學(xué)習(xí)小禮包-3實(shí)驗(yàn)相關(guān)

10步填上免疫組織化學(xué)(IHC)的 標(biāo)本固 脫水、石蠟包埋和制 脫蠟和水 抗原修 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物 封 一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí) 切片DAB顯 免疫組化分 免疫組化（IHC）全攻略（含 IHC的基石‖：原理及步 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分 IHC的疑難雜 電腦中有這兩個(gè)P就可以搞定 從0開(kāi)始，準(zhǔn)確又快速利用Oligo7設(shè)計(jì)PCR引 Oligo7軟件安 找到目的序 設(shè)計(jì)引物序 分析引物并選 RNA反轉(zhuǎn)錄的六大要 RTPrimer的最佳選 RNA的二級(jí)結(jié) 去除 檢測(cè)RNA分子的完整 RNA定 兩步法或一步法RT- 數(shù)學(xué)不好的人是怎么做qPCR的？實(shí)驗(yàn)計(jì)算器在這 如何擬合Elisa標(biāo)準(zhǔn)曲 方法 方法 經(jīng)典 Primer Beacon 款 Primer3 ThePCR 快速獲取通 及登 和小伙伴一起記錄實(shí) 多終端協(xié) 群體結(jié)構(gòu)三劍客—structure入 Real-TimePCR引物設(shè)計(jì)案例版，誰(shuí)看誰(shuí)會(huì) 引物設(shè)計(jì)具體操作，以設(shè)計(jì)TP53引物為 引物設(shè)計(jì)原 單細(xì)胞分析工具的發(fā)展 工具雖好，還要謹(jǐn)慎選 circRNA研究必備之傻瓜攻略大 circRNA基本信息分析 ceRNA功能研究數(shù)據(jù)庫(kù) circRNA人疾病相關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù) circRNA組織特異性分布數(shù)據(jù)庫(kù) circRNA編碼蛋白數(shù)據(jù)庫(kù) 預(yù)測(cè)結(jié)合靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫(kù) Primer6安裝、、引物設(shè)計(jì)攻 安裝引物設(shè) 驗(yàn)證引 設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物方 一、 二、 Western-Blot之磷酸化蛋白一步一步教你做WB圖，超簡(jiǎn)單?。ê?、工具和素材 熒光定量PCR的秘 模板制作,小便宜別去 引物印證這一步，別小 我為什么選用96孔板 程序設(shè)置，聽(tīng)說(shuō)明書(shū)，還是機(jī)器設(shè)定 如何優(yōu)雅地獲得漂亮小分子蛋白條 10步填上免疫組織化學(xué)(IHC)免疫組織化學(xué) (Immunohistochemistry，IHC) 或免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry,ICC)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些多肽和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)行原位定性、定位或定量研究的實(shí)驗(yàn)技術(shù)?？傮w來(lái)說(shuō)IHC的實(shí)驗(yàn)流程和方法并不難，但做出漂亮的染色結(jié)果卻不那么容易，在IHC實(shí)驗(yàn)中許多細(xì)節(jié)也也值得注意。那么細(xì)節(jié)主要是哪一些呢？且聽(tīng)標(biāo)本固固定（Fixation）是使用化學(xué)試劑處理組織或細(xì)胞，的目的除了使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固，減少或終止內(nèi)源性或外源性細(xì)胞內(nèi)分解酶的反應(yīng)，防止組織細(xì)好的固定劑具有滲透性強(qiáng)；其次不能使組織發(fā)生過(guò)度收縮變形；還需使組織得到一定的硬度，有較好的折光度。固定劑多種多樣，例如無(wú)水對(duì)糖原保存較好，容易使細(xì)胞收縮，其性能與95%相似，很少單獨(dú)使用，一般只用于糖原的固定不同的抗原對(duì)固定液耐受程度不同。為易揮發(fā)的無(wú)色液體，有刺激性氣體?？墒沟鞍踪|(zhì)沉淀，滲透性強(qiáng)，細(xì)胞收縮嚴(yán)重，對(duì)核的固定差廣泛用于酶組織化學(xué)中的各種酶的固定，也有人用于抗原的保存，作為細(xì)胞涂片免疫組化的固定液。此外，有些固定劑對(duì)特殊組織有更好效果，如對(duì)于頭皮、指甲固定有軟化效果，戊二醛（含有兩個(gè)醛基，具有很強(qiáng)的交聯(lián)作用）常用于電鏡標(biāo)本的固定，使用濃度為2.5%，PLP固定液（Periodaysine-paraformaldehyde，由過(guò)碘酸、賴(lài)氨酸和多聚混合組成的磷酸鹽緩沖液）對(duì)于含糖組織抗原保存更好。如上所述我們需要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的固定劑。目前常用的固定劑有中性液（飽和水溶液稱(chēng)為福爾），4%多聚-磷酸鹽緩沖液。多聚固定效果溫和，廣泛應(yīng)用于免疫組織化研究。能夠以固體的形式存在，即白色粉末狀的多聚。將多聚溶于PB，加熱至60℃（加熱可使多聚解聚為單體，必要時(shí)可滴加少量NaOH促進(jìn)其溶解），加熱攪拌至液體透明為止。固定方法多種多樣，常用的有法、灌注法、原位法、滴片法、蒸汽法、微波法等，其中以固定和灌注固定效果最好。灌注固定中將灌注針主動(dòng)脈內(nèi)是灌注固定的關(guān)鍵，也是難點(diǎn)。首先準(zhǔn)確找到主動(dòng)脈，這是此步驟的要點(diǎn)?？捎脺厣睇}水將胸腔內(nèi)的血液沖洗干凈，用眼科鑷子輕輕心外膜（夾的越少越好，以免影響取材）將心臟向左上方提起，即可看清主動(dòng)脈，又可使灌注針很容易地主動(dòng)脈內(nèi)。時(shí)動(dòng)作要慢，針尖方向不要偏向右側(cè)，以免刺入右心房，如果感到有阻力，則將針退后、調(diào)整方向重新進(jìn)針，直到進(jìn)入主動(dòng)脈，灌注針進(jìn)入主動(dòng)脈后可在心臟的上方看到其位置，灌注針進(jìn)入主動(dòng)脈的長(zhǎng)度最好為3-5毫米。網(wǎng)上有很多方法學(xué)在此推薦給大家：JournalofVisualizedNatureProtocols 脫水、石蠟包埋和制片脫水是指使用脫水劑置換組織中的水分使標(biāo)本內(nèi)處于無(wú)水狀態(tài)，具體是用梯度乙醇(由低到高)充分脫水，對(duì)于一些易脆的組織（如脾、肝臟等）應(yīng)減少高濃度里的停留時(shí)間，透明的時(shí)間也應(yīng)該控制縮短。對(duì)組織浸蠟時(shí)，一般選用56℃-58℃的石蠟，石蠟液與標(biāo)本的比例應(yīng)該為（20-30）：1，浸蠟溫度最好不超過(guò)60℃，防止抗原的損失。包埋是指將已石蠟的組織塊置入包埋模具內(nèi)，包埋應(yīng)選好角度動(dòng)作迅速，以便切片時(shí)有完整的切面。切片時(shí)則要該快則快該慢則慢，及時(shí)檢查刀片是否出現(xiàn)缺口，最好使用新刀片以防止蠟帶出現(xiàn)劃痕。包埋后需要快速冷卻，使標(biāo)本與石蠟在短時(shí)間內(nèi)凝聚成密度一致的一個(gè)整體。脫蠟和水化切片分別在二甲苯中10-15分鐘以脫掉組織中的石蠟，使組織恢復(fù)到固定后的正常狀態(tài)出抗原以方便與一抗結(jié)合。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景。脫蠟的效果主要是取決于切片的厚度、二甲苯的溫度、脫蠟時(shí)間，或移入恒溫箱加熱脫蠟。水化的目的是為了洗去溶解的石蠟和二甲苯。二甲苯屬于非水溶液的有機(jī)溶劑，進(jìn)入組織中的二甲苯不能與水溶性染色液相溶，需要通過(guò)梯度乙醇把組織中的二甲苯逐步替換出來(lái)，使標(biāo)本切片從無(wú)水狀態(tài)順利進(jìn)入染色液中進(jìn)行抗原修復(fù)是指抗原被封閉或隱藏的表位，恢復(fù)其原有的空間狀態(tài)，提高抗原陽(yáng)性檢出率的過(guò)程。由于組織在或多聚固定過(guò)程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新，提高抗原檢測(cè)率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓加熱修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。其中高壓加熱修復(fù)這一方法簡(jiǎn)便易操作，效果也更好。胰酶消化修復(fù)法主要用于細(xì)胞內(nèi)的抗原修復(fù)。使用0.1%氯化鈣（pH7.6）制成0.05%-0.1%胰酶液，37℃孵育切片15-30分鐘，陳片應(yīng)當(dāng)適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。使用高壓加熱修復(fù)對(duì)于修復(fù)溫度（92-98℃以上）和時(shí)間的把握十分重要，溫度越高修復(fù)時(shí)間越短，溫度與修復(fù)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。修復(fù)結(jié)束后注意室溫冷卻，讓蛋白自然復(fù)性。其次，盡量使用過(guò)量的抗原修復(fù)液，防止高溫液體揮發(fā)干涸，對(duì)切片造成不可逆的損傷。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在傳統(tǒng)的親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（ABC法）和鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶法（SP法）中，免疫組化反應(yīng)容易受到內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素的干擾，必須用過(guò)氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活和封閉。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶一般用3%過(guò)氧化氫滅活約10分鐘左右，用甲醇配制過(guò)氧化氫更適合于保封閉與免疫熒光技術(shù)一樣，使用10%與第二抗體同種屬都的正常進(jìn)行封閉，目的為了防止一抗與組織的非特異性結(jié)合，造成假陽(yáng)性。一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間不同的一抗?jié)舛雀鶕?jù)抗體說(shuō)明書(shū)而定，孵育時(shí)間和溫度等對(duì)染色結(jié)果往往有著較大的影響。在4℃下，反應(yīng)緩慢，背景較淺，推薦使用。二抗一般室溫孵育30分鐘。如何選擇一抗呢？在此給大家推薦一個(gè)好的人類(lèi)蛋白圖譜（TheHumanproteinatlas,HPA），為。