接染色法時，熒光結(jié)合MsIg代替熒光單克隆抗體。間接染色法時，無熒光MsIg代替第一抗體。熒光染色對照流式細(xì)胞術(shù)在移植中的應(yīng)用移植配型和群體反應(yīng)性抗體的檢測熒光示蹤標(biāo)記的移植細(xì)胞：CFSE是一個確定的熒光標(biāo)記物，開發(fā)其它穩(wěn)定的熒光素應(yīng)該更有幫助多用于干細(xì)胞研究，收獲具有活力的目的細(xì)胞。取材、染色到上機分選需要無菌環(huán)境。直接法進行活細(xì)胞染色人外周血中獲得CD34+/CD90+造血干細(xì)胞。CD34+細(xì)胞是比較早期的干細(xì)胞，但CD34+細(xì)胞是異質(zhì)性的，多能干細(xì)胞只占其中一小部分，更原始的部分應(yīng)該富含在CD34+/CD90+、CD34+/CD38-和CD34+/AC133+等部分。純化出這些更原始的部分進行體外培養(yǎng)，才能更加真實地了解原始造血干細(xì)胞的特性和增殖分化特征。FCM對培養(yǎng)細(xì)胞的免疫熒光分選分選基本原理T細(xì)胞分析相對計數(shù)－淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量檢查項目和意義疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低嚴(yán)重降低增高降低SARS降低降低降低降低降低慢性活動性肝炎、肝硬化降低正?；蛟龈呓档徒档湍[瘤降低降低增高降低降低流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展趨勢從單純大型儀器發(fā)展為適應(yīng)各種實際應(yīng)用的便攜式、臺式、高分辨率、高質(zhì)量分選的研究型流式細(xì)胞儀；對流式細(xì)胞術(shù)檢測熒光參數(shù)，從采用熒光單色、雙色分析發(fā)展為多色分析，目前最多可同時檢測15種熒光信號；從檢測參數(shù)的相對定量發(fā)展為絕對定量；從檢測參數(shù)的手動人工分析發(fā)展為利用計算機軟件的自動分析；所采用的熒光試劑，從非配套試劑發(fā)展為配套的試劑盒試劑。而這一切，就要求流式細(xì)胞儀使用者和科研人員，一定要不斷地有意識地學(xué)習(xí)上述各門學(xué)科知識，只有這樣才能更好地將流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)的臨床實踐和基礎(chǔ)科學(xué)研究工作中去。MicroCyte型便攜式流式細(xì)胞儀

開啟流式普及化時代

——AccuriC6超高性價比流式細(xì)胞儀第三節(jié)、激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù) LaserandelectronicControlUnit激光光源及控制裝置Computer計算機Confocalscananddetectorunit共聚焦掃描及檢測裝置Microscope熒光顯微鏡Anti-vibrationtable防震臺LeicaTCSSP-2MPAOBSConfocalSystem圖像分析功能光學(xué)切片三維圖像重建

熒光標(biāo)記物的定位和定量分析

細(xì)胞生物學(xué)功能激光掃描共聚焦顯微鏡在組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)中的應(yīng)用光學(xué)切片一個以最小步距0.1μm的微動步進馬達控制載物臺升降，使聚焦平面依次位于組織標(biāo)本的不同層面，可以逐層獲得標(biāo)本相應(yīng)的光學(xué)橫斷面圖像。這一過程稱為“光學(xué)切片”，這種功能稱為“顯微CT”。用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像C-CCDConfocalConfocalvsC-CCDCellCell針孔效應(yīng)：XY圖像三維圖像重建經(jīng)計算機圖像處理及三維重建軟件將得到各光學(xué)切片的數(shù)據(jù)組合，形成一個真實的三維圖像，并可從任意角度觀察，也可以借助改變照明角度來突出特征性結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生更生動、逼真的三維效果。三維膠原基質(zhì)培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞三維膠原基質(zhì)培養(yǎng)的血管熒光標(biāo)記物的定位和定量分析熒光定位分析可以自動將熒光圖像與相差圖像重疊，以顯示熒光標(biāo)記物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的精確定位。熒光定量分析可以對經(jīng)過熒光標(biāo)記的組織標(biāo)本的共聚焦熒光進行定量分析，并顯示熒光沿Z軸的強度變化。定量免疫熒光測定對經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色的細(xì)胞進行共聚焦熒光斷層掃描成像，每個細(xì)胞掃32個切面，用三維和定量軟件觀察與測定細(xì)胞內(nèi)熒光變化

