世界衛(wèi)生組織《結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變目錄及其臨床應(yīng)用指南》解讀

世界衛(wèi)生組織《結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變目錄及其臨床應(yīng)用指南》解讀【摘要】耐藥結(jié)核病是我國(guó)面臨的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展促進(jìn)了耐藥結(jié)核病患者的早期診斷，但是不同耐藥相關(guān)基因突變類型結(jié)果的解讀成為分子耐藥診斷領(lǐng)域的首要挑戰(zhàn)。世界衛(wèi)生組織于2021年出版了《結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變目錄及其臨床應(yīng)用指南》，旨在規(guī)范結(jié)核分枝桿菌分子耐藥結(jié)果解讀，特別是對(duì)于基于二代測(cè)序技術(shù)獲得的結(jié)核分枝桿菌菌株獲得的突變信息進(jìn)行深入剖析，以期為臨床提供更準(zhǔn)確的耐藥檢測(cè)報(bào)告，也為耐藥結(jié)核分子診斷技術(shù)在我國(guó)的推廣使用奠定基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】

結(jié)核分枝桿菌；藥物敏感性試驗(yàn)；耐藥；高通量測(cè)序

2019年全球約140萬(wàn)人死于結(jié)核病（tuberculosis），約1000萬(wàn)人發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病，其中約50萬(wàn)活動(dòng)性結(jié)核患者對(duì)利福平（rifampin，RIF）耐藥，100萬(wàn)患者RIF敏感而異煙肼（isoniazid，INH）耐藥。因此，使用各種檢測(cè)工具迅速、準(zhǔn)確地檢測(cè)患者對(duì)這兩種藥物耐藥性，以盡快制定合適的治療方案至關(guān)重要［1］。傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)受限于結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，往往需要2～3個(gè)月才能獲得結(jié)果，無(wú)法滿足臨床對(duì)耐藥患者即時(shí)診斷的需求，也造成患者治療的延遲和潛在的耐藥結(jié)核傳播風(fēng)險(xiǎn)。隨著快速診斷工具的發(fā)展，尤其對(duì)RIF耐藥性的分子生物學(xué)檢測(cè)有了顯著改善，且儀器設(shè)備要求低、操作簡(jiǎn)便［2］。2012年，全球只有7%經(jīng)細(xì)菌學(xué)確診的結(jié)核病患者進(jìn)行了RIF耐藥性檢測(cè)，而到2019年有近61%進(jìn)行了檢測(cè)。但同期開始接受耐多藥或RIF耐藥結(jié)核病治療的人數(shù)從77321例增加到177099例，增加了近129%。因此，快速、準(zhǔn)確的耐藥性檢測(cè)在制定結(jié)核病治療方案時(shí)至關(guān)重要［1，3］。RIF耐藥性分子基礎(chǔ)主要是RIF耐藥決定區(qū)（rifampicinresistance-determiningregion，RRDR）的突變，其為一個(gè)81個(gè)堿基對(duì)片段［4］。發(fā)現(xiàn)并認(rèn)知此類耐藥性基因片段及新的分子工具的研究和開發(fā)，對(duì)于解決耐藥性檢測(cè)方案起到重要作用［5］。2020年世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization,WHO）建議對(duì)所有結(jié)核病患者的RIF和INH耐藥性進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，而對(duì)耐多藥患者常規(guī)進(jìn)行氟喹諾酮類藥物（fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）耐藥性檢測(cè)［5］。目前對(duì)INH和FQs的耐藥機(jī)制研究比較清楚，且已有相應(yīng)耐藥性檢測(cè)的商品化分子生物學(xué)檢測(cè)工具［6］，但這些藥物的基因型藥敏檢測(cè)（drug-susceptibilitytesting，DST）的敏感度低于RIF的敏感度，因此需額外的表型DST來(lái)檢測(cè)基因型DST遺漏的耐藥性［5］。