界面如下：TheHumanproteinatlas數(shù)據(jù)庫(kù)免費(fèi)提供全部24,000種人類(lèi)蛋白質(zhì)的組織和細(xì)胞分布信息，快來(lái)看看你要研究的蛋白在哪個(gè)富集，在哪個(gè)細(xì)胞定實(shí)驗(yàn)難做很大程度上是總找不到好用的抗體，文獻(xiàn)用得很好的經(jīng)典抗體如給大家介紹一個(gè)好用的抗體查找 為什么要推薦使用CiteAb尋找抗體或者試劑呢？CiteAb擁有全球最大的試劑和引文數(shù)據(jù)庫(kù)，可從181多家供應(yīng)商中搜索4014509萬(wàn)種抗體；其次CiteAb按照引文數(shù)量（高達(dá)1464705）對(duì)試劑進(jìn)行方便我們查找最優(yōu)抗體；CiteAb不僅可以查詢(xún)抗體也可以查找化學(xué)試劑；CiteAb列出了抗體對(duì)應(yīng)的文獻(xiàn)，方便我們根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。舉個(gè)例子，搜索Iba1（中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物關(guān)于Iba1可以查找到高達(dá)525在眾多產(chǎn)品中如何找到最適合自己的那一款？CiteAb可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行CiteAb根據(jù)引文數(shù)量對(duì)抗體進(jìn)行了排序，Abcam的Iba1抗體引文高286，其次是Proteintech點(diǎn)擊可查看使用該抗體的文獻(xiàn)希望CiteAb會(huì)成為我們的科研小助手切片PBS洗滌是為了去除未反應(yīng)的抗體和其他雜物，以減少非特異性反應(yīng)引起的背景和雜物污染，因此應(yīng)該充分洗滌，特別是一抗孵育后。一般使用PBS洗滌3次，每次5分鐘。DAB顯色DAB顯色液（3,3‘-二氨基聯(lián)苯胺）終產(chǎn)物為棕黃色或棕褐色，為免疫組化最常見(jiàn)的的顯色液。DAB顯色的棕黃原穩(wěn)定性好，不溶于，可長(zhǎng)期保存而不褪色。背景的深淺和特異性染色的深淺都可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而背景較淺時(shí)即可沖洗。DAB顯色時(shí)間很短(如幾秒或幾十秒)就立即出現(xiàn)很深的棕褐色，這可能說(shuō)明一抗?jié)舛冗^(guò)高，需要適當(dāng)下調(diào)抗體濃度；若很短時(shí)間就出現(xiàn)深背景，有可能非特異性蛋白封閉不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)(如超過(guò)10分鐘)才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，可能是一抗體濃度過(guò)低或者封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。貼片后梯度脫水透明中性樹(shù)脂封片后拍片即可。免疫組化分析常用的圖像可對(duì)組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果結(jié)果進(jìn)行定量分析。常用的圖像有OSIRIS/GSAImageyser、Imagej、ImageProPlus（IPP）等。Imagej是NIH開(kāi)發(fā)的一款在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用十分廣泛的費(fèi)軟件，地址 。該軟件的顯著優(yōu)勢(shì)是開(kāi)源免費(fèi)，不受電腦系統(tǒng)（官網(wǎng)提供適用不同操作系統(tǒng)的版本）的限制且功能強(qiáng)大。給大家一個(gè)基于Imaegj的免疫組化分析：IHCProfiler。 插件免費(fèi)地址：IHCProfiler由文獻(xiàn)可知，胞漿的IHC讀入后可快速得到自動(dòng)評(píng)分結(jié)果對(duì)于細(xì)胞核的IHC計(jì)算ScoreScore有四個(gè)等級(jí)，分別為4/3/2/1，HighPositve為4分，Positive為3LowPositive2分，negative1分。軟件如下：1、打開(kāi)ImagejFile，Open，打開(kāi)胞漿的2、點(diǎn)擊Plugins，點(diǎn)擊IHCProfiler詢(xún)問(wèn)是否是胞漿，下拉可選擇核，此處選擇胞漿，點(diǎn)擊OK，進(jìn)入以下界面，選擇HDAB點(diǎn)擊OK。得到結(jié)果為High而對(duì)于胞核，操作略微不同1、打開(kāi)Imagej軟件，打開(kāi)胞 2、點(diǎn)擊Plugins，點(diǎn)擊IHCProfiler，進(jìn)入以下界面，選擇胞核同上選擇HDAB調(diào)節(jié)Threshold閾值選中所有核，點(diǎn)擊Plugins，選擇IHCProfilerMacro，免疫組化（IHC）全攻略（含對(duì)于實(shí)驗(yàn)狗而言，實(shí)驗(yàn)是專(zhuān)業(yè)進(jìn)階的，刷實(shí)驗(yàn)?zāi)鞘潜貍浼寄?。在科研大世界中，?shí)驗(yàn)方法總是層出不窮，而免疫組化（IHC）作為經(jīng)典中的經(jīng)典，自然是實(shí)驗(yàn)狗必備的技能之一。現(xiàn)在，小魚(yú)就把IHC的全攻略給大家。IHC的“基石”：原理及步驟師兄們，做實(shí)驗(yàn)時(shí)最基礎(chǔ)的就是深刻的銘記原理，如此在實(shí)驗(yàn)的階段才能真正做到胸有成竹。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，免疫組化就是一項(xiàng)利用抗原抗體反應(yīng)來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原和對(duì)蛋白定位、定性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。各位小伙伴們可以通過(guò)下面的對(duì)免疫組化有個(gè)大致的了解。接下來(lái)，重點(diǎn)來(lái)了，下面是小魚(yú)多年總結(jié)的免疫組化步驟和經(jīng)驗(yàn)，各位看官千萬(wàn)不要錯(cuò)過(guò)哦！免疫組化的標(biāo)本主要是組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類(lèi)。組織標(biāo)本中包括石蠟切（標(biāo)本制作的首選方法和冰凍切片。一般而言，石蠟切片要求薄厚均勻，切片完整，且無(wú)褶無(wú)刀痕，相當(dāng)考驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的刀工，在此小魚(yú)真心建議大家找專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)過(guò)的或公司進(jìn)行切片。當(dāng)然，你也可以在解螺旋里回復(fù)切片‖，石蠟切片的煉成方法。1）脫蠟與水化：將石蠟切片放置于60°烤箱烤片30-60min，這一步是為了使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化，好讓組織切片牢固地貼在玻片上。而后依次將其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接對(duì)著切片沖洗）。PBS洗3次，3min/次。）（40mlPBS+120ulTritonX-100+400ul30%H2O2）浸潤(rùn)切片30min（RT避光），降低內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS洗3次，3min/次。3）抗原修復(fù)：由于制作石蠟切片時(shí)，固定使得蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用從而失去抗原性，這一步就是讓胞內(nèi)的抗原決定簇重新滿(mǎn)血‖。小魚(yú)常用的是微波修復(fù)，pH6.0的0.01M檸檬酸鈉緩沖液浸泡切片，在微波爐里高火4min至沸騰后，取出自然冷卻至室溫，重復(fù)2次，每次補(bǔ)足液體以免干片。（當(dāng)然有的朋友用酶修復(fù)法也是可以的）。PBS3次，3min/4）封閉：用與二抗同一來(lái)源的封閉一些非特異性結(jié)合位點(diǎn)。此時(shí)可用‖的油性筆圍繞組織畫(huà)圈，并對(duì)圈內(nèi)的組織滴加稀釋好的，37℃溫箱中30min,用濾紙吸去多余的。孵育一抗：對(duì)圈內(nèi)的組織（面積為1×1）滴加稀釋好的一抗20ul，4℃過(guò)夜或者37℃1-2h。PBS3次，3min/次。（一般4℃過(guò)夜后，需要將切片放置37℃復(fù)溫45min，防止脫片以及可使抗原抗體結(jié)合的更穩(wěn)定）孵育二抗：對(duì)圈內(nèi)的組織（1120ul371-2h，PBS洗3次，3min/次。切片顯色：用DAB-H2O2顯色10min，顯色液最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，此時(shí)要通過(guò)顯微鏡觀(guān)察染色是否明顯，10min內(nèi)即可用蒸餾水終止顯色。復(fù)染及封片：為了形成細(xì)胞輪廓，更好的定位目標(biāo)蛋白，可用Mayer蘇木素染色30s，水洗，鹽酸分化2s，流水浸入15min。脫水時(shí)，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）2min。二甲苯5min使切片透明化，最后加入中性樹(shù)膠封片（一般封片后最好立即拍照，若不拍照，可用指甲油封固并保持好避光和濕度）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析至此，我們才千辛萬(wàn)苦地染出了一張張漂亮的免疫組化片子，可是如果不知道如何對(duì)片子進(jìn)行正確地分析，進(jìn)而得出理想的結(jié)果，也實(shí)在是一件憾事。為了幫大家分憂(yōu)解難，在此，小魚(yú)將免疫組化結(jié)果分析的獨(dú)門(mén)絕招獻(xiàn)上，請(qǐng)大家不要眨眼嘍。必設(shè)對(duì)照組。如、陽(yáng)性及自身對(duì)照由表中可知，只有6、7實(shí)驗(yàn)結(jié)果有意義。1-5均因?qū)φ战M的結(jié)果已否定抗體的特異性或因ICH技術(shù)操作存在錯(cuò)誤等而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果失去意義，則必須重復(fù)抗原表達(dá)必須在特定部位，如LCA應(yīng)定位于細(xì)胞膜上，CK應(yīng)定位于細(xì)胞漿內(nèi)，PCNA及P53蛋白應(yīng)定位于細(xì)胞核內(nèi)等等。半定量?，F(xiàn)在一般用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量。但如果你的里不幸沒(méi)有那么高大上的儀器的話(huà)，就只好趕鴨子上架，用肉眼定一下量了。由于人為性較強(qiáng)，故稱(chēng)為半定量。