色譜分離技術(shù)課件

色譜分離技術(shù)制作：馬敏色譜分離原理及其相關(guān)參數(shù)吸附色譜離子交換色譜技術(shù)凝膠色譜技術(shù)親和色譜技術(shù)逆流色譜技術(shù)色譜分離技術(shù)又稱(chēng)層析分離技術(shù)或色層分離技術(shù)，是一種分離復(fù)雜混合物中各個(gè)組分的有效方法。它是利用不同物質(zhì)在由固定相和流動(dòng)相構(gòu)成的體系中具有不同的分配系數(shù)，當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)隨流動(dòng)相一起運(yùn)動(dòng)，并在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配，從而使各物質(zhì)達(dá)到分離。

與其他分離純化方法相比，色譜分離具有以下的優(yōu)點(diǎn)：分離效率高應(yīng)用范圍廣選擇性強(qiáng)在線(xiàn)檢測(cè)靈敏度高分離快速易于實(shí)現(xiàn)過(guò)程和自動(dòng)化操作色譜柱床有關(guān)參數(shù)

總柱床體積指膨脹后的基質(zhì)在色譜柱中所占的體積。

指基質(zhì)顆粒之間體積的總和；指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和；指基質(zhì)自身所具有的體積。

洗脫體積

指某一成分從柱頂?shù)降撞康南疵撘褐谐霈F(xiàn)濃度達(dá)到最大值時(shí)的流動(dòng)相體積。膨脹度

單位質(zhì)量的基質(zhì)充分溶脹后所占有的體積，即每克溶脹基質(zhì)所具有的床體積。一般親水性基質(zhì)的膨脹度比疏水性的基質(zhì)大。操作容量每克基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)或毫克數(shù)來(lái)表示。分配系數(shù)在平衡狀態(tài)下，組分在固定液與流動(dòng)相中的濃度之比，用K表示。遷移率指一組分在相同時(shí)間內(nèi)，在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相移動(dòng)和距離的比值，用表示。吸附色譜的三要素吸附介質(zhì)溶劑洗脫劑選擇吸附介質(zhì)需考慮的因素：

1.被分離物質(zhì)的特性

2.吸附介質(zhì)的容量

3.吸附介質(zhì)的通用性

4.吸附介質(zhì)的穩(wěn)定性

5.吸附介質(zhì)的剛性大孔吸附樹(shù)脂

大孔吸附樹(shù)脂是一類(lèi)不含交換基團(tuán)且有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹(shù)脂，具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，可以通過(guò)物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機(jī)物，是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的新型有機(jī)高聚物吸附劑，已在環(huán)保、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

大孔吸附樹(shù)脂的孔徑與比表面積都比較大，在樹(shù)脂內(nèi)部具有三維空間立體孔結(jié)構(gòu)，具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長(zhǎng)、宜于構(gòu)成閉路循環(huán)、節(jié)省費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn)。常用吸附劑的吸附力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?/p>

活性炭>氧化鋁>硅膠>氧化鎂>碳酸鈣>磷酸鈣>石膏>纖維素>淀粉和糖以活性炭的吸附力最強(qiáng)。吸附劑在使用前須先用加熱脫水等方法活化。大多數(shù)吸附劑遇水即鈍化，因此吸附色譜大多用于能溶于有機(jī)溶劑的有機(jī)化合物的分離，較少用于無(wú)機(jī)化合物。溶劑和洗脫劑