在結(jié)核病藥物研發(fā)長(zhǎng)期停滯之后，多種新藥的陸續(xù)上市及現(xiàn)有抗菌藥物的再利用，使結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的治療方案有了巨大改進(jìn)。隨著抗結(jié)核新藥和舊藥新用在耐藥結(jié)核病治療的推廣應(yīng)用，耐藥性也隨之增加，因此急需快速檢測(cè)患者的耐藥情況，以選擇合適的藥物組合方案。然而，目前對(duì)這些藥物耐藥的分子機(jī)制仍然知之甚少，由于耐藥菌株整體數(shù)量較少，部分耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)及其與耐藥表型的相關(guān)性在不同研究得出的結(jié)果不盡相同［7］。對(duì)于這些新型耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)與耐藥表型結(jié)果的解讀將提升分子診斷技術(shù)在耐藥結(jié)核中的應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)，測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，二代及三代測(cè)序技術(shù)廣泛用于基因型DST，潛力巨大［7］。其中包括全基因組測(cè)序（whole-genomesequencing，WGS），測(cè)序?qū)ο鬄榕囵B(yǎng)的臨床分離株，若直接對(duì)臨床樣本檢測(cè)，可對(duì)所有遺傳物質(zhì)進(jìn)行測(cè)序，包括大量人類和其他共生生物的DNA。基于二代測(cè)序技術(shù)（next-generationsequencingtechnology，NGS）的基因型DST工具的開發(fā)和診斷效能評(píng)價(jià)，其主要限制是缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、覆蓋全面的基因突變及其與耐藥性關(guān)聯(lián)的分類，可供診斷工具開發(fā)者及臨床檢測(cè)人員使用。關(guān)于基因組中不同藥物耐藥性決定區(qū)域的數(shù)量、鑒別和臨床解釋，隨著該領(lǐng)域研究在持續(xù)更新，但耐藥性決定區(qū)的暫時(shí)不確定性，限制針對(duì)該區(qū)域檢測(cè)工具的開發(fā)，尤其是對(duì)于新藥和舊藥新用的藥物［2，8］。因此，急需準(zhǔn)確、全面的結(jié)核分枝桿菌表型耐藥相關(guān)基因突變目錄，以區(qū)分臨床耐藥變異與耐藥無(wú)關(guān)變異。鑒此，WHO在2021年出版了《結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變目錄及其臨床應(yīng)用指南》（以下簡(jiǎn)稱《指南》），以推進(jìn)新藥的基因型DST、表型DST、測(cè)序數(shù)據(jù)相互識(shí)別，并更好地理解與耐藥表型相關(guān)的突變?！吨改稀坊谝寻l(fā)表的數(shù)據(jù)，對(duì)迄今為止最大的多國(guó)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC）分離株（>38000）的WGS和表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用于從遺傳數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)臨床相關(guān)耐藥表型。該突變目錄解釋所有一線藥物［RIF、INH、乙胺丁醇（ethambutol，EMB）和吡嗪酰胺（pyrazinamide，PZA）］以及二線藥物［左氧氟沙星（levofloxacin，LFX）、莫西沙星（moxifloxacin，MFX）、貝達(dá)喹林（bedaquiline，BDQ）和利奈唑胺（linezolid，LZD）］、B組藥物［氯法齊明（clofazimine，CFZ）］、C組藥物［德拉馬尼（delamanid，DLM）、阿米卡星（amikacin，AMK）、鏈霉素（streptomycin，STM）、乙硫異煙胺（ethionamide，ETO）和丙硫異煙胺（protionamide，PTO）］的耐藥性提供了常見的標(biāo)準(zhǔn)化參考。