免疫組化的半定量一般分為三級(jí)：弱（+），中（++），強(qiáng)（+++）。以綠色免疫熒光為例，則表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱（+）=1，中（++）=2，強(qiáng)（+++）=3。至少隨機(jī)觀(guān)察5-10個(gè)HPF。然后根據(jù)（+）%x1+（++）%x2+（+++）%x3計(jì)算出數(shù)值；總數(shù)值<1.0者為（+），1.0-1.5者為(++),>1.5者為(+++)圖像分析儀進(jìn)行精確定量。在此強(qiáng)烈推薦一款圖像：ImageJ。舉個(gè)栗子，我們有一張細(xì)胞的免疫熒光染色的。那么，如何用Image首先，要把彩色的圖像轉(zhuǎn)換成黑白圖像。步驟如下：Image→Type→16-bit。轉(zhuǎn)換成黑白圖像后，將要計(jì)數(shù)的部分用高亮標(biāo)示出來(lái)。步驟如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖動(dòng)鼠標(biāo)，直到所有的細(xì)胞被標(biāo)示出來(lái)。有時(shí)候2個(gè)細(xì)胞靠得比較緊密，會(huì)被計(jì)數(shù)為1個(gè)細(xì)胞。這個(gè)時(shí)候可以采用ImageJ的水洗功能。步驟如下：Image→Binary→Watershed。如下圖的藍(lán)色箭頭所示，這些是本來(lái)計(jì)數(shù)成一個(gè)的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)水洗之后，更加精確地被計(jì)數(shù)成了2個(gè)細(xì)胞。 yzeParticles。在得出最后的結(jié)果之前，還有一些選項(xiàng)需要選擇。如果想要計(jì)數(shù)全部的細(xì)胞，那么Size項(xiàng)里面選擇―-0infinity‖。Circularity的默認(rèn)值為0.001.00‖。一般就取默認(rèn)值。最后的結(jié)果如下圖所示。軟件自動(dòng)測(cè)量了每個(gè)細(xì)胞的大小。這里因?yàn)槭嵌S圖像，所以就是每個(gè)細(xì)胞的面積。然后計(jì)數(shù)了一共有72個(gè)細(xì)胞，總面積為21286.00，平均大小為295.64。IHC獲得漂亮的可以見(jiàn)的免疫組化。那么在進(jìn)行免疫組化的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，到底有哪些靜待實(shí)驗(yàn)新手跳進(jìn)去的陷阱呢？一般而言，免疫組化的染色失敗時(shí)，無(wú)非會(huì)出現(xiàn)以下4種情況：1）所染的全部切片均為，包括陽(yáng)性對(duì)照在內(nèi)。2）所有的切片均呈陽(yáng)性反應(yīng)。3）所有切片背景過(guò)深。4）陽(yáng)性對(duì)照染色良好，檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本呈反應(yīng)。另外，小魚(yú)也總結(jié)出了做免疫組化會(huì)產(chǎn)生非特異性染色結(jié)果的8個(gè)大坑及避抗體問(wèn)題，別嫌貴，一分價(jià)錢(qián)一分貨！一抗用多克隆抗體容易出現(xiàn)非特異性染色，建議用高純度，高效價(jià)，特異性高的單克隆抗體來(lái)解決。單克隆抗體很貴，不過(guò)結(jié)果真的很好。畢竟一分價(jià)抗過(guò)期也會(huì)造成悲劇，因而要注意抗體的有效期。抗體濃度過(guò)高/當(dāng)一抗?jié)舛忍邥r(shí)，可通過(guò)做預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)摸索出抗體最理想的工作濃度，不能簡(jiǎn)單地按照說(shuō)明書(shū)來(lái)用。若是抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可在加上抗體后，立刻調(diào)好定時(shí)器，提醒自己及時(shí)終止反應(yīng)，就會(huì)避免這個(gè)問(wèn)題。DAB染色時(shí)間太長(zhǎng)/DAB的顯色時(shí)間不是一成不變的，主要靠實(shí)驗(yàn)者在顯微鏡下盯著，一旦出現(xiàn)淺淺的棕色的時(shí)候，就要馬上沖洗。出現(xiàn)棕色的時(shí)間過(guò)短，表明抗體濃度過(guò)高；出現(xiàn)棕色的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，表明抗體濃度過(guò)低。DAB要保存于避光干燥的地方，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前才加入H2O2。圖1就沖洗的有些晚了；圖2就是剛剛好，染色效果噠!一些內(nèi)源性酶生物素含量豐富的組織，如肝臟，腎臟，脾臟等在做免疫組化時(shí)極易產(chǎn)生非特異性染色。此時(shí)可將左旋咪唑（24mg/ml）加入底物液中，并保持PH值在7.6-8.2，即能滅活大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶；而對(duì)于酸性磷酸酶，可用50mmol/l的酒石酸來(lái)抑制；對(duì)于內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，可以用0.9%的雙氧水來(lái)滅活。對(duì)于內(nèi)源性生物素，染色前將切片浸于25μg/ml親和素溶液中15min，PBS15min后即可染色；也可以用24mg/ml的卵白素封片15min。一下子染太多片子的時(shí)候，容易出現(xiàn)這種情況。此時(shí)，要謹(jǐn)記貪多嚼不爛，一次少染幾張。另外要讓試劑充分覆蓋組織，超出組織邊緣2mm。然后用PAP筆在組織周?chē)?huà)一個(gè)圈圈（圈圈應(yīng)該距離組織邊緣3-4mm），把修復(fù)液圈在里面，可避免修復(fù)液流走。切片在緩沖液或修復(fù)液里面浸泡過(guò)夜，也會(huì)引起悲劇。這都是偷懶的做法，但是有時(shí)候也是可以偷一下懶的。只要把容器放在4°C冰箱里，過(guò)夜那就完一定要充分。PBS液一定要雙蒸水新配，用之前再次測(cè)PH值。緩沖液用0.05mol/L的Tris-HCL，0.15mol/L的NaCl即可。如果加一點(diǎn)去垢劑Tween-20就更好了。封閉問(wèn)是否選擇了正確的封閉。原則是選擇二抗動(dòng)物的非免疫，例如二抗是羊抗兔，就要選擇非免疫羊。用PS稀釋為3-10%的溶液孵育切片，37°C10-30分鐘。這里不用洗，直接甩掉即可。當(dāng)然直接用5%的脫脂奶粉也是可以的，而且效果還是不錯(cuò)的。電腦中有這兩個(gè)P就可以搞定1PPT()匯報(bào)結(jié)果時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)，這個(gè)軟件一樣可以處理WB1、將剪切好的WB到PPT中2、同時(shí)選中兩種，點(diǎn)擊組合3、點(diǎn)擊，選擇文本框，將蛋白名稱(chēng)標(biāo)注好4、再如下圖添加各自條帶所對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)分組，文本框，在文本框中輸入文字，注意文本框可自由旋轉(zhuǎn)，點(diǎn)住下圖所示的旋轉(zhuǎn)按鈕拖動(dòng)即可。567、全選之后，右鍵另存為，即可使用2第二種方法就是用PS軟件處理WB1、新建一個(gè)畫(huà)布，打開(kāi)已經(jīng)剪切好 2、將剪切好的拖曳到畫(huà)布中，這里注意要圖層才能拖曳到畫(huà)布3、這里可以發(fā)現(xiàn)，兩條條帶長(zhǎng)度不一，我們現(xiàn)在調(diào)整一下較短的條帶，選中你要調(diào)整的所在的圖層，點(diǎn)擊編輯，自由變換（Cr+）,會(huì)看到想要調(diào)整的已經(jīng)被選中。4、拖曳到合適，點(diǎn)擊對(duì)號(hào)5、點(diǎn)擊編輯>6、添加文字，注明各條目的條帶代表的蛋白和實(shí)驗(yàn)分組情況，同時(shí)可點(diǎn)擊編輯，自由變化，調(diào)整字體方向。6、大功告成，點(diǎn)擊文件>保存，這里要注意的是保存為PSD格式方便后續(xù)再修改，但是投稿給的格式，都是TIFF。注意，這里的只是對(duì)條帶結(jié)果進(jìn)行一定的美化，看上去更清楚。但也請(qǐng)僅限于此，不要對(duì)條帶進(jìn)行剪切等改變研究結(jié)果的操作，否則十分嚴(yán)重。從0開(kāi)始準(zhǔn)確又快速利用Oligo7設(shè)計(jì)引PCR只要把引物設(shè)計(jì)的好，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)直易如反掌，酸談里貓大其實(shí)已經(jīng)很詳細(xì)地講解了基于Oligo6的引物設(shè)計(jì)，我個(gè)人覺(jué)得Oligo7設(shè)計(jì)引物也不錯(cuò)，為此一下零基礎(chǔ)版的Oligo7引物設(shè)計(jì)。Oligo7軟件安為防止大家和我以前一樣在網(wǎng)上軟件，我提供一個(gè)無(wú)毒版（點(diǎn)擊閱讀原文即可）。解壓后，點(diǎn)擊開(kāi)始安裝，安裝完后，點(diǎn)擊桌面的Oligo7圖標(biāo)，彈出OLIGO7CustomerRegistration‖界面，此時(shí)你需要點(diǎn)擊安裝包內(nèi) 就會(huì)彈出Oligo7.0Keymaker‖界如圖一左，將OLIGO7CustomerRegistration‖界面上原有的Workstation數(shù)字粘貼到Oligo7.0Keymaker‖內(nèi)的Workstation，然后點(diǎn)擊GenerateAccess數(shù)字,Access數(shù)字粘貼回OLIGO7CustomerRegistration‖相應(yīng)位置，單擊ConfirmCode‖按鈕即可完成。找到目的序找到目的序列才能針對(duì)設(shè)計(jì)引物，如果有同源蛋白還需要查找目的基因CDS序列取交集。以我研究的大鼠AQP1為例，先打開(kāi)NCBI，選擇ne數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入名字Search‖彈出圖二左，點(diǎn)擊下方AQO1‖進(jìn)入新界面，下拉點(diǎn)擊右側(cè)‖RefSeqRNAs‖，如圖二右。新界面下拉，出現(xiàn)圖三左，點(diǎn)擊―CDS‖出現(xiàn)圖三右，途中棕域序列，即為我們目的的CDS序列。當(dāng)然，如果沒(méi)有同源蛋白的問(wèn)題，你可以直接所有序列進(jìn)行分析。設(shè)計(jì)引物序列打開(kāi)Origin7，點(diǎn)擊File‖下拉菜單里的NewSequence‖,將序列粘貼在窗口里如圖四，點(diǎn)擊―√‖就可以進(jìn)入分析界面。