選擇時(shí)主要考慮的因素是對(duì)樣品的溶解度和穩(wěn)定度以及對(duì)監(jiān)測(cè)器不敏感性。一種好的溶劑應(yīng)該對(duì)樣品有很好的溶解性，有利于吸附介質(zhì)對(duì)溶質(zhì)的吸附；而洗脫劑則對(duì)被吸附在吸附劑上的樣品有強(qiáng)的及吸附能力，被洗脫的物質(zhì)則有較好的穩(wěn)定性，不發(fā)生聚合沉淀變性和相關(guān)的化學(xué)反應(yīng)，對(duì)光譜檢測(cè)器的波長(zhǎng)不敏感，對(duì)檢測(cè)器的導(dǎo)電性不敏感，對(duì)pH檢測(cè)器的酸堿度不敏感等。離子色譜分析法出現(xiàn)在20世紀(jì)70年代，80年代迅速發(fā)展起來(lái)，以無(wú)機(jī)、特別是無(wú)機(jī)陰離子混合物為主要分析對(duì)象。離子交換色譜利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。離子交換色譜的固定相一般為離子交換樹(shù)脂，樹(shù)脂分子結(jié)構(gòu)中存在許多可以電離的活性中心，待分離組分中的離子會(huì)與這些活性中心發(fā)生離子交換，形成離子交換平衡，從而在流動(dòng)相與固定相之間形成分配。固定相的固有離子與待分離組分中的離子之間相互爭(zhēng)奪固定相中的離子交換中心，并隨著流動(dòng)相的運(yùn)動(dòng)而運(yùn)動(dòng)，最終實(shí)現(xiàn)分離。離子交換色譜離子交換劑的分類(lèi)及性質(zhì)親水性離子交換劑基質(zhì)纖維素交聯(lián)葡聚糖交聯(lián)瓊脂糖疏水性離子交換劑基質(zhì)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂陰離子交換樹(shù)脂螯合離子交換樹(shù)脂（金屬離子）強(qiáng)、中、弱離子交換劑對(duì)溶液中不同離子具有不同的結(jié)合力，這種結(jié)合力的大小是由離子交換劑的選擇性決定的。離子交換劑的選擇可用其反應(yīng)的平衡常數(shù)表示。

如果在反應(yīng)液中的物質(zhì)的量濃度與的相等時(shí)，。若即表示離子交換劑對(duì)的結(jié)合力要比對(duì)的大；若即這表示其對(duì)和的結(jié)合力相同；若即表示其對(duì)的結(jié)合力比對(duì)的小。值是反映離子交換劑對(duì)不同離子的結(jié)合力或選擇性的參數(shù)，所以稱(chēng)值為離子交換劑對(duì)和的選擇系數(shù)。

洗脫液的收集離子交換劑的再生與保存

(1)再生劑常用HCl、NaCl、NaOH、乙醇等。(2)保存離子交換劑時(shí)要加防腐劑，如：氯已定（洗必泰），乙基硫柳汞（0.005％)，0.02％疊氮鈉

產(chǎn)品的濃縮、脫鹽

離子交換層析得到的樣品往往鹽濃度較高，而且體積較大，樣品濃度較低。所以一般離子交換層析得到的樣品要進(jìn)行濃縮、脫鹽處理。

以強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離K+和Na+為例：交換R-H++K+=R-K++H+

R-H++Na+=R-Na++H+

洗脫R-K++H+=R-H++K+R-Na++H+=R-H++Na+

離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離，例如，氨基酸自動(dòng)分析儀中的色譜柱，多肽的分離、蛋白質(zhì)的分離，核苷酸、核苷和各種堿基的分離等。凝膠色譜可以分離分子量不同的物質(zhì)大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時(shí)向下移動(dòng)的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，在向下移動(dòng)的過(guò)程中，從一個(gè)凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，所以小分子物質(zhì)的下移速度慢。凝膠色譜基本原理凝膠色譜分離原理示意圖P207Kd=0,對(duì)于完全不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部的大分子（全排阻）Kd=1,對(duì)于完全可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部的小分子（全滲透），凝膠顆粒內(nèi)部一部分空隙可被不同大小分子利用Kd1,表示凝膠具有一定的吸附作用洗脫峰體積是指被分離物質(zhì)通過(guò)凝膠柱所需洗脫液的體積。與分子量之間的關(guān)系在凝膠色譜過(guò)程中，一般情況下，凝膠色譜介質(zhì)對(duì)流動(dòng)相的組分無(wú)吸附作用，當(dāng)流動(dòng)相的體積流過(guò)后，上樣的所有組分都應(yīng)當(dāng)被洗脫出來(lái)，這是凝膠色譜與其他色譜不同之處。凝膠色譜介質(zhì)葡聚糖凝膠瓊脂糖-聚丙烯酰胺混合凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠凝膠色譜介質(zhì)葡聚糖凝膠瓊脂糖-聚丙烯酰胺混合凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠SephadexG交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephadex，不同規(guī)格型號(hào)的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠－P（Bio-GelP），由日本tosoh的TSKGEL的pw系列，適合蛋白和多糖的純化。Sepharose（瑞典，pharmacia），凝膠色譜法Bio-Gel-A（美國(guó)Bio-Rad）凝膠色譜技術(shù)的操作凝膠色譜介質(zhì)的選擇與處理