1高質(zhì)量的表型藥敏和基因序列數(shù)據(jù)是納入《指南》研究的首要因素1.1表型藥敏試驗(yàn)方法及基因測(cè)序結(jié)果解讀注意事項(xiàng)創(chuàng)建結(jié)核耐藥基因突變目錄的基礎(chǔ)為收集的數(shù)據(jù)，包括表型DST和培養(yǎng)的MTBC分離株的WGS，以下四個(gè)主要目錄組成要素至關(guān)重要：1.1.1高質(zhì)量表型DST確保采用最佳表型DST結(jié)果作為參考，由于結(jié)核桿菌表型DST方法優(yōu)劣及臨界濃度（criticalconcentrations，CCs）可能隨時(shí)間不斷變化。因此，對(duì)于具有多重表型DST結(jié)果的MTBC分離株，優(yōu)選當(dāng)前WHO推薦的表型DST方法，之前或非WHO推薦方法次之。新藥及舊藥新用類藥物使用微量肉湯稀釋法（brothmicrodilution，BMD）DST檢測(cè)數(shù)據(jù)較多，但WHO尚未推薦此方法及相應(yīng)解釋標(biāo)準(zhǔn)，因此，該方法僅能“暫定”用于基因突變與表型耐藥關(guān)聯(lián)。基于以上表型DST在應(yīng)用方面存在多種情況，兼顧WHO推薦的表型DST方法及文獻(xiàn)發(fā)表的數(shù)據(jù)，將表型DST結(jié)果的可信度類別分為4類（由《指南》自行定義，第1類為WHO當(dāng)前推薦的表型DST方法，第2類方法為WHO當(dāng)前和之前推薦的表型DST方法，第3類指其他表型DST方法，主要為BMD法，第4類為1～3類之外的其他表型DST方法），第1類（WHO當(dāng)前推薦）、第1和第2類（WHO當(dāng)前和之前推薦）和第1、第2及第3類（幾乎所有方法）的表型DST數(shù)據(jù)進(jìn)行了單獨(dú)的關(guān)聯(lián)分析［4，9-10］。見表1。許多MTBC分離株采用一種以上的DST方法獲得表型DST結(jié)果，在這些情況下，需制定一個(gè)表型DST優(yōu)先選擇的順序，只包括WHO最近推薦的表型DST數(shù)據(jù)。當(dāng)用同一分離株的一種藥物的不同方法獲得的表型DST結(jié)果都可用時(shí)，使用以下優(yōu)選規(guī)則：（1）1類>2類>3類。（2）在同一類別中，固體培養(yǎng)基法結(jié)果優(yōu)于液體培養(yǎng)基法結(jié)果，液體培養(yǎng)基更容易錯(cuò)過(guò)關(guān)鍵的、臨床相關(guān)的rpoB突變［11］。（3）在同一類別的液體方法中，分枝桿菌生長(zhǎng)培養(yǎng)系統(tǒng)（BACTECTMMycobacterialGrowthIndicatorTubeTM960，MGIT）>顯微鏡觀察下耐藥檢測(cè)方法（microscopicobservationdrug-susceptibilityassay，MODS）>BACTECTM460>CRyPTIC，但BACTECTM460不再使用，而MGIT比MODS有更多的試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證［12-13］。此類優(yōu)先選擇規(guī)則僅對(duì)同一菌株使用同一類別的表型DST方法檢測(cè)結(jié)果可信度進(jìn)行判斷時(shí)適用，可獲得標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)類型。

1.1.2高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化的WGS，用于生成無(wú)偏倚的原始序列數(shù)據(jù)本次分析僅包括使用Illumina儀器生成的WGS數(shù)據(jù)。該平臺(tái)是目前使用最廣泛的，并可提供標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)序數(shù)據(jù)，且以原始測(cè)序讀取數(shù)據(jù)的輸出文件作為生物信息學(xué)分析的起點(diǎn)。1.1.3用于變異檢測(cè)和注釋的標(biāo)準(zhǔn)化生物信息學(xué)通路為了確保在所有數(shù)據(jù)源中統(tǒng)一識(shí)別突變，使用標(biāo)準(zhǔn)化的生物信息通路去除非結(jié)核的數(shù)據(jù)，通過(guò)質(zhì)量檢查處理數(shù)據(jù)，將讀取數(shù)據(jù)與H37Rv參考基因組對(duì)比，最后識(shí)別突變。該通路的設(shè)計(jì)目的是最大限度地檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs）和插入/缺失的變異檢測(cè)，在此階段可排除<90%主要變異的耐藥分離株。1.1.4標(biāo)準(zhǔn)化的、有效的方法識(shí)別與耐藥性表型相關(guān)的變異對(duì)匹配的表型和基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行算法處理，以識(shí)別基因單突變，該突變可清楚地解釋觀察到的耐藥表型。