新界面里點(diǎn)擊Search‖點(diǎn)擊―forPrimers&Probes‖如圖五左上，然后界面彈出圖五右上，點(diǎn)擊Parameters‖和Ranges‖，根據(jù)反應(yīng)條件設(shè)置參數(shù)，一定要修改引物長(zhǎng)度，防止引物過(guò)短，我修改為圖四下，然后點(diǎn)擊Search‖就可以自動(dòng)得到結(jié)果Oligo7自動(dòng)給出了可能的引物對(duì)，只需要點(diǎn)擊右側(cè)框內(nèi)Score，引物按軟件認(rèn)為的優(yōu)劣進(jìn)行排序，你可以看到引物的關(guān)鍵信息，比如長(zhǎng)度，Ta值，GC分析引物并選擇選擇一條引物，點(diǎn)擊上方 yze‖，然后點(diǎn)擊―Keyinfo‖內(nèi)的SelectedPrimers‖，會(huì)彈出兩條引物的序列和其他概括信息如圖七。這里需要確保|3`△G|≤9kcal/mol，以防止在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)引起DNA聚合反滿(mǎn)足圖七后，要繼續(xù)進(jìn)行6項(xiàng)分析以確保自己的引物是最合適的，這6項(xiàng)我在圖八中已經(jīng)標(biāo)識(shí)，我接下來(lái)將結(jié)合自身經(jīng)驗(yàn)逐一細(xì)講。為了防止引物之間相互形成二聚體，我們需要點(diǎn)擊DuplexFormation‖分析ForwardPrimer‖,Reverse Primer‖，確△G≤4.5kcal/molhydrogenbonds≤3，如圖九右求穩(wěn)的話(huà)還要分析UpperOligo‖和LowerOligo‖,那樣可以上下游引物之間形成二聚②發(fā)卡結(jié)構(gòu)分析：為了發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成，需要選擇菜單內(nèi)HairpinFormation‖，分析ForwardPrimer‖,―ReversePrimer‖同①一樣要確?！鱃≤4.5kcal/mol，hydrogenbonds≤3③堿基組成Tm點(diǎn)擊圖八中的3的Composition&Tim‖分析，按規(guī)矩需要控制上下游引物GC含量在40%-60%，上下游引物GC含量也不可以差太大，但其實(shí)實(shí)際中，引物GC含量70%我也擴(kuò)成功過(guò)，上下游引物GC含量差10%也可以做，所以請(qǐng)根據(jù)自己實(shí)際情況抉擇，在Oli'go7里分析的結(jié)果給出的參數(shù)很多，你只要看我圖十左里紅圈的兩個(gè)參數(shù)即可。④錯(cuò)誤位點(diǎn)：點(diǎn)擊FalsePrimingSites‖即可以分析。個(gè)人感覺(jué)實(shí)踐中意義不大，因?yàn)橥_概率很高如圖十右，錯(cuò)誤概率即使達(dá)到130問(wèn)題也不大，所以大家這里自己抉擇吧。⑤PCR總覽如果你的引物有太明顯的問(wèn)題，在這個(gè)界面的Comments‖者更換引物。如果沒(méi)有，則會(huì)和圖十一左Comments‖內(nèi)為空白，你只需要根據(jù)這里提供的Tm值，然后減5，就是你設(shè)計(jì)的這條引物的退火溫度。⑥內(nèi)穩(wěn)定上述分析完后，點(diǎn)Internalstability‖這個(gè)選項(xiàng)，最好彈出來(lái)的曲線(xiàn)圖像如圖十二：中間高兩邊低的弧形，這樣的引物穩(wěn)定性高，成功概率更高，其實(shí)實(shí)踐中如果做不到問(wèn)題也不是很大。Oligo7設(shè)計(jì)引物經(jīng)驗(yàn)就到這里為止了，如果你覺(jué)得過(guò)程太繁瑣，也可以選擇評(píng)價(jià)并修改他人設(shè)計(jì)好的引物，這個(gè)方法以后有機(jī)會(huì)再講啦！RNA反轉(zhuǎn)錄的六大要老話(huà)說(shuō)的好，萬(wàn)事開(kāi)頭難。而這話(huà)在RT-PCR中則體現(xiàn)的淋漓盡致，其開(kāi)頭的第一步——將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，表面上看似簡(jiǎn)單，實(shí)際上則暗潮洶涌，指不定就在哪里挖個(gè)坑，就會(huì)讓斗志高昂的實(shí)驗(yàn)汪們摔的鼻青臉腫，而且還不知道是咋掉坑的。顯然，RNA的反轉(zhuǎn)錄成功，不是想有就能有。大家之所以屢敗屢戰(zhàn)、屢戰(zhàn)屢敗，就是因?yàn)楹雎粤艘韵逻@6個(gè)必備要素，不然此坑早就被填平，又何至于整日里悲催的實(shí)驗(yàn)結(jié)果唉聲嘆氣呢？RTPrimer的最佳通常RTprimer可分為三類(lèi)：oligodT，隨機(jī)引物以及特異性引物。OligodT引物之所以應(yīng)用范圍更加廣泛，是因?yàn)榭捎纱双@得mRNA的全長(zhǎng)然而如mRNA長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)4kb，或者沒(méi)有polyA（mRNArRNA就需要考慮使用隨機(jī)引物進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄。隨機(jī)引物雖能確保長(zhǎng)的5‘末端的轉(zhuǎn)錄，但并不能獲得整個(gè)全長(zhǎng)的cDNAs，且對(duì)RNA樣品質(zhì)量要求比較高，此時(shí)可用6-8個(gè)核酸聚合體來(lái)提高cDNAs的合成量。而對(duì)于真核生物的qPCR，長(zhǎng)隨機(jī)引物和Oligo-dT引物的混合物似乎能給出一個(gè)漂亮的結(jié)果。針對(duì)此類(lèi)優(yōu)化混合引物，已有兩家公司的試劑盒或可助大家：QiagenTectRev.TranscriptionKit和BioRadiScript第三個(gè)選擇就是特異性引物，僅擴(kuò)增需要的cDNA，適用于目的序列已知的情況。通常在一步RT-PCR法中可使用此類(lèi)引物，因?yàn)樵撘镆部捎米鳛镻CR中的反向引物。RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)若要獲取全長(zhǎng)RNA的反轉(zhuǎn)錄，那么RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的問(wèn)題就不可忽略，因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄酶在遇到此類(lèi)結(jié)構(gòu)后會(huì)終止反應(yīng)或從模板上脫落下來(lái)。也許你很難判斷RNA是否具有二級(jí)結(jié)構(gòu)，但如果中GC含量較高，通常意味著RNA很難被變性且不可能是單鏈，此時(shí)就需要在65℃5min對(duì)其進(jìn)行充分變性，以避免其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。另外，還有法可解決此問(wèn)題，即使用一種最適溫度高于正常標(biāo)（37℃-42℃）的逆轉(zhuǎn)錄酶。比如來(lái)自L(fǎng)ifeTechnologies的Themoscript酶就常用于具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)RNA的逆轉(zhuǎn)錄。當(dāng)然也存在一些即使在常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄溫度（37℃-42℃）的條件下，也能跨過(guò)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的高效率逆轉(zhuǎn)錄酶，即使是針對(duì)富集GC序列的RNA也能得到很好的結(jié)果，如Qiagen公司的逆轉(zhuǎn)錄酶Omniscript和Sensiscript，以TakaraBio公司的PrimeScirptRTenzyme。RNA中存在的組DNA（gDNA）污染可能是最終PCR反應(yīng)中假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)的原因，目前已存在很多方法去除gDNA，比如通過(guò)DNAase對(duì)提取的RNA進(jìn)行預(yù)處理。以上方法無(wú)可避免會(huì)造成RNA的蛋白污染，因而這里介紹一種可繞開(kāi)酶處理的方法，即針對(duì)RNA設(shè)計(jì)一種包含內(nèi)含子或內(nèi)含子-外顯子邊界的引物，如此DNA就不會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增抑或即便擴(kuò)增了其條帶大小也與cDNA不但值得注意的是，使用該方法時(shí)中要沒(méi)有假存在，假（pseudogene）是到組中剪切mRNA的DNA拷貝，否則也會(huì)產(chǎn)而對(duì)于沒(méi)有內(nèi)含子的原核RNA，gDNA的去除則更是表達(dá)準(zhǔn)確測(cè)量的一個(gè)至關(guān)重要的因素。使用DNAase處理RNA是唯一的方法，tectRev.TranscriptionKit中所包含的gDNA清除緩沖液就可在無(wú)需加熱或EDTA失活的條件下降解DNA。此外，具有g(shù)DNAEraser（TakaraBio）PrimeScriptRT試劑盒也可去除gDNA，且能在不到20分鐘之內(nèi)快速完成RNA的cDNA合成。RNA分子的完，RNA質(zhì)量對(duì)cDNA合成結(jié)果會(huì)產(chǎn)生重要的影響，而不同批次間RNA質(zhì)量差異也導(dǎo)致RT-PCR產(chǎn)生不同的結(jié)果。所以在進(jìn)行RT-PCR前，應(yīng)該檢查RNA條帶的質(zhì)量，可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。通常完整的真核RNA應(yīng)包括28S和18SRNA條帶，且較大的條帶的強(qiáng)度應(yīng)是較小條帶的兩倍左右，另外兩個(gè)條帶強(qiáng)度大致相同也是可以的。而另一種準(zhǔn)確測(cè)量RNA質(zhì)量的方法是使用AgilentBiozyer儀器，它可將RNA分子可視化并能在分析RNA完整數(shù)值（RNAIntegrityNumber，RIN后給出一個(gè)質(zhì)量的量化標(biāo)準(zhǔn)。RIN為8-10，則表示RNA質(zhì)量非常好；當(dāng)RIN值低于7，則說(shuō)明RNA可能有降解，可能會(huì)導(dǎo)致一些罕見(jiàn)信息的RNA定量除了掌握RNA的完整性之外，準(zhǔn)確評(píng)估產(chǎn)量也很重要。產(chǎn)量的準(zhǔn)確性會(huì)受到以下因素的影響：測(cè)量?jī)x器的準(zhǔn)確性、DNA的污染、鹽的污染以及降解程度。而為了準(zhǔn)確測(cè)量產(chǎn)量，小編我更喜歡使用Nanodrop進(jìn)行UV該儀器不需要稀釋樣品，并且具有非常寬的測(cè)量RNA的范圍。以小編的經(jīng)驗(yàn)，它可以準(zhǔn)確到10ng/ul。而傳統(tǒng)的紫外分光光度法應(yīng)避免使用大容量的比色皿，因?yàn)檫@需要耗費(fèi)大量的樣品。此法的缺點(diǎn)是也可在樣品中測(cè)量組DNA，如果從RNA提取過(guò)程殘留鹽或酚，則會(huì)增加吸光度，使得RNA的OD值變得更高。而解決此問(wèn)題一個(gè)方法是使用熒光，Ribogreen是一種RNA特異性染RNA產(chǎn)量?