定量圖像分析不僅可以對生物樣本進行二維和三維圖像分析，還可以與熒光探針相結(jié)合，在圖像處理的同時，進行圖像定量分析。例如細(xì)胞面積、周長的測定和細(xì)胞核面積的測定，從而可以將生物體的形態(tài)學(xué)特征進行量化，提高了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。激光掃描共聚焦顯微鏡定量分析的優(yōu)勢更精細(xì)、精確度更高LSCM進行間接免疫熒光組化染色并做定量分析，利用激光聚焦、熒光標(biāo)記和系統(tǒng)軟件分析對組織進行深層掃描，不破壞組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可深層次準(zhǔn)確定位并精確定量。而一般圖像分析只是以熒光灰度的差別變化進行半定量分析。LSCM一般有兩個以上不同波長的激光管，只要將標(biāo)本標(biāo)記上不同波長的熒光，則可以在同一張切片上同時分析兩種或更多不同指標(biāo)的變化，并比較它們之間的比值變化，精確而又方便，這一特點是一般圖像分析無法比擬的。LSCM可根據(jù)需要提供純熒光、白光以及熒光與白光合成圖像等多種圖像，遠遠優(yōu)于一般圖像分析。以往免疫熒光染色多要求冰凍新鮮組織標(biāo)本，用石蠟切片在普通熒光顯微鏡下觀察，常因背景非特異性熒光過強影響觀察結(jié)果。LSCM可掃描石蠟切片的熒光染色，可避免因背景非特異性熒光過強而影響觀察結(jié)果，從而可獲得清晰圖像。原則：盡量減小不同熒光物質(zhì)間激發(fā)/發(fā)射光譜的重疊。標(biāo)記要求熒光素選擇/組合核復(fù)染單標(biāo)

無特殊限制。

FITC,Cy2最佳；盡量不選擇Cy5,Cy5.5（紅外)與自發(fā)熒光沖突時，采用TexasRed

。PropediumIodide(PI)/DAPI雙標(biāo)FITC/Cy2+TEXASREDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3(必須順序掃描)DAPI

(必須順序掃描)三標(biāo)FITC/Cy2

+TEXASRED+Cy5.5FITC/Cy2

+RHODAMINE/Cy3+Cy5.5(必須順序掃描)活細(xì)胞追蹤△能被細(xì)胞主動攝取、對細(xì)胞無毒性作用、能在活細(xì)胞內(nèi)長時間存在、隨細(xì)胞分裂進入子細(xì)胞

()△

顯微注射；轉(zhuǎn)基因技術(shù)（GFP；GFP-ACTIN）熒光的選擇靜態(tài)結(jié)構(gòu)檢測原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子、觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)細(xì)胞原位檢測核酸用于細(xì)胞核定位及其形態(tài)學(xué)觀察、檢測細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制及斷裂情況以及染色體定位觀察。原位檢測蛋白質(zhì)、抗體及其他分子免疫熒光標(biāo)記技術(shù)檢測熒光蛋白檢測細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞凋亡不同時期細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞器觀察及測定探針可以直接跨過死細(xì)胞或活細(xì)胞膜，選擇性地與特定細(xì)胞器結(jié)合檢測細(xì)胞融合觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)觀察細(xì)胞間縫隙連接通訊檢測細(xì)胞內(nèi)脂肪尼羅紅檢測動物組織中或體外培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)脂滴含量動態(tài)觀察：