然后對(duì)所有突變和表型的最終數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估，確定該變異與耐藥性的相關(guān)性的比值比（oddsratio，OR）和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。1.2不同抗結(jié)核藥物表型DST結(jié)果展示每個(gè)分離株的表型DST結(jié)果數(shù)量不同，其中4種一線藥物（RIF、INH、EMB和PZA）的結(jié)果最常見（見表2）。表中ALL數(shù)據(jù)集包括基于WHO認(rèn)可的方法（WHO數(shù)據(jù)集）和未經(jīng)WHO認(rèn)可方法的表型DST，后者以BDQ、CFZ、DLM和LZD為主，但對(duì)此類新藥或者舊藥新用藥物的耐藥率≤1.2%。除BDQ和DLM外，所有藥物的ALL數(shù)據(jù)集中的分離株均超過(guò)1萬(wàn)株，部分藥物的分離株超過(guò)3萬(wàn)株。對(duì)RIF和INH的耐藥率為24%～36%，而FQs為14%～20%，這個(gè)比率取決于藥物種類和數(shù)據(jù)來(lái)源。有超過(guò)15000株分離株評(píng)估PZA的耐藥性，其中14.6%通過(guò)WHO認(rèn)可的方法具有耐藥性。WHO數(shù)據(jù)集中的耐藥率從CFZ的0.6%到ETO的40.5%。而在ALL數(shù)據(jù)集中耐藥率范圍從BDQ的0.9%到INH的35.4%。

2基于循證醫(yī)學(xué)建立的結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變目錄對(duì)收集的所有MTBC分離株同時(shí)具有WGS數(shù)據(jù)和表型DST結(jié)果進(jìn)行了分析。不同藥物的突變基因預(yù)測(cè)表型DST結(jié)果，用敏感度、特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行區(qū)分（見表3）。三種指標(biāo)通過(guò)關(guān)聯(lián)水平（組1為耐藥性相關(guān)，組2為暫定耐藥性相關(guān)）以及綜合評(píng)價(jià)來(lái)表示，闡明不同基因突變對(duì)表型DST耐藥相關(guān)性的貢獻(xiàn)。預(yù)測(cè)表型DST耐藥結(jié)果的突變可能不夠全面準(zhǔn)確，因?yàn)閰⒖紭?biāo)準(zhǔn)不完善、藥物關(guān)鍵濃度隨著時(shí)間的變化、從數(shù)百個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室收集的表型DST數(shù)據(jù)時(shí)可能存在的一些問(wèn)題。此外，KAN和CAP僅供參考，此類藥物不再被推薦用于抗結(jié)核治療。對(duì)于大多數(shù)藥物來(lái)說(shuō)，組1和組2的突變組合的敏感度≥75%，特異度≥95%。組1中24個(gè)耐RIF突變的敏感度為92.3%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為95.6%，而組1中5個(gè)突變對(duì)INH的聯(lián)合敏感度為90.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為97.1%。組1中9個(gè)突變對(duì)MFX的敏感度為87.3%，14個(gè)突變對(duì)EMB的敏感度為86.3%。ALL數(shù)據(jù)集中很少有分離株對(duì)新藥和舊藥新用藥物有耐藥性，對(duì)這些藥物的耐藥性關(guān)聯(lián)還不明確。其中一些藥物的特異度低于預(yù)期，可能因表型參考或所使用的解釋標(biāo)準(zhǔn)有差異。組2中基因突變對(duì)大多數(shù)藥物的預(yù)測(cè)性能沒(méi)有較大影響，但使與PZA和ETO耐藥相關(guān)基因檢測(cè)的敏感度分別從56.8%、47.2%上升到72.3%、75.7%（為組1和組2耐藥相關(guān)基因檢測(cè)綜合敏感度）。耐藥性產(chǎn)生通常僅與幾個(gè)關(guān)鍵的突變相關(guān)，這一嘗試促進(jìn)了快速核酸擴(kuò)增檢測(cè)的發(fā)展，顯然，全面的分子DST-WGS將成為一種理想的新方法，可以覆蓋更多的基因。此外，盡管每個(gè)突變可能并不總是能導(dǎo)致表型DST結(jié)果為耐藥性，但多個(gè)突變的累積效應(yīng)可能會(huì)產(chǎn)生耐藥情況。隨著更多的數(shù)據(jù)和證據(jù)的驗(yàn)證，預(yù)計(jì)一些與暫定耐藥性相關(guān)的突變可能會(huì)轉(zhuǎn)移到第1組，一些意義不確定的突變可能被發(fā)現(xiàn)與耐藥性或者暫時(shí)耐藥性有關(guān)，推動(dòng)該領(lǐng)域進(jìn)一步發(fā)展。