，F(xiàn)在，NanodropRibogreen兩步法或一步法RT-RT-PCR也分兩種類(lèi)型：一步法（One-stepPCR和兩步法（Two-stepsPCR具體操作見(jiàn)下圖。前者，RT反應(yīng)和PCR擴(kuò)增是在同一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行的；而后者，RT反應(yīng)與PCR擴(kuò)增反應(yīng)單獨(dú)進(jìn)行。盡管這兩種方法都能得到最終的結(jié)果，但是每種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)。選擇哪種方法取決于各種因素。如下總結(jié)它們的優(yōu)缺點(diǎn)。一步-PCR消除了樣品轉(zhuǎn)移步驟，不僅消除了控制物污染的潛在來(lái)源，而且需要較少的準(zhǔn)備和操作時(shí)間。又因一步R-PCR中所使用的引物是基因特異性的，靈敏度高，常用于分析低表達(dá)水平。而其不足在于同一樣本中只有有限數(shù)量的目的被擴(kuò)增，且需要在轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增間尋找一個(gè)平衡。所以當(dāng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)很重要時(shí)，一般采用一步法，如檢測(cè)RNA，也適用于高通量分析。由于該法的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率高，因而在需要測(cè)量表達(dá)水平上的細(xì)微差異時(shí)，也可采用此方法。而兩步RT-PCR可將大批量的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后cDNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可檢測(cè)大量；在分別優(yōu)化RT和PCR步驟后，可更好地控制實(shí)驗(yàn)過(guò)程；又因量的轉(zhuǎn)錄本被用于PCR，則任何可能從RNA分離到RT反應(yīng)的抑制劑（如乙醇、酚及胍鹽等）都被稀釋了。RT-PCR更耗費(fèi)時(shí)間，且?guī)?lái)污染的可能性更高；RT過(guò)程應(yīng)以相同效率反轉(zhuǎn)錄RNA，否則會(huì)影響qPCR的啟動(dòng)效率，進(jìn)而帶來(lái)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此對(duì)于每個(gè)RT反應(yīng)應(yīng)使用相同的條件。如果你需要對(duì)同一樣本的多個(gè)目標(biāo)進(jìn)行分析時(shí)，可選擇兩步RT-PCR。另外，當(dāng)RNA的是個(gè)問(wèn)題時(shí),最好是進(jìn)行兩步RT-PCR，因?yàn)閏DNA-20數(shù)學(xué)不好的人是怎么做qPCR的？實(shí)定量實(shí)時(shí)聚吅酶鏈反應(yīng)（qPCR）廣泛用于特異性核酸的檢測(cè)，RNA轉(zhuǎn)錄物豐度的測(cè)量和高通量實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證。qPCR通常在標(biāo)96孔板上進(jìn)行，現(xiàn)在里的qPCR就像移液器和燒杯那樣常見(jiàn)。qPCR的基本步在引物設(shè)計(jì)和功能分析方面，NCBI里的數(shù)據(jù)已經(jīng)很多了。但這些數(shù)據(jù)只是理論上的，在具體實(shí)驗(yàn)操作中還要經(jīng)過(guò)各種復(fù)雜的計(jì)算和實(shí)驗(yàn)。在以前的qPCR中，為了使測(cè)定正常進(jìn)行，通常需要進(jìn)行大量耗時(shí)的反復(fù)試驗(yàn)。而現(xiàn)在，這些步驟都可以通過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)完成。更方便的是，已經(jīng)有人把qPCR實(shí)驗(yàn)中所用到的各種工具都整吅到了一個(gè)工具箱里。比如，Biosearch(http://w /oligo-toolbox)這個(gè)里，就有一個(gè)成套的qPCR工具箱OligoToolbox，其中包含的工具能做很多實(shí)驗(yàn)計(jì)算工作。OligoToolboxOligoSpec?OligoSpec?Calculator可以確定引物或探針的特定物理性質(zhì)，比如可能擁有的5'，3'或修飾，甚至還有熒光團(tuán)、黑洞淬滅基團(tuán)標(biāo)記、生物素或修飾堿基。如果科研知道序列但是不知道分子量（MW），這個(gè)計(jì)算器也能派上用場(chǎng)，它還能把單位仍克‖換算成摩爾‖。此外，該工具還提供了260nm處寡聚物的消光系數(shù)，可與濃度計(jì)算器一起定量濃度。qPCRReaction這個(gè)qPCR反應(yīng)估計(jì)器可以用于計(jì)算小瓶引物或探針實(shí)際上會(huì)持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間。當(dāng)然……是理論上，也可以來(lái)預(yù)估引物的數(shù)量。輸入一些關(guān)于反應(yīng)條件的基本信息，以找出寡核苷酸可能執(zhí)行的反應(yīng)過(guò)一些液體會(huì)因?yàn)橐埔憾鴣G失，所以實(shí)際的反應(yīng)次數(shù)會(huì)少于預(yù)估值。OligoResuspension這個(gè)有用的小工具能用來(lái)計(jì)算水或TE緩沖液的確切體積來(lái)重懸浮新加入的寡核苷酸。一些寡核苷酸廠(chǎng)家提供的說(shuō)明書(shū)里只會(huì)教你怎么在干粉引物里加稀釋劑100μM的濃度。但缺點(diǎn)也很明顯，限制太大了，如果要準(zhǔn)備不同濃度引物，那就需要這個(gè)計(jì)算器來(lái)幫你。由于多次凍融循環(huán)會(huì)促進(jìn)寡聚體降解，因此可以考慮將您的寡核苷酸分裝成一系列工作濃度的等分試樣。OligoDilution類(lèi)似上面的工具，也是一個(gè)非常簡(jiǎn)單明了的計(jì)算器。對(duì)于數(shù)學(xué)苦手來(lái)說(shuō)，qPCR中的那些多任務(wù)計(jì)算實(shí)在是有心無(wú)力，有了這個(gè)后日子就好過(guò)多了。只要輸入寡核苷酸的濃度、所需的最終濃度和體積ta-da，它就能算出所需稀釋劑的體積。稀釋計(jì)算器還有一個(gè)有用的功能是貼心的提供了不同的單位，再也不用擔(dān)心單位仍皮摩爾轉(zhuǎn)換到微摩爾的時(shí)候點(diǎn)錯(cuò)小數(shù)點(diǎn)了。Concentration引物濃度很重要，但對(duì)于一管子未知的引物，要計(jì)算濃度可不這么簡(jiǎn)單。這個(gè)工具能在輸入260nm的光密度（在用分光光度計(jì)測(cè)量或OligoSpec?Calculator算出的消光系數(shù)，就能算出引物濃度，這是基于每個(gè)修改和基礎(chǔ)綜吅值的估計(jì)。260（ε260）用公式也能求，就是比較煩ε260所有堿基的ε260之和)+(所有修飾ε260)]x0.9ε260值M-1?cm-1為單位。其中，dA(ε260=15,200)，dC(ε260=7,050)，dG(ε260=12,010)，T(ε260=8400)。多重qPCR的光譜這個(gè)工具可以說(shuō)OligoToolbox里最大的特色。這對(duì)于設(shè)計(jì)qPCR實(shí)驗(yàn)特別有用，其需要用特定熒光（標(biāo)記的多個(gè)探針來(lái)檢測(cè)多個(gè)qPCR產(chǎn)物。基本上，不同熒光團(tuán)不能在相同的波長(zhǎng)下發(fā)射激發(fā)。該光譜疊加工具顯示每種可用熒光團(tuán)和淬滅劑的吸收和發(fā)射光譜，允許用戶(hù)識(shí)別任何。該工具還考慮了與正在使用的qPCR系統(tǒng)（涵蓋大多數(shù)制造商）的兼容性，因此可以為儀器找到最佳的熒光團(tuán)和淬滅劑組。除了工具箱之外，在這個(gè)上，還能找到其他qPCR設(shè)計(jì)軟件和一系列不斷更新的資源，包括參考以及所有與qPCR相關(guān)的和，安利一個(gè)。如何擬合Elisa標(biāo)準(zhǔn)曲酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(EIS)可用于檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中。今天和大家使用gnpo2018學(xué)習(xí)版以及ELACac軟件對(duì)Esa標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行四參數(shù)擬吅。下圖是標(biāo)準(zhǔn)品濃度（pg/ml）和酶標(biāo)儀測(cè)得的對(duì)應(yīng)OD值Origin軟件繪制Elisa標(biāo)準(zhǔn)曲Step1：打開(kāi)Originpro2018學(xué)習(xí)版（Origin其他版本均可），輸入數(shù)據(jù)，X軸為濃度C，Y軸為OD值：Step2：選中X,Y點(diǎn)擊Plot，選擇2D，Scatter，選擇得到標(biāo)準(zhǔn)的基本圖Step3：進(jìn)行Logistic曲線(xiàn)四參數(shù)擬吅。點(diǎn)擊 CurveFit,OpenDialog…進(jìn)選擇Setting下選擇FindXY，由此根據(jù)測(cè)得待測(cè)樣OD值計(jì)算待測(cè)樣品的度。選擇FindXfromYOD值計(jì)算濃點(diǎn)擊Fit，得到擬吅曲線(xiàn)以及擬Step4：根據(jù)待測(cè)樣品的OD計(jì)算濃度。在Book1下可以看見(jiàn)FitNLCurve，Yvalue（OD值）即可算出XValueELISACalc繪制Elisa標(biāo)準(zhǔn)曲Step1：打開(kāi)軟件，輸Step2：回歸/擬吅模型（M），下拉選擇Logistic曲線(xiàn)擬2（四參數(shù)點(diǎn)擊回歸擬點(diǎn)擊回歸方程，可以得到擬吅方程以及R2點(diǎn) 可以由待測(cè)樣品的OD值得到待測(cè)樣品的濃度兩種方法均可以方便快捷的得到擬吅的標(biāo)曲并計(jì)算待測(cè)樣品的濃度，希望對(duì)大引物設(shè)計(jì)軟件哪家強(qiáng)？快速獲取有門(mén)提及PCR，這可是里的老朊友了。作為科研升級(jí)打怪上的第一道最基本關(guān)卡，初踏進(jìn)科研界的實(shí)驗(yàn)狗們，又有哪個(gè)沒(méi)有與之打過(guò)交道？可饒是如此，不少菜鳥(niǎo)在闖關(guān)時(shí)仌會(huì)被摔的鼻青臉腫，原因無(wú)他，引物設(shè)計(jì)不好之過(guò)矣。顯然，欲過(guò)此關(guān)，則必先通過(guò)引物設(shè)計(jì)的試煉。好在網(wǎng)上流傳著各類(lèi)PCR物設(shè)計(jì)軟件，各顯神通后可快速為大家設(shè)計(jì)出最佳引物，以助大家而本文也搜集一籮筐各具特點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)軟件，大家按自己的需要進(jìn)行選擇即經(jīng)是由的公司開(kāi)發(fā)的專(zhuān)業(yè)用于PCR或引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)和評(píng)估的軟應(yīng)該是使用范圍最廣的一款軟件了。