糞便中提取細(xì)菌基因組

RT-PCR定量?jī)?nèi)參照物的選擇1.B-肌動(dòng)蛋白（B-Actin）B-肌動(dòng)蛋白mRNA在許多不同類(lèi)型的細(xì)胞中呈中等豐度的表達(dá)，它編碼普遍存在的細(xì)胞中的細(xì)胞骨架蛋白。B-肌動(dòng)蛋白mRNA是第一種被用作內(nèi)參照物的RNA，雖然B-肌動(dòng)蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在一些細(xì)胞中會(huì)受到實(shí)驗(yàn)處理因素的影響發(fā)生較大變異，但它還是一種常用的RT-PCR定量?jī)?nèi)參照物。除此之外，假基因的存在會(huì)干擾結(jié)果的解釋?zhuān)瑫r(shí)用于擴(kuò)增B-肌動(dòng)蛋白mRNA的引物常也會(huì)同時(shí)擴(kuò)增DNA。2?磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）編碼GAPDH的mRNA普遍在細(xì)胞內(nèi)呈中等豐度表達(dá)，它也常被用作RT-PCR定量?jī)?nèi)參照物，因?yàn)樗谀承?shí)驗(yàn)的不同時(shí)相和在實(shí)驗(yàn)因素處理后呈穩(wěn)定表達(dá)。然而，現(xiàn)已有證據(jù)表明，GAPDH的mRNA作為定量?jī)?nèi)參照物是不合適的，在許多情況下GAPDH的mRNA的表達(dá)會(huì)發(fā)生較大變異。3.rRNArRNA占細(xì)胞總RNA的85%-90%，它是一種有用的定量?jī)?nèi)參照物，因?yàn)閞RNA的轉(zhuǎn)錄由獨(dú)特的聚合酶控制，不易受影響影響mRNA表達(dá)的一些因素的影響。但rRNA作為定量?jī)?nèi)參照物有兩個(gè)不足之處，一是不能用作提純的mRNA的定量?jī)?nèi)參照物，因?yàn)閞RNA在mRNA的純化過(guò)程中已經(jīng)丟失；二是rRNA的表達(dá)水平大大高于靶mRNA。有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在由多種刺激原激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中扮演重要角色，并介導(dǎo)了多個(gè)細(xì)胞功能上的生理病理改變。MARK家族有三個(gè)主要亞族：ERK，p38和JNK/SAPK。ERK主要由有絲分裂刺激原激活，而p38和JNK/SAPK則主要由應(yīng)激刺激原或炎癥因子所激活。Serine/ThreoninePhosphorylation

磷酸化發(fā)生于酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。這會(huì)導(dǎo)致磷酸化蛋白的功能性改變，引起酶活力、細(xì)胞內(nèi)位置及其與其他蛋白關(guān)聯(lián)的改變。絲氨酸/蘇氨酸磷酸化在多種人類(lèi)癌癥（如慢性淋巴細(xì)胞性白血病）及免疫缺陷（包括HIV）的生成和激活中起作用。絲氨酸/蘇氨酸磷酸化也是一些化療藥物的靶點(diǎn)。SynapticStructure突觸是神經(jīng)元之間在功能上發(fā)生聯(lián)系的部位，也是信息傳遞的關(guān)鍵部位。在光學(xué)顯微鏡下觀察，可以看到一個(gè)神經(jīng)元的軸突末梢經(jīng)過(guò)多次分支，最后每一小支的末端膨大呈杯狀或球狀，叫做突觸小體。這些突觸小體可以與多個(gè)神經(jīng)元的細(xì)胞體或樹(shù)突相接觸，形成突觸。

NeuroscieneeResearchSynapticStructureAMTtSODIESSyriaptcFraltsri7rjAMTtSODIESSyriaptcFraltsri7rjANTOODIES：mevptukeTransponB*s'MetjahansnraMwtICC**；((FormoreinlocmotiononalttieMilipofetxodudsforSynapticBiologyresearch,pleo&evisil.www.fni(/n?uro$ci*nc?CHEMICONnowparfofMi'liporoApoptosis細(xì)胞凋亡(apoptosis),指的是程序性細(xì)胞死亡(PCD)。相對(duì)于細(xì)胞壞死(necrosis),細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)實(shí)施的。凋亡發(fā)生是一個(gè)主動(dòng)過(guò)程，該過(guò)程的啟動(dòng)和進(jìn)行受到基因的精確調(diào)控，目前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡存在三條通路：線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，各條通路間又有crosstalking,共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