3未來(lái)基因突變目錄的更新與修訂注意事項(xiàng)3.1分析的數(shù)據(jù)類型（1）當(dāng)前治療指南表明，耐INH和MFX水平顯著影響治療效果，例如高劑量INH可能用于單獨(dú)INH低水平耐藥治療，高水平耐藥突變的MFX不能使用高劑量MFX治療［5］。（2）應(yīng)評(píng)估所使用藥物的有效性，特別是當(dāng)抗生素的劑量發(fā)生改變［4］。（3）一些突變僅導(dǎo)致最小抑菌濃度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）值的適度增加，使用可信度類別表型DST進(jìn)行分類時(shí)比較困難，理想情況下，應(yīng)該分析個(gè)體突變模式，像歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)所定義的“技術(shù)不確定性領(lǐng)域”的突變類型，以盡量減少主要表型DST結(jié)果錯(cuò)誤［4，14-15］。（4）收集更大量、更合適的數(shù)據(jù)，盡量收集準(zhǔn)確測(cè)試方法和合理結(jié)果解釋的基因型數(shù)據(jù)，例如特定rrl突變導(dǎo)致LZD耐藥［7，16-17］。rpoBT427A雖然在RRDR中，但可能不產(chǎn)生RIF抗性［18］。3.2分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（1）鑒于幾個(gè)關(guān)鍵藥物（如BDQ和DLM）的耐藥基因與表型DST結(jié)果數(shù)據(jù)極少，放寬分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和（或）根據(jù)新的專家規(guī)則進(jìn)行分類，類似用于PZA和pncA耐藥性分析［7］。（2）需用其他方法來(lái)對(duì)補(bǔ)償機(jī)制進(jìn)行分類。（3）基因的選擇和相應(yīng)的調(diào)控區(qū)域必須根據(jù)最新的科學(xué)證據(jù)進(jìn)行修改。例如，Rv1979c在CFZ和BDQ耐藥性中的作用就受到了質(zhì)疑［7-8］。（4）同義突變與耐藥性無(wú)關(guān)，除非如終止起始密碼子發(fā)生在fabG1或Rv3793中，需進(jìn)行核查并根據(jù)研究結(jié)果，在以后的修訂版中可能會(huì)進(jìn)行不同的處理［19-20］，類似于核苷酸變化但未導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸發(fā)生改變的情況［16］。3.3生物信息學(xué)路徑（1）應(yīng)評(píng)估和研究具有不同耐藥性等位基因的分離株。（2）在當(dāng)前的算法中沒(méi)有識(shí)別出較大的插入序列，這導(dǎo)致一些突變錯(cuò)誤地出現(xiàn)為單突變，如ahpC啟動(dòng)子突變（如C-57T突變），同樣在目前的分析中沒(méi)有考慮到終止密碼子的消除。（3）探索數(shù)據(jù)篩選失敗的確切影響因素和對(duì)分析結(jié)果影響的程度。3.4如果發(fā)現(xiàn)耐藥性標(biāo)記，應(yīng)進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)（1）考慮表型DST的重現(xiàn)性、所使用的臨界點(diǎn)的準(zhǔn)確性和耐藥率。（2）一個(gè)突變是否導(dǎo)致MIC值接近臨界點(diǎn)。（3）根據(jù)專家共識(shí)或WHO之前對(duì)某些突變進(jìn)行分類，這可能是不正確的。例如，在ethA、gid、katG或pncA的實(shí)際終止密碼子之前的一個(gè)密碼子的無(wú)義突變不太可能產(chǎn)生耐藥性，這些例外可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)或結(jié)構(gòu)建模來(lái)確定［21］。4

展望基于分子診斷技術(shù)的耐藥結(jié)核病早期診斷對(duì)于有效控制結(jié)核病具有重要的意義。傳統(tǒng)基于分子信標(biāo)、反向雜交、熔解曲線等鑒定耐藥突變位點(diǎn)的分子診斷技術(shù)，通過(guò)對(duì)耐藥的高頻位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了對(duì)RIF、INH、FQs耐藥性的精準(zhǔn)早期檢測(cè)，目前在臨床中發(fā)揮了重要的作用［22］。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的普及，臨床可以在1～