液相色譜質(zhì)譜分析課件

液相色譜質(zhì)譜分析一、液相色譜概述二、HPLC儀器構(gòu)成三、高效液相色譜法的類型及分離機(jī)理四、色譜分離方法的選擇五、質(zhì)譜儀主要內(nèi)容一、概述1）高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)10cm3·min-1.2）氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20％。對于占有機(jī)物總數(shù)近80％的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。高效液相色譜的優(yōu)點3）氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。

4）氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而高效液相色譜法則經(jīng)常可在室溫條件下工作。高效液相色譜的優(yōu)點2、液相色譜儀器

（highperformanceliquidchromatograph）液相色譜儀（1）液相色譜儀（2）液相色譜儀（4）LCQDecaXPMAX液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀2、

HPLC儀器組成：高壓輸液裝置→進(jìn)樣系統(tǒng)→分離系統(tǒng)→

檢測系統(tǒng)

流動相過濾與脫氣裝置流動相過濾裝置分為在線過濾和真空過濾流動相脫氣裝置分為在線真空脫氣和超聲波脫氣泵體材料耐腐蝕泵腔的體積要小，以便快速更換溶劑能在高壓下連續(xù)工作,耐壓40-50MPa.cm2壓力平穩(wěn)，無脈沖高壓輸液泵輸出流量穩(wěn)定，重復(fù)性高,輸出流量范圍寬(2)高壓輸液泵

梯度淋洗裝置

(內(nèi)梯度)(外梯度)梯度淋洗裝置等度洗脫與梯度洗脫梯度洗脫的特點改善分離,加快分析速度；改善峰形,減少拖尾;可能引起基線漂移分配比變化范圍寬的復(fù)雜樣品應(yīng)采取梯度洗脫方式分離(2)

進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣針六通閥

準(zhǔn)備狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)六通閥進(jìn)樣裝置(3)分離系統(tǒng)柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。色譜柱1．使用預(yù)柱保護(hù)分析柱(硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度)。2．大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2－7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍。3．避免流動相組成及極性的劇烈變化。4．流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理。5．如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應(yīng)在實驗完畢柱子沖洗干凈，并保存大乙腈中。6．壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號。色譜柱的使用和維護(hù)a.紫外檢測器

應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點：

靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。b.光電二極管陣列檢測器

紫外檢測器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。兩種檢測器的色譜圖(a)：可變波長紫外檢測器；(b)：二極管陣列檢測器類型主要分離機(jī)理主要分析對象或應(yīng)用領(lǐng)域吸附色譜吸附能，氫鍵異構(gòu)體分離、族分離，制備分配色譜疏水分配作用各種有機(jī)化合物的分離、分析與制備凝膠色譜溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測定離子交換色譜庫侖力無機(jī)離子、有機(jī)離子分析離子排斥色譜Donnan膜平衡有機(jī)酸、氨基酸、醇、醛分析離子對色譜疏水分配作用離子性物質(zhì)分析疏水作用色譜疏水分配作用蛋白質(zhì)分離與純化手性色譜立體效應(yīng)手性異構(gòu)體分離，藥物純化親和色譜生化特異親和力蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析三、高效液相色譜法的類型及分離機(jī)理2.分配色譜（液－液分配色譜）（1）原理

根據(jù)各待測物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動相的移動，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測物的遷移速率不同，從而實現(xiàn)分離的過程。分離原理K不僅與固定相的種類有關(guān)，也與流動相的種類有關(guān)固定相極性>流動相極性正相分配色譜組分極性越大，保留時間越長反相分配色譜固定相極性<流動相極性組分極性越小，保留時間越長（2）分類四、色譜分離方法的選擇五、質(zhì)譜儀1.質(zhì)譜分析法2.質(zhì)譜儀的結(jié)構(gòu)及工作原理3.質(zhì)譜圖及離子峰的主要類型

質(zhì)譜分析法（MassSpectrometry,MS）是在高真空系統(tǒng)中測定樣品的分子離子及碎片離子質(zhì)量，以確定樣品相對分子質(zhì)量及分子結(jié)構(gòu)的方法。化合物分子受到電子流沖擊后，形成的帶正電荷分子離子及碎片離子，按照其質(zhì)量m和電荷z的比值m/z（質(zhì)荷比）大小依次排列而被記錄下來的圖譜，稱為質(zhì)譜。1.質(zhì)譜分析法根據(jù)質(zhì)譜峰的質(zhì)荷比測定化合物的分子量，推測分子式及結(jié)構(gòu)式根據(jù)峰強(qiáng)度進(jìn)行定量分析2.質(zhì)譜儀的結(jié)構(gòu)（1）進(jìn)樣系統(tǒng)作用：將樣品分子引入到離子源中。蠕動泵連續(xù)進(jìn)樣六通閥直接進(jìn)樣色譜進(jìn)樣系統(tǒng)方式：(2)離子源作用：

1.將導(dǎo)入質(zhì)譜儀系統(tǒng)的樣品去溶劑化2.將離子源處的大氣壓與質(zhì)譜儀系統(tǒng)一級真空阻隔開3.被分析物離子化或?qū)⑷軇┲械碾x子轉(zhuǎn)化成氣相4.去除中性物質(zhì)和帶反極性電荷離子，否則會對分析產(chǎn)生干擾電噴霧電離源(ESI)多電荷離子測定的樣品分子量大(3)質(zhì)量分析器a單聚焦型磁分析器作用:是將不同碎片按質(zhì)荷比m/z分開。質(zhì)量分析器類型：磁分析器、飛行時間、四極桿、離子捕獲、離子回旋等。b四級桿分析器(4)檢測器電子倍增器示意圖質(zhì)譜儀常用的檢測器有法拉第杯(FaradayCup)、電子倍增器及閃爍計數(shù)器、照相底片等。陰極放大105-108倍特點：實現(xiàn)高靈敏度、快速測定.(5)真空系統(tǒng)作用：