活體細(xì)胞或組織功能的實時動態(tài)檢測實時定量測定細(xì)胞內(nèi)鈣的變化----鈣離子濃度測定和比率成像測定細(xì)胞內(nèi)pH變化檢測膜電位的變化

JC-1低電位下單體存在，發(fā)綠色熒光；高電位下JC-1聚集體，發(fā)紅色熒光，隨電位增加，紅色熒光也增加檢測熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)檢測熒光漂白恢復(fù)將待測細(xì)胞用熒光物質(zhì)標(biāo)記，淬滅；低強度激光掃描成箱，非淬滅分子移動，直接反映熒光標(biāo)記物質(zhì)及其結(jié)合物的運動，因此可用來研究縫隙連接通訊的快慢.神經(jīng)元細(xì)胞融合檢測利用DIL,DIO對神經(jīng)元細(xì)胞進行染色觀察和流式檢測原理:檢測游離Ca2+變化的熒光探針多為Ca2+螯合劑，通常不能透過細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯(AM)相連方可進入細(xì)胞內(nèi),被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后方能與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。

活細(xì)胞內(nèi)離子動態(tài)變化測量FLuo3-AM464nm526nmCalciumGreen-1507nm530nmCalciumGreen-2507nm535nmOregonGreen488494nm520nmFurared420/480nm637nm熒光激發(fā)波長發(fā)射波長KCLKCL誘導(dǎo)的細(xì)胞外Ca++內(nèi)流測量培養(yǎng)/分離的細(xì)胞20MFluo3-AM負(fù)載液30-60min清洗、換液掃描KCL激光掃描共聚焦顯微鏡觀察線粒體膜電位的改變采用JC-1熒光標(biāo)記檢測神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位，其在低膜電位下發(fā)綠色熒光，在較高電位時形成JC-1聚集體，發(fā)紅色熒光，正常神經(jīng)細(xì)胞紅、綠色熒光均明顯，線粒體膜電位較高，缺氧3h復(fù)氧12h后，綠色熒光明顯，紅色熒光非常低弱，線粒體膜電位下降明顯，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；0.025g/LTTLS治療組神經(jīng)細(xì)胞的紅色熒光明顯增強，線粒體膜電位明顯升高（P<0.01）。A:normalcontrolgroup;B:untreatedgroup;C:0.025g/LTTLS-treatedgroup.IntensityBeforebleachAfterbleach90minafterbleach熒光漂白恢復(fù)(FluorescenceRecoverafterphotobleaching;FRAP)

檢測細(xì)胞連接間的信息傳遞熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)受激態(tài)熒光素將其能量向另一個熒光素傳遞，使后者被激發(fā)，這一過程稱熒光能量共振轉(zhuǎn)移。能量的提供者叫供體熒光素，能量的接受者叫受體熒光素。供體熒光素受體熒光素GFP-FRET基本原理BFP、GFP兩種熒光蛋白，它們的發(fā)射光譜相距較遠，觀察時易于區(qū)分。BFP的發(fā)射光譜與GFP的激發(fā)光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B，當(dāng)它們足夠接近時，用BFP的激發(fā)波長刺激，BFP的發(fā)色基團將會把能量轉(zhuǎn)移至GFP的發(fā)色基團上，所以主要發(fā)射的將是GFP的熒光。

檢測以供體的激發(fā)波長的光照射樣品,沒有共振轉(zhuǎn)移時，只檢測到供體的熒光，發(fā)生共振轉(zhuǎn)移時，供體的熒光減弱，受體被激發(fā)出現(xiàn)熒光。應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)分子之間相互作用(受體與配體的相互作用)大分子構(gòu)象的改變(檢測酶活性變化

)成功獲得神經(jīng)細(xì)胞信息傳遞實時成像2009年，丹麥哥本哈根大學(xué)的研究人員采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)，成功地實現(xiàn)了神經(jīng)細(xì)胞囊泡融合過程的實時成像。Langmuir.2010Oct19;26(20):15722-5.Multicolordye-dopedsilicananoparticlesindependentofFR