主要界面有序列編輯窗口（Gene），引物設(shè)計(jì)窗口（PrimerDesign），酶切分析窗口（RestrictionSites）和Motif 軟件的主要功能分四種，即引物設(shè)計(jì)、限制性?xún)?nèi)切酶DNA基元(motif)查找和同源性分析功能。前三種為此外，該軟件還有一些特殊功能，其中最重要的是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，另外還有序列"朗讀"、DNA與蛋白序列的互換、語(yǔ)音提示鍵盤(pán)輸入等等。（文章：Primer6安裝、、引物設(shè)計(jì)攻略）該軟件主要應(yīng)用于核酸序列引物分析設(shè)計(jì)，同時(shí)計(jì)算核酸序列的雜交溫度（Tm）和理論預(yù)列。作為目前最好、最專(zhuān)業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件，Oligo的功能很強(qiáng)，其主要功能包括：普通引物對(duì)的搜索、引物的設(shè)計(jì)、雜交探針的設(shè)計(jì)以及評(píng)估引物對(duì)質(zhì)量等等。它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至于能風(fēng)靡全世界。（文章：干貨|Oligo設(shè)計(jì)引物，就是這么簡(jiǎn)單）BeaconBeaconDesigner是一款功能強(qiáng)大且簡(jiǎn)單易用的Real-timePCR引物設(shè)計(jì)的必備。它可在目的的任意位置中定位引物，比如跨內(nèi)顯子-內(nèi)顯子或外顯子-外顯子設(shè)計(jì)引物，適用于SYBRGreen試驗(yàn)設(shè)計(jì)。此外，它可用于HRMA試驗(yàn)設(shè)計(jì)、雙探針設(shè)計(jì)（如TaqMan?探針、分子信標(biāo)、Scorpions引物和探針、FRET探針）?？頝CBIPrimer-通常用另一個(gè)站點(diǎn)或工具設(shè)計(jì)好引物后，還BLAST進(jìn)行引物特異性驗(yàn)證。但這個(gè)工具整吅了目前流行的Primer3軟件，同時(shí)也能通過(guò)NCBI的Blast進(jìn)行引物特異性的驗(yàn)證，比較快捷方便。且該工具還可針對(duì)某一特定剪接變異體來(lái)設(shè)計(jì)引物——這是用來(lái)衡量基因在特定組織中特異性表達(dá)的重要特征。此外，Primer-BLAST有許多改進(jìn)的功能，比單個(gè)的用Primer3和NCBIBLAST更加準(zhǔn)確。Primer-Blast的界面包括4個(gè)部分：PCRTemplate（模板區(qū)），Primer（引物區(qū)），Exon/intronSelection（外顯子內(nèi)含子設(shè)置）specificitycheck（特異性驗(yàn)證區(qū)）。：或者直接 主（）上找到Primer3Primer3是一個(gè)非常簡(jiǎn)單卻高效的引物設(shè)計(jì)軟件。你只需在目標(biāo)序列中粘貼DNA序列后點(diǎn)擊搜索即可。其中，可通過(guò)多種方式來(lái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行篩選，包括PCR產(chǎn)物的大小、引物大小、Tm范圍和其他參數(shù)。同樣，還可使用Primer3來(lái)設(shè)計(jì)用于PCR-ELISA的雜交探針和其他基于探針的PCR引物設(shè)計(jì)。另外，嚴(yán)qPCR引物設(shè)計(jì)一般要求其中一條引物要跨外顯子，最好在3?設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物的長(zhǎng)度在300bp以?xún)?nèi)等。本軟件可滿(mǎn)足qPCR引物設(shè)計(jì)的 BathPrimer3.0是由加州大學(xué)戴維斯分校的研究設(shè)計(jì)的一個(gè)基于Primer3為開(kāi)發(fā)的引物設(shè)計(jì)工具，可設(shè)計(jì)多種引物，包括通用引物，SSR引物設(shè)計(jì)和SSR檢測(cè)和SNP分型引物，以及DNA引物，當(dāng)然它最大的特點(diǎn)是可以一次設(shè)計(jì)500條序列引物，并且是和完全免費(fèi)的，而且速度也是杠杠的。：ThePCR這是基于Primer3的引物設(shè)計(jì)的四套程序，可用于設(shè)計(jì)引物（OverlapPrimers），即在一個(gè)序列中創(chuàng)建多個(gè)的PCR引物；只需要一個(gè)包含目的的GenBank文件，即可在組序列的外顯子周?chē)O(shè)計(jì)引物（GenomicPrimers）、每個(gè)SNP上設(shè)計(jì)引物（SNPPrimers）、在開(kāi)放閱讀框架上設(shè)計(jì)引物（cDNAPrimers）哈佛大學(xué)的一個(gè)qPCR引物數(shù)據(jù)庫(kù)，目前有超過(guò)20萬(wàn)條引物，涵蓋了人和小鼠大部分已知的。根據(jù)上對(duì)兩萬(wàn)多對(duì)引物的驗(yàn)證結(jié)果，引物有效率為82.7%。盡量選擇這種驗(yàn)證過(guò)的qPCR引物，qPCR品質(zhì)比較有保障。（文章鏈接：干貨|PCR引物設(shè)計(jì)，3款軟件就能搞定?。篜rimerX可用于自動(dòng)設(shè)計(jì)用于定點(diǎn)誘變的誘變PCR引物，節(jié)省時(shí)間提高效率。基于你所輸入的序列，PrimerX將模板DNA序列與已經(jīng)包含所需突變的DNA或蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較。然后通過(guò)計(jì)算編碼該突變的適當(dāng)長(zhǎng)度的所有可能的寡核苷酸序列，并遵循指定的指令來(lái)產(chǎn)生正向引物序列。最后，PrimerX產(chǎn)生相應(yīng)的反向引物序列，并計(jì)算其他必需信息，如每個(gè)引物對(duì)的解鏈溫度和GC含：特別推薦該軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增高度冗余的亞硫酸氫鹽處理的序列的引物。ePCR工具可快速檢測(cè)cDNA文庫(kù)和天然或亞硫酸氫鹽處理的組中的錯(cuò)配位點(diǎn)和替代PCR產(chǎn)物。：快速獲取通道辣么多的引物設(shè)計(jì)軟件，鬧哄哄、你方唱罷、我登場(chǎng)，倒是給人一種亂花漸迷人眼的感覺(jué)?？杉幢闳绱?，有些被繞花眼的小伙伴依然在PCR之海中浪不起來(lái)，被PCR引物地拍在岸上。而這歸根到底是因?yàn)樗麄兒雎粤艘稽c(diǎn)——無(wú)論自己設(shè)計(jì)引物還是交給公司設(shè)且任何引物設(shè)計(jì)軟件都只是依據(jù)相應(yīng)參數(shù)、算法來(lái)進(jìn)行計(jì)算、預(yù)測(cè)，因此得到的引物僅在理論上是最優(yōu)的，并不代表實(shí)際實(shí)驗(yàn)一定能出結(jié)果。因此，一對(duì)引物究竟好不好用，還是需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證的，所謂實(shí)踐是檢驗(yàn)真理的唯一標(biāo)準(zhǔn)‖。而就小編而言，私認(rèn)為獲得良好PCR引物比較科學(xué)的流圖中，獲取引物的四種方法：顏色越偏綠，實(shí)驗(yàn)成功率越高；顏色越偏紅，實(shí)驗(yàn)成功率越低，但得到引物序列的概率越高。顯然，每個(gè)小伙伴做實(shí)驗(yàn)都是依托于這個(gè)大平臺(tái)，那么很有可能你所研究的是課題組以前做過(guò)的，甚至還有可能發(fā)過(guò)的。都說(shuō)人有一張嘴，除了吃，就是說(shuō)。此時(shí)，需要引物的你大可以直接詢(xún)問(wèn)自家的師兄師姐。掌握要訣：師妹靠賣(mài)萌，師弟靠干活~另外，書(shū)中自有黃金屋，這話(huà)也是很有道理的。要研究某個(gè)，怎能不讀幾篇相關(guān)文獻(xiàn)呢？而且很有可能某篇文獻(xiàn)中就已經(jīng)提供了該的熒光定量引物，而該引物還是經(jīng)過(guò)作者驗(yàn)證和期評(píng)審機(jī)構(gòu)核實(shí)過(guò)的，八成是可以給你帶來(lái)完美的結(jié)果。如果你研究的比較小眾，茫茫文獻(xiàn)中很難釣到提供目的引物序列的文章，那就只能轉(zhuǎn)戰(zhàn)數(shù)據(jù)庫(kù)了。比如上文推薦的數(shù)據(jù)庫(kù)PrimerBank，就可以提供相關(guān)的qPCR引物。但如果上述三種方法都沒(méi)能成功，小伙伴們就不要再抱著僥幸心理了，還是老老實(shí)實(shí)設(shè)計(jì)引物吧。來(lái)個(gè)共享電子實(shí)驗(yàn)記錄本，小組一起做記錄做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候總要帶protocol然后邊看邊做？給大鼠稱(chēng)完體重也要先記在草稿紙上回去再謄抄到本子上，再謄進(jìn)電腦里？一會(huì)紙弄濕了或記得太潦草導(dǎo)致數(shù)據(jù)，就可能造成大問(wèn)題。我們講過(guò)的一個(gè)關(guān)于實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性的故事（《實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可重復(fù)？看大牛們是怎么做的》）中，來(lái)自三個(gè)不同的研究者為了為排查不可重復(fù)的原因，對(duì)每個(gè)細(xì)節(jié)都加以控制，還做了一個(gè)App，使實(shí)驗(yàn)記錄記錄，避免各種意外的差錯(cuò)。今天我們就來(lái)聊一下電子實(shí)驗(yàn)記錄的事吧。當(dāng)然不必刻意去找那三個(gè)學(xué)者為自己做的App了，因?yàn)檫@類(lèi)電子實(shí)驗(yàn)記錄（electroniclabnotebook,ELN）還蠻多的。不限于實(shí)驗(yàn)的話(huà)，什么印象筆記、有道云筆記之類(lèi)都可以的，還能延用到生活中，非常方便。我還小的時(shí)候（呃+_+）跟小伙伴兩個(gè)人做實(shí)驗(yàn)就是用印象筆記，你做的啥我做的啥，各自在上記好，同步到云端，這樣我們就知道對(duì)方干了些啥、得到哪些數(shù)據(jù)（以及闖了什么禍^(oo)^）。回去用電腦整理一下，數(shù)據(jù)拿去分析，重要步驟寫(xiě)到methods里。不過(guò)后來(lái)印象筆記的免費(fèi)版本功能限制越來(lái)越多，就棄坑了。反正和小伙伴也各奔東西了。今天來(lái)介紹一個(gè)比印象筆記更為專(zhuān)業(yè)的記錄本：及登錄官網(wǎng) 這個(gè)電腦端就在網(wǎng)頁(yè)上用。的時(shí)候會(huì)有個(gè)彈窗，問(wèn)你在哪個(gè)位置，如果在澳洲或新西蘭，則推薦選用澳洲的朋務(wù)器。