1)消減離子的不必要碰撞，避免離子損失；2)避免離子－分子反應(yīng)改變裂解模式，使質(zhì)譜復(fù)雜化；3)減小本底。離子源質(zhì)量分析器真空度要求：}<10-4Pa機(jī)械泵擴(kuò)散泵真空泵{3.質(zhì)譜圖及離子峰的主要類型（1）質(zhì)譜圖質(zhì)譜圖是以質(zhì)荷比(m/z)為橫坐標(biāo)、相對強(qiáng)度為縱坐標(biāo)構(gòu)成，將原始質(zhì)譜圖上最強(qiáng)的離子峰定為基峰并定為相對強(qiáng)度100％，其他離子峰以對基峰的相對百分值表示。丙酮的質(zhì)譜圖（2）離子峰的主要類型分子在離子源中可產(chǎn)生各種電離，即同一分子可產(chǎn)生多種離子峰：分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、重排離子峰、亞穩(wěn)離子峰等。設(shè)有機(jī)化合物由A，B，C和D組成，當(dāng)蒸汽分子進(jìn)入離子源，受到電子轟擊可能發(fā)生下列過程而形成各種類型的離子：分子離子碎片離子重排裂解碰撞裂解（3）分子離子峰的特點

一般質(zhì)譜圖上質(zhì)荷比最大的峰為分子離子峰；有例外。形成分子離子需要的能量最低，一般約１０電子伏特。

質(zhì)譜圖上質(zhì)荷比最大的峰一定為分子離子峰嗎？如何確定分子離子峰？4.質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析（1）分子量確定根據(jù)分子離子峰質(zhì)荷比可確定分子量，通常分子離子峰位于質(zhì)譜圖最右邊，由于分子離子的穩(wěn)定性及重排等，質(zhì)譜圖上質(zhì)荷比最大的峰并不一定是分子子峰。那么，如何辯認(rèn)分子離子峰呢？a、利用化學(xué)結(jié)構(gòu)來判斷分子離子峰強(qiáng)度?！黝惢衔锓肿与x子峰穩(wěn)定性順序為：芳香環(huán)（芳香、雜環(huán)）>脂環(huán)>硫醚、硫酮>共軛烯烴>直鏈烷烴>酰胺>酮>醛>胺>脂>醚>羧酸>支鏈烴>腈>伯醇>叔醇>縮醛c、分子離子峰與鄰近峰的質(zhì)量差是否合理。

有機(jī)分子失去碎片大小是有規(guī)律的：如失去H、CH3、H2O、C2H5…，因而質(zhì)譜圖中可看到M-1，M-15，M-18，M-28等峰，而不可能出現(xiàn)M-3，M-14，M-24等峰，如出現(xiàn)這樣的峰，則該峰一定不是分子離子峰。質(zhì)量差為(4-13)、19-25、37、38、50-53、65-66…的不是分子離子峰，當(dāng)差值為14=CH2時應(yīng)小心，這表明可能有待測物的同系物存在。b、利用經(jīng)驗規(guī)律：——分子離子峰應(yīng)符合“氮律”在C、H、O組成的化合物中，分子離子峰的質(zhì)量數(shù)一定是偶數(shù)；在含C、H、O、N化合物中，含偶數(shù)個N的分子量為偶數(shù)，含奇數(shù)個N的分子量為奇數(shù)——不符合上述規(guī)律者必不是分子離子峰。通過改變儀器實驗條件來檢驗：

1）采用化學(xué)電離源、場離子或場解吸源等電離方法；2）制備易揮發(fā)的衍生物，如通過甲基化、乙酰基化、甲酯化、氧化或還原等方法將樣品制備成適當(dāng)?shù)难苌锖笤贉y定。3、結(jié)構(gòu)鑒定a)根據(jù)質(zhì)譜圖，找出分子離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、m/z、相對峰高等質(zhì)譜信息，根據(jù)各類化合物的裂解規(guī)律，重組整個分子結(jié)構(gòu)。b)采用與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對照的方法。

由質(zhì)譜數(shù)據(jù)推導(dǎo)有物機(jī)分子結(jié)構(gòu)的過程，形象地說，如同用彈弓擊碎一個瓷花瓶，再由一堆碎片來拼湊復(fù)原花瓶的過程。蜂膠素被譽(yù)為“紫色黃金”，集動植物之精華,具有復(fù)雜而獨特的化學(xué)組成。富含黃酮類和萜烯類物質(zhì)。黃酮是人體必需營養(yǎng)成份之一，體內(nèi)不能合成，但對調(diào)節(jié)生理功能，提高生命運動質(zhì)量有重要意義。而蜂膠中含有多種黃酮類物質(zhì)，因此對蜂膠產(chǎn)品的開發(fā)和使用有重要的社會意義。53實驗HLPC分離蜂膠中的黃酮類物質(zhì)儀器與試劑SURVEYOR液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國菲尼根公司)甲醇（色譜純）;水（高純水）;蘆丁,槲皮素,木犀草素,染料木素,高良姜素,姜黃素標(biāo)樣（分析純）