色譜柱和流動(dòng)相的選擇凝膠介質(zhì)的后處理凝膠色譜介質(zhì)的選擇與處理

凝膠的選擇

根據(jù)所需凝膠體積，估計(jì)所需干膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍。一般實(shí)驗(yàn)室分離蛋白質(zhì)采用100-200號(hào)篩目的的SephadexG-200效果好，脫鹽用SephadexG-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。凝膠的制備

商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時(shí)內(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時(shí)，自然膨脹需24小時(shí)至數(shù)天，而用加熱法在幾小時(shí)內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時(shí)間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣。色譜柱和流動(dòng)相的選擇

層析柱

是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量凝膠滲透色譜儀大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時(shí)應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。緩沖液選擇時(shí)應(yīng)考慮三方面的因素：考慮被分離物質(zhì)的穩(wěn)定性，包括緩沖液的pH、離子強(qiáng)度及保護(hù)劑等；考慮凝膠介質(zhì)的穩(wěn)定性能，不與介質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、不變形、不降解；考慮分離物質(zhì)的后處理，凝膠介質(zhì)的后處理樣品溶液的處理樣品溶液如有沉淀應(yīng)過(guò)濾或離心除去，如含脂類(lèi)可高速離心或通過(guò)SephadexG-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過(guò)4%，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4%（一般約0.5-2ml），進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床的10%，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可達(dá)凝膠床的20-30%。分級(jí)分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。

防止微生物的污染

交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類(lèi)物質(zhì)，防止微生物的生長(zhǎng)，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有：⑴疊氨（NaN3）⑵可樂(lè)酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]⑶乙基汞代巰基水楊酸鈉⑷苯基汞代鹽親和色譜也稱(chēng)為親和層析，是一種利用固定相的結(jié)合特性來(lái)分離分子的色譜方法。親和色譜分離的通常是混合在溶液中的物質(zhì)，比如細(xì)胞內(nèi)容物、培養(yǎng)基或血漿等。待分離的分子在通過(guò)色譜柱時(shí)被固定相或介質(zhì)上的基團(tuán)捕獲，而溶液中其他的物質(zhì)可以順利通過(guò)色譜柱。然后把固態(tài)的基質(zhì)取出后洗脫，目標(biāo)分子即刻被洗脫下來(lái)。如果分離的目的是去除溶液中某種分子，那么只要分子能與介質(zhì)結(jié)合即可，可以不必進(jìn)行洗脫。親和色譜技術(shù)親和色譜生物親和色譜擬生物親和色譜免疫親和色譜金屬離子親和色譜影響親和色譜的因素1、上樣體積2、柱長(zhǎng)3、流速4、溫度原理

逆流色譜是20世紀(jì)50年代源于多極萃取技術(shù)（非連續(xù)性）

但是多極萃取設(shè)備龐大復(fù)雜、易碎、溶劑體系容易乳化，溶劑耗量大，分離時(shí)間長(zhǎng)。逆流色譜技術(shù)通過(guò)公轉(zhuǎn)、自轉(zhuǎn)（同步行星式運(yùn)動(dòng)）產(chǎn)生的二維力場(chǎng)，保留兩相中的其中一相作為固定相通過(guò)高速旋轉(zhuǎn)提高兩相溶劑的萃取頻率，1000rpm旋轉(zhuǎn)時(shí)可達(dá)到17次/s頻率的萃取過(guò)程。

高速逆流色譜常用基本溶劑體系表

逆流色譜技術(shù)具有以下特點(diǎn)：應(yīng)用范圍廣，適應(yīng)性好

由于溶劑系統(tǒng)的組成及配比可以是無(wú)限多的，因而從理論上講可以適用于任何極性范圍內(nèi)樣品的分