一定要記住自己選了哪個(gè)朋務(wù)器，以后登錄都要在同一個(gè)朋務(wù)器登錄和小伙伴一起記錄實(shí)驗(yàn)好了，登進(jìn)來(lái)之后就可看到記錄本了。左邊導(dǎo)航欄可以新建和管理筆記本，我就隨手建個(gè)一個(gè)命名為Helixlife吧。新建的時(shí)候可以選擇幾種布局，我們就選lab建好之后，再看導(dǎo)航欄，人家把實(shí)驗(yàn)中要涉及到的方方面面都給你把大綱列好了，包括Protocol、標(biāo)準(zhǔn)操作程序（StandardOperatingProcedure,SOP）、化學(xué)品安全技術(shù)說(shuō)明書(shū)（MaterialSafetyDataSheet,MSDS）、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、組會(huì)記錄、文章框架、初稿、基金等等，不夠還可以自己加。接下來(lái)點(diǎn)進(jìn)每個(gè)文件夾New按鈕就可以添加子文件夾或筆記了。如下圖，在某文件夾下新建頁(yè)面，可選擇各種筆記類(lèi)型，PlainText就是純文本，如上方那條組會(huì)記錄‖~RichText表示多記錄，可添加表格、、、office文檔、數(shù)學(xué)公式、手寫(xiě)（sketch）等。一個(gè)頁(yè)面可以像下面這樣添加多個(gè)條目。當(dāng)然，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和組會(huì)記錄最好別在一起，我是為了省空間才貼過(guò)來(lái)……大家還是按文件夾大綱做好歸類(lèi)，因?yàn)槿思业恼Z(yǔ)就是ChanceFavorstheOrganizedLab‖~右上角這個(gè)符號(hào)是版本控制功能，點(diǎn)開(kāi)可以看到歷史修改記錄歷多終端協(xié)作嗯，說(shuō)了這么多，怎么把小伙伴忘了，不是說(shuō)要吅作的么~來(lái)吧。右上角自己賬戶(hù)名點(diǎn)開(kāi)菜單，點(diǎn)進(jìn)管理賬戶(hù)然后添加、設(shè)置權(quán)限，恢常Easy沒(méi)完，說(shuō)好了在實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊及時(shí)記錄的移動(dòng)端呢？官網(wǎng)表示支持以下兩大主流移動(dòng)端。小編木有蘋(píng)果，看下安卓是這個(gè)樣子的，一個(gè)頁(yè)面下的不同條目還會(huì)按圖標(biāo)翻頁(yè)顯示：移動(dòng)端的嘛，當(dāng)然是去各自的應(yīng)用市場(chǎng)了。蘋(píng)果就去appstore，安卓就play商店。如果你是每一次安裝play商店，好像要先安裝service，啊我不記得了，我已安裝多年。對(duì)了上play商店要科學(xué)上網(wǎng)。群體結(jié)構(gòu)三劍客— 入NatureGenetics雜志曾 了一項(xiàng)基于Structure（被 接近20000次的牛文）開(kāi)發(fā)的一種可以用于掃描大量的遺傳數(shù)據(jù)集新的機(jī)器學(xué)習(xí)算法—TeraStructure，引起了不少學(xué)者的關(guān)注。該工具可以用于推斷個(gè)人祖先的遺傳組成，識(shí)別疾病相關(guān)的遺傳突變。那么Structure又是何物呢？Structure是由斯坦福大學(xué)Pritchard開(kāi)發(fā)的一款群體結(jié)構(gòu)，通過(guò)該軟件，我們直觀(guān)了解間的分類(lèi)關(guān)系—即可以將某個(gè)群體分為若干亞群、群體間是否存在交流以及每個(gè) 程度是多少。 引自Ryck等Structure中群體的亞群數(shù)被稱(chēng)為K值。上圖中分別列出了K=2和7時(shí)的結(jié)果。圖中每一種顏色代表一個(gè)類(lèi)群，每個(gè)代表圖中的一個(gè)小柱狀堆疊圖，那么我們可以看出有些血統(tǒng)較為純正，有些則出現(xiàn)了混雜。通過(guò)顏色我們便可以對(duì)種群中的進(jìn)行不同亞群的劃分。話(huà)不多說(shuō)，接下來(lái)奉上軟件安裝包及 版本為v2.3.4，安裝包可以 索要或自行 ，地址為：。這里筆者會(huì)給出一個(gè)示例數(shù)據(jù)，萬(wàn)事俱備，打開(kāi)軟件，點(diǎn)擊建立“wpjc”，輸入項(xiàng)目的信息（注意這里數(shù)據(jù)文件要和slctdicy在一個(gè)文件夾中），點(diǎn)擊輸入信息、位點(diǎn)信息、缺失值等信息，完成數(shù)據(jù)讀入。如果數(shù)據(jù)無(wú)誤那么軟件會(huì)顯示輸入的數(shù)據(jù)，有誤則會(huì)報(bào)錯(cuò)。數(shù)據(jù)導(dǎo)入完畢后就可以設(shè)置參數(shù)了，點(diǎn)擊parameter下的new進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，lengthofburn-inperiod需要設(shè)置較大的數(shù)，這里設(shè)置為100000，保存為firsttry。接下來(lái)我們需要點(diǎn)擊project下的startajob開(kāi)始任務(wù)。這里設(shè)置K為1~9，重復(fù)次數(shù)為10次，可以看到點(diǎn)擊startjob后，project處于激活狀態(tài)，軟件此時(shí)已經(jīng)開(kāi)始運(yùn)行。運(yùn)行完畢后，會(huì)得到一個(gè)result文件夾，里面包含有90次運(yùn)行的結(jié)果，那么由于之前K取了1~9，哪一個(gè)K值是最佳的呢，這里采用Evanno等人的方法進(jìn)行分析計(jì)算 分析 。將result文件夾壓縮上傳即可一鍵分析。從而得出最佳的K值，最后將結(jié)果文件保存即可。但上述分析給出的只是最佳的亞群數(shù)與一些矩陣數(shù)據(jù)-—即每個(gè)樣本的血統(tǒng)構(gòu)成比例。要把上述數(shù)據(jù)變成漂亮的堆疊圖形的話(huà)，還有繪圖的步驟。這里需要再處理軟件CLUMPP處理得到進(jìn)一步的結(jié)果再進(jìn)行繪圖。繪圖中最簡(jiǎn)單的畫(huà)法便是使用excel將這個(gè)結(jié)果繪制為堆疊圖，或者也可以使用其他專(zhuān)門(mén)的圖形化軟件，如Distruct，這里便不一一介紹，只給出Clumpp與Distruct的 。 Real-TimePCR引物設(shè)計(jì)案例版誰(shuí)誰(shuí)引物設(shè)計(jì)道理聽(tīng)了很多，依然做丌好一個(gè)引物設(shè)計(jì)？你需要的是實(shí)戰(zhàn)演習(xí)！廢話(huà)丌多說(shuō)，案例搬上來(lái)：引物設(shè)計(jì)具體操作，以設(shè)計(jì)TP53首先在NCBI中輸入找到該的mRNA序點(diǎn)擊進(jìn)入，在右邊可看到Pick點(diǎn)擊PickPrimer，進(jìn)入引物設(shè)計(jì)界面，系統(tǒng)自動(dòng)把該的序列輸入到了里面，也可以任何想要設(shè)計(jì)引物的序列輸入到對(duì)應(yīng)的框中，設(shè)計(jì)針對(duì)該序?qū)U(kuò)增產(chǎn)物大小設(shè)置為100-點(diǎn)擊下方的Get根據(jù)引物設(shè)計(jì)的原則篩選合適的引物引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度100bp-150bp為佳；引物長(zhǎng)度17bp-25bp正向引物和反向引物的Tm值最好相差丌要超過(guò)1℃。Tm值調(diào)整至60℃-65℃引物的GC含量控制在40%-60%之間，最佳為45%-引物3'末端堿基最好為G或C或A，避免使用避開(kāi)引物或者兩條引物之間有3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列，二條引物之間的3'端避開(kāi)有2個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列；引物A、G、C、T整體分布盡量要均勻，避免使用GC或者TA含量高的區(qū)域，尤其是3'端，必須避開(kāi)GC含量丌均勻的區(qū)域；這些軟件讓單細(xì)胞分析越來(lái)越單細(xì)胞生物學(xué)成了時(shí)下熱門(mén)話(huà)題，這其中最前沿的便是單細(xì)RNA傳統(tǒng)的大量細(xì)胞（bulk）‖RNA法是一次處理成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，然后抹平它們之間的差異。但世上沒(méi)有兩個(gè)相同的細(xì)胞，而scRNA-seq可以找出造成各細(xì)胞差異的那些微妙改變。它甚至能定義全新的細(xì)胞類(lèi)型。比如說(shuō)來(lái)自博大的AvivRegev和同事們，在運(yùn)用scRNA-檢測(cè)了2400個(gè)免疫系統(tǒng)細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)一些樹(shù)突細(xì)T細(xì)A.-C.Villanietal.Science356,eaah4573;最近Regev接受了Nature的說(shuō)刺激了這些細(xì)胞則有潛力激發(fā)免疫系統(tǒng)，預(yù)防。這些發(fā)現(xiàn)是來(lái)之不易的。單個(gè)細(xì)胞比千軍萬(wàn)馬難多了，又由于每個(gè)細(xì)胞只能得到一小丟丟RNA，所以誤差必須控制得很小。還有個(gè)問(wèn)題就是處理其生成的磅礴數(shù)據(jù)——不僅僅是因?yàn)楣ぞ叻?。一個(gè)典型的RNA-seq數(shù)據(jù)的分析方法，是要辛辛苦苦在Unix操作系統(tǒng)上輸入命令行。數(shù)據(jù)文件仍一個(gè)軟件包流轉(zhuǎn)到另一個(gè)包，每個(gè)包執(zhí)行一個(gè)步驟：比對(duì)，質(zhì)控，識(shí)別變異，等等。這個(gè)過(guò)程很復(fù)雜。但要是大量細(xì)胞呢，至少每個(gè)步驟用哪種算法，以及如何運(yùn)用，都是有業(yè)內(nèi)共識(shí)的。于是就形成了流水線(xiàn)‖，哪怕不是即插即用，至少對(duì)非專(zhuān)業(yè)來(lái)說(shuō)也是溫順馴朋的。英國(guó) 的計(jì)算生物學(xué)家AaronLun說(shuō)，要分析表達(dá)的差異，大量細(xì)胞RNA-seq的問(wèn)題scRNA-seq就不是這樣，研究者們還在研究他們拿到數(shù)據(jù)后可以做些什么，但也涌現(xiàn)了一批網(wǎng)絡(luò)資源和工具，能夠使scRNA-seq的數(shù)據(jù)分析更容 的一個(gè)叫AwesomeSingleCell‖的頁(yè)面上，整理了70多種工具和資源，涵蓋分析過(guò)程的每一個(gè)步驟。大學(xué)的生物學(xué)家ColeTrapnell說(shuō)，這個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)孵化出了一個(gè)計(jì)算生物學(xué)工具的小產(chǎn)業(yè)村。單細(xì)胞分析工具的發(fā)展史夏威夷大學(xué)的生物信息學(xué)家lanaGarmire在去年的一篇綜述中列舉scRNA-seq數(shù)據(jù)分析的基本步驟和48O.B.Poirionetal.Front.Genet.7,163;她說(shuō)，雖然每個(gè)實(shí)驗(yàn)都是獨(dú)特的，但大多數(shù)分析流水線(xiàn)還是依據(jù)一樣的步驟來(lái)、篩選數(shù)據(jù)，找出是哪個(gè)轉(zhuǎn)錄本在表達(dá)，還要校正擴(kuò)增造成的差異。研究者們會(huì)繼續(xù)跑一個(gè)或多個(gè)后續(xù)分析，來(lái)檢測(cè)亞組和其他功能。威斯康星大學(xué)的生物統(tǒng)計(jì)學(xué)家ChrsnaKndorski說(shuō)，在許多情況下，大量細(xì)胞RNA-sq所用的工具對(duì)sRNA-sq也還適用。但數(shù)據(jù)上的根本差異意味著，這并不是都行得通。un說(shuō)，有一點(diǎn)值得注意，單細(xì)胞數(shù)據(jù)的噪點(diǎn)。處理這一小丟丟RNA，擴(kuò)增和捕獲時(shí)失之毫厘，便會(huì)在細(xì)胞之間謬以千里，日復(fù)一日，最后玩的就不是生物了。所以研究者們必須警惕批處理效應(yīng)‖，不是同一天處理的細(xì)胞看起來(lái)很有個(gè)性，可能只是純粹的技術(shù)原因造成的，還有那些漏網(wǎng)之魚(yú)‖——在細(xì)胞中明明表達(dá)了的，數(shù)據(jù)中卻沒(méi)有撈到。悉尼張任謙心臟的生物信息學(xué)家JoshuaHo說(shuō)，還有一個(gè)是規(guī)模。一個(gè)典型的大量細(xì)胞RNA-seq實(shí)驗(yàn)通常收納少數(shù)樣本，但scRNA-seq則一來(lái)就是好幾千。原來(lái)那些處理幾十個(gè)樣本的工具塞給它十倍百倍的數(shù)據(jù)量，處理速度就成了龜爬。哪怕是像怎么細(xì)胞才算好這樣看起來(lái)很簡(jiǎn)單的問(wèn)題，放到scRNA-seq領(lǐng)域也會(huì)變復(fù)雜。Lun的工作流程是先假設(shè)大多數(shù)細(xì)胞都有近似等量的RNA豐度。他說(shuō)可是這個(gè)假設(shè)未必就是真的。‖比如，初始T細(xì)胞，尚未被抗原激活時(shí)相對(duì)靜態(tài)mRNA相對(duì)其他免疫細(xì)胞就比較少，在分析時(shí)可能就會(huì)被移除，因?yàn)槌绦蛘J(rèn)為沒(méi)有足夠的RNA可以處理。也許最重要的一點(diǎn)是，用scRNA-seq做研究的人，問(wèn)的問(wèn)題都跟做大量細(xì)胞RNA分析的不一樣。大量細(xì)胞分析一般研究?jī)煞N或以上的干預(yù)方法中，表達(dá)有什么不同。但跟單細(xì)胞玩耍的研究者的目標(biāo)則是鑒定新的細(xì)胞類(lèi)型或狀態(tài)，或重建細(xì)胞發(fā)育通路。Lun說(shuō)因?yàn)槟繕?biāo)不一樣，則必然要用到不同的工具來(lái)分析數(shù)據(jù)。‖比如單細(xì)胞分析的一個(gè)常見(jiàn)方法就是降維處理。這是將數(shù)據(jù)簡(jiǎn)單化，以便鑒別相似的細(xì)胞。如英國(guó)的威康桑格的計(jì)算生物學(xué)家MartinHemberg所說(shuō)，在scRNA-seq數(shù)據(jù)中，每個(gè)細(xì)胞都是由2萬(wàn)個(gè)表達(dá)值組成的表單（list）。降維算法，如主成分分析（PCA）和t分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE），可以有效把數(shù)據(jù)變成二維或三維圖形，使相似細(xì)胞的聚類(lèi)特征更明顯。另一個(gè)常用的方法是偽時(shí)間分析法（pseudo-timeysis2014Trapnell開(kāi)發(fā)了第一個(gè)運(yùn)行這個(gè)算法的工具，叫Monocle。他說(shuō)這個(gè)軟件是運(yùn)用機(jī)器學(xué)習(xí)，仍一個(gè)scRNA-seq實(shí)驗(yàn)推測(cè)細(xì)胞分化過(guò)程中伴隨的有表達(dá)改變的序列，就像仍競(jìng)走比賽的航拍推測(cè)比賽路線(xiàn)。其他工具則用于檢測(cè)亞組（比如波士頓哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的PeterKharchenko開(kāi)發(fā)的Pagoda），還有空間定位，即利用組織中表達(dá)分布的數(shù)據(jù)，了解每個(gè)轉(zhuǎn)錄組都在組織的哪些地方出沒(méi)。紐約組中心的RahulSatijaRegev的博士后，他就為此開(kāi)發(fā)SeuratR語(yǔ)言包。他說(shuō)是利用數(shù)據(jù)把細(xì)胞在三中定位為一個(gè)點(diǎn)，這就是它的名字Seurat的由來(lái)，那些數(shù)據(jù)畫(huà)成的點(diǎn)看起來(lái)像一幅點(diǎn)彩派畫(huà)作。左：畫(huà)家Seurat的作品|右：RSeurat的作品（Nature2015;33,盡管這些工具都是為某個(gè)特定目的開(kāi)發(fā)的，但通常也都包含多種功能。就說(shuō)Seurat吧，除了上述的空間定位，還配備了細(xì)胞亞組分析的功能，那是Regev的組用來(lái)鑒定新的免疫細(xì)胞類(lèi)型所需要的。大多數(shù)scRNA-seq工具都是Unix程序或R語(yǔ)言包，但相對(duì)來(lái)說(shuō)還是很少有生物學(xué)家喜歡使用這些開(kāi)發(fā)環(huán)境，加州大學(xué)圣迭戈分校的生物信息學(xué)家GeneYeo說(shuō)，就算喜歡，也可能沒(méi)時(shí)間并配置好運(yùn)行所需的一切。于是有人開(kāi)發(fā)了一些開(kāi)袋即食型（原諒吃貨小編想不到更貼切的形容詞）工具。另外還有一些端對(duì)端的作圖工具，包括FlowJo的SeqGeq商業(yè)程序包，還有一組開(kāi)源的網(wǎng)頁(yè)工具：Garmire組開(kāi)發(fā)的Granatum（拉丁文：石榴還有 理工學(xué)院的生物工程師BartDeplancke的ASAP（theAutomatedSingle- ysisPipeline）ASAP和Granatum都是用網(wǎng)頁(yè)瀏覽器來(lái)呈現(xiàn)相對(duì)簡(jiǎn)單、互動(dòng)讓研究者們能用圖形方式來(lái)探索自己的數(shù)據(jù)。用戶(hù)上傳數(shù)據(jù)，軟件就依流還是ASAP畫(huà)風(fēng)最正|對(duì)ASAP來(lái)說(shuō)，就是帶著數(shù)據(jù)過(guò)一遍預(yù)處理、可視化、聚類(lèi)、差異表達(dá)分析；Granatum還包括偽時(shí)間分析，并整吅了蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)。rre和Dpnke都說(shuō)，ASAP和rnum的設(shè)計(jì)是為了讓研究者和計(jì)算生物學(xué)家能夠好好吅作。夏威夷大學(xué)的博士生、rnum的開(kāi)發(fā)組組長(zhǎng)Xunhu說(shuō)，研究者們?cè)?jīng)以為生物信息學(xué)家是有魔力的生靈，拿到數(shù)據(jù)魔杖一揮就能生成結(jié)果?，F(xiàn)在他們也可以參與進(jìn)來(lái)，調(diào)整一下參數(shù)就行，這很好。工具雖好，還要謹(jǐn)慎選擇這些工具當(dāng)然也不是各種情況下都完美。比如一個(gè)擅長(zhǎng)鑒定細(xì)胞類(lèi)型的工具，用來(lái)做偽時(shí)間分析可能就笨手笨腳。再說(shuō)了，最吅適的方法也是由每個(gè)數(shù)據(jù)集來(lái)決定的，加州大學(xué)伯克利分校的生物統(tǒng)計(jì)學(xué)家SandrineDut說(shuō)，這些方法和參數(shù)的調(diào)整要能解釋不同的變量，比如長(zhǎng)度。但英國(guó)的JohnMarioni說(shuō)，不要一切都指望流水線(xiàn)。就像導(dǎo)航讓你往河里開(kāi)車(chē)，你還真開(kāi)進(jìn)去??？‖新手尤其要謹(jǐn)慎。生物信息學(xué)工具幾乎總是能給你找到一個(gè)答案，問(wèn)題是，這個(gè)答案真的有意義嗎？Du t的建議是做些探索性分析，再核查一下你選的那個(gè)算法所基于的假設(shè)是否能說(shuō)明問(wèn)題。Satija說(shuō)，有些分析任務(wù)還是很多的，包括比較不同實(shí)驗(yàn)條件下或不同有機(jī)體之間的數(shù)據(jù)集，還有整吅不同組學(xué)的數(shù)據(jù)。他還表示，Seurat正在計(jì)劃中的更新版本就要解決第一個(gè)問(wèn)題。但現(xiàn)在也已經(jīng)有足夠多的工具讓研究者們使用了。Kendziorski建議感的人自己多多挖掘。每一個(gè)新工具都能揭開(kāi)生物學(xué)的一層面紗，只要你留意科學(xué)進(jìn)展，明辨是非。circRNA研究必備之傻瓜攻略大circRNA很紅，這個(gè)大家都知道。尤其是它身上那份高大上的神秘感，引得一眾科學(xué)家瞬間產(chǎn)生撲倒circRNA的好奇感，并期望能看到該領(lǐng)域中不一樣的風(fēng)景。但眼下circRNA研究的一個(gè)巨大就是，有關(guān)circRNA的可參考信息不多，怎么往下研究也沒(méi)有目標(biāo)。為了讓大家早日玩轉(zhuǎn)circRNA，則本文推薦六款非常Powerful的分析來(lái)助大家。circRNA基本信息分析目前，數(shù)據(jù)庫(kù)circBase（）收集包括以下6個(gè)物種的circRNA信息：人(hg19)、小鼠(mm9)、秀麗線(xiàn)蟲(chóng)(ce6)、黑腹果蠅(dm3)、矛尾魚(yú)(latCha1)、腔棘魚(yú)(latCha1)。該數(shù)據(jù)庫(kù)版本為2017年6月，可幫助大家對(duì)篩選驗(yàn)證circRNA有個(gè)具體的認(rèn)識(shí)，還可直接到相關(guān)序列信息和注釋信息，其界在主頁(yè)中間搜索框中輸入名稱(chēng)，這里以FOXO3‖為例進(jìn)行操作演示，點(diǎn)擊search‖按鈕。對(duì)照搜索結(jié)果，對(duì)circRNA信息進(jìn)行核對(duì)，下圖可以看出人的FOXO3組序列上對(duì)應(yīng)兩個(gè)circRNA，分別是 上述搜索結(jié)果表格中的藍(lán)色字體標(biāo)記的文字都包含超，可以進(jìn)一步點(diǎn)查看詳細(xì)信息。在點(diǎn)擊hsa_circ_0130221后，可跳轉(zhuǎn)其詳細(xì)點(diǎn)擊hsa_circ_0130221下行的Position，則跳轉(zhuǎn)UCSC組瀏覽器界面下圖即可形象地展示FOXO3相關(guān)circRNAhsa_circ_0130221的組信息輸出circRNA的序列時(shí)，可在搜索界面中點(diǎn)擊exportresults中的Fasta，可跳轉(zhuǎn)以下界面：在circRNAsequence中選擇spliced‖，下方選search‖后即可得到成環(huán)序列；選擇genomic‖，下方選擇Extendupstreamby1000bases‖即可得到上游延伸1