MILIIPOREApoptosisMILIIPOREApoptosisAlzheimer'sMechanisms阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是發(fā)生于老年期或老年前期的慢性進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，病理特征為以神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)、細(xì)胞外淀粉樣蛋白沉積所導(dǎo)致的老年斑及神經(jīng)元缺失.0-淀粉樣肽構(gòu)成的淀粉樣斑塊和過(guò)度或異常磷酸化的t蛋白構(gòu)成的神經(jīng)纖維病變是阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)的主要病理改變。AlzheimersMechanismsADVANCMGLIFESCIENCETOGETHER'"ADVANCMGLIFESCIENCETOGETHER'"艾德萊生物技術(shù)操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）提示：第一次使用前請(qǐng)先在15ml漂洗液WB中加入60ml無(wú)水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入！收集約200-220mg糞便到一個(gè)2ml離心管，置冰上。如果是冰凍的標(biāo)本，加入緩沖液ASL前不能解凍，否則DNA容易降解。加1.4ml緩沖液ASL，連續(xù)渦旋振蕩1分鐘或者直到完全混勻均一。注意完全渦旋混勻，否則會(huì)嚴(yán)重降低產(chǎn)量。3?將重懸物70°C溫育5分鐘。該加熱步驟可以提高3-5倍DNA產(chǎn)量，并且?guī)椭呀饧?xì)菌和寄生蟲(chóng)。對(duì)于某些難裂解的細(xì)胞（如革蘭氏陽(yáng)性菌）可以提高到95°C。4?渦旋振蕩15秒，室溫放置1分鐘。最高速離心1分鐘沉淀糞便顆粒。5?轉(zhuǎn)移900卩1上清到一個(gè)1.5ml離心管，加入100卩1雜質(zhì)清除劑AB，立刻渦旋振蕩1分鐘或者直到完全混勻均一，室溫放置1分鐘。最高速離心3分鐘去除雜質(zhì)。6?轉(zhuǎn)移所有上清到一個(gè)1.5ml離心管，最高速離心3分鐘。7?轉(zhuǎn)移210卩1上清到一個(gè)1.5ml離心管，加入20卩1蛋白酶K（20mg/ml）溶液，充分混勻，加入200卩1結(jié)合液CB,渦旋振蕩15秒，充分混勻。70C溫育10分鐘。如果產(chǎn)量偏低，可以轉(zhuǎn)移更多的上清，并且相應(yīng)的按比例提高蛋白酶K和結(jié)合液的和后面的異丙醇使用量。8?冷卻后加入100卩1異丙醇，渦旋混勻。9?將上一步所得溶液和可能出現(xiàn)的沉淀都加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。加入500卩1抑制物去除液IR，12,000rpm離心30秒，棄廢液。加入700卩1漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12,000rpm離心30秒，棄掉廢液。加入500卩1漂洗液WB，12,000rpm離心30秒，棄掉廢液。將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。取出吸附柱AC,放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100-150^1洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液可事先在65-70°C水浴中預(yù)熱），室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積，但是最小體積不應(yīng)少于50“，體積過(guò)小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。DNA可以存放在2-8C，如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在一20Co用Aidlab糞便基因組DNA提取糞便基因組DNA，然后用某腸道病原體引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。糞便中提取細(xì)菌基因組DNA1?樣品前處理：稱(chēng)取1g糞便樣品用9ml無(wú)菌PBS懸浮，劇烈震蕩15min后，200r/min離心3次，每次5min，收集上清；然后5000r/min離心3min，收集菌體沉淀，用1mlPBS懸浮沉淀，重復(fù)離心，直到上清基本清澈為止；最后再用1mlPBS懸浮收集到的沉淀，置2mlEppendorf管中-20保存?zhèn)溆谩??糞便樣品中細(xì)菌總DNA的提取：取上述處理的樣品，5000r/min離心3min,去除上清，將沉淀重懸于500ul裂解液1,劇烈渦旋混勻1min；加入100ul溶菌酶(100mg/ml)，輕輕混勻10min后，冰浴70min，每15min顛倒混勻1次；加入500ul裂解液2，輕輕混勻10min后，加入100ul10%SDS再混勻10min，裂解細(xì)胞；再加入10ul蛋白酶K(20mg/ml)輕輕混勻10min，37°C水浴過(guò)夜;然后分裝于2個(gè)管，分別加入等體積的Tris-HCl飽和酚：飽和酚：氯仿異戊醇(25:24:1)，氯仿抽提。加入2倍體積的無(wú)水乙醇-20C沉淀過(guò